Name: 에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법 Drosophila 애벌레 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 학습하세요 Drosophila 애벌레의 열 통각 반응을 평가하는 국소 및 전역 자극 방법을 통해 행동 반응을 정량화하고 통각 처리 메커니즘을 연구하는 기법을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 원고의 비판적 읽기를 위해 열 플레이트 분석, 플라이 주식에 대한 블루밍턴 Drosophila 증권 센터, Galko 연구소 회원 제안에 대한 애벌레 열 프로브 분석, 숀 스위니을 개발하기 위해 열 프로브 설계, 다니엘 Babcock위한 기독교 랜드리 감사드립니다. 이 작품은 MJG 및 연구 경력 (AVG)에 소수 액세스를위한 NIH MARC U-STAR 교육 그랜트 (휴스턴 - 다운 타운 학자 아카데미 대학 T34GM079088)에 NIH R01 NS069828에 의해 지원되었다.

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기에 설명된 assays는 질적 및 양적 유해 열 자극에 대한 반응에 대해 다른 genotypes의 유충을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 열 프로브 분석의 주요 기능은 자극은 단지 하나의 현장에서 주어진다는 것입니다. 이것은 아마도 아마도 유일한 작은 탐침으로 연락을 세그먼트에있는 클래스 IV 뉴런-것들의 집합과 바로 인접 세그먼트 11에서 이들의 발포로 안내합니다. 때문에 현지 자극, 열 프로브 분석은 지역과 같은 뜨거운 난로에 문의 손으로로서 특정 몸에 현지되는 유해 자극을 감지의 일반적인 감각 경험을 모방한 것이었 지요. ) I) 사용자가 유충에 프로브를 적용있는 압력, II 프로브의 정확한 위치 열 프로브 분석의 단점은 그것이 가능성이 세 가지 요소에 의한 것이 일부 사용자에 대한 사용자의 다양성을 가지고있다는 것입니다 기본 nociceptive 뉴런, 그리고, 3) 정확한 중앙에 상대적으로 유충에르 어떤 탐사선이 접점 유충의 표면에서. 우리는 이전에 주어진 온도를 1로 자신의 탈퇴 대기 시간을 기준으로 비 답장, 느린 조치 및 신속한 조치로 분류 애벌레의 양적 전략을보고했다. 여기에서 우리는 더 높은 온도에 애벌레 대응에 대한 리포트입니다. 흥미롭게도, 우리는 애벌레 열 nociceptive 답변에 천정이있다는 것을 발견하고이 천장 52 54 사이에 놓여 있다고 ° C. 이것은 일시적인 수용체 잠재적인 (TRP) 52보다 높은 온도에서 게이팅 수있는 채널 ° C를 소유하지 않는 애벌레 나타낼 수 또는 그것이 사용되는 뉴런이나 근육이 시작하거나 심지어 그들 aversive 탈퇴에서 작동하기 전에 운동 반응이 손상되어 수행하는 것이 좋습니다 수 있습니다. 우리는 또한 금단의 진폭의 다른 분석 반응을 이용하여 응답의 &quot;견고&quot;의 지표로서 롤의 숫자 중 하나를보고합니다. Naively 한이러한 매개 변수가 자극을 증가 온도 또​​는 시간으로 증가할 것이라고 기대합니다. 놀랍게도, 우리는이 사건 아닌 것을 알게됩니다. 애벌레는 유해 범위 (42 ℃)의 낮은 끝에 온도에서 긴 시간 동안 자극하는 것은 더 많은 롤을 보여 주며 더 많은 시간이 애벌레는 높은 온도 (48-52 ° C)에서 탐지보다 압연 보냈다. 이것은 유해 온도 창 안에 그것이 주로 응답의 진폭을 결정하는 노출의 기간입니다 것이 좋습니다. 애벌레는 매우 유해 온도에 노출되어 있기 때문에 (48-52 ° C) 매우 빠른 속도로 평균 반응, 그들은 시간의 긴 기간 동안 덜 유해 온도에 노출 애벌레 많은 롤스로 전시하지 않습니다.에게 여기에 보고된 응답 진폭의 분석은 다른 genotypes이나 환경 조작가를 비교할 수있는 더불어 또 다른 양적 차원을 추가합니다. 열 플레이트 분석의 주된 기능은 유해에 대한 글로벌 노출과 관련된 것입니다더위. 따라서 그것은 뜨거운 난로를 만져보다 가열 가마솥에 앉아 동물에 더 가깝다입니다. 유충이 글로벌 노출에 대한 행동 반응은 현지 자극에 따라 관찰하는 것보다 더 복잡 실험실에서, 야생에서 세계적으로 유해 자극을 경험할 수 있습니다했을 때 그것은 명확하지 않지만. 또 다른 3 언급 열 플레이트 분석의 강점은, 유충을 만지는 것은 프로토콜의 구성 요소가 아니므로 그것이 작은 사용자로 사용자의 다양성을 가지고있다는 것입니다. 유일한 상당한 편차는 각 행동 개시하고 이것이 반복 시청 / 친숙로 최소화할 수있을 때 정의하는 것으로 보인다. assays 사이에 흥미로운 차이는 aversive 동작이 시작되는 온도입니다. 이것은 열 프로브보다 열 플레이트 분석에서 훨씬 낮은 수 있습니다. 열 프로브 (머리와 꼬리 인상)으로 연락 애벌레가 전시 예비 동작 ° C 열 작은지면으로 ~ 27에서 관찰 헤드 록 음악의 한 형식으로 상관 관계를 수전자 분석. 그것은이 반응은 &#39;고통&#39;보다 더 &#39;불편&#39;을 반영하는 것이 가능합니다. 우리는 심지어 높은에서 압류를 흔든다의 상관 관계, 그리고 마비를 감찰하지 않은 (최대 48 ° C) 열 프로브 분석 기온 그리고 신체의 하나 이상의 지역에서 소성 감각 신경 세포의 중요한 대량임을있을 수 있습니다 이러한 행동을 가지고 필요했습니다. 그 세계 자극 로컬로 행동을 실행하는 데 충분하지가의 연결 응답 합산 포함됩니다 나타내는 열 프로브로 관찰 nociceptive 임계값의 하단 끝 아래 - 흥미롭게도, 발작과 마비 행동은 온도 (37 ° C ~ 34)에서 관찰된다 열 프로브의 응용. 이러한 온도 실제로 애벌레에 대한 유해으로 인식하고있는가 대부분의 경우하지 마비 동작을 시작하고 이후 플라이 음식을 복구하는 데 사용할 수 있습니다 애벌레는 (그림 5C) 살아남을 것을 관찰에 의해 지원됩니다. 또한 인수를 지원하는 그 열기 PL먹은 분석은 nociceptive 답변을 읽고있는 것은 잘 알려진 nociceptive 감각 뉴런에서 시냅스 전송을 차단하는 것이 관찰된 행동 (그림 6) 대부분의 대기 시간을 증가한다는 사실입니다. 높은 온도를 일으키는 행동을위한 대기 시간에는 증가가 없다는 것을 관찰 MD-Gal4을 표현하지 않는 감각 뉴런이 동작이 필요할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 글로벌 분석의 급속 가열 물 한 방울의 지역 분석 및 침수에 작은 금속 탐침의 핫 팁 - 요컨대, 두 assays는 정의된 온도의 유해 열 자극에 개별 애벌레를 노출하는 방식입니다. 유전 배경 및 / 변화 또는 환경 조건 (예 : 플러스 또는 마이너스 조직 손상에) 변화에 노출의 Drosophila의 유충의 행동 반응은, 공부하고 이러한 assays를 사용하여 계량하실 수 있습니다. 궁극적으로 이러한 assays 결과에서 우리가 더 NOC을 제어하는​​ 유전자 네트워크를 이해하는 데 도움이됩니다Drosophila 및 기타 관련 종의 iception.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 온도 프로브 </td><td> 프로 - 데브 공학 </td><td> 수요에 맞춤 건설한 </td><td> 연락처 정보는 요청시 제공될 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 드라이 바스 인큐베이터 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 11-718 </td><td> 한 고체 가열 블록 및 16mm 우물 1 개 가열 블록 </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA 컬러 카메라 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> 12730080 </td><td> 이와 동등한 카메라는 할 것입니다. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 현미경 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> MZ6 줌 몸에 부품 번호 (광학 캐리어)는 10445614입니다 </td><td></td></tr><tr><td> SCHOTT 에이스 Modulamp 단위 </td><td> SCHOTT 북미, 주식 회사 </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> SCHOTT 듀얼 거위 목처럼 생긴 것 23 인치 광섬유 라이트 가이드 </td><td> SCHOTT 북미, 주식 회사 </td><td> SCHOTT A08575 </td><td></td></tr><tr><td> 온도 제어 장치 </td><td> TSCI 사. </td><td> 사용자 정의가 내장 </td><td> 자세한 내용은 요청시 제공될 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 자이스 혈구 Stemi 2,000 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> NT55-605 </td><td> 이와 동등한 현미경할 것입니다. </td></tr><tr><td> 집게 </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm 메쉬 </td><td> Genesee 과학 </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> 화필 </td><td> 딕 Blick 미술 재료 </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> 자외선 crosslinker </td><td> 피셔 과학 </td><td> 1,199,289 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin 단지 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml의 비이커 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> 디에틸 에테르 </td><td> 피셔 과학 </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 X 10 밀리미터 폴리스티렌 페트리 접시 </td><td> 매 </td><td> 351,008 </td><td> 우리는 테스트하지 않았습니다 대안 요리. </td></tr><tr><td> 유리 현미경 슬라이드 </td><td> 코닝 </td><td> 26,003 </td><td></td></tr><tr><td> 열전대 </td><td> 오메가 엔지니어링 주식 회사 </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> 비닐 조각 </td><td> 오피스 디포 </td><td> 480,009 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge 관 </td><td> Denville 과학주식 회사 </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

에서 열 nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법<em&gt; drosophila</em&gt; 애벌레

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

이 문서에서는 Drosophila의 애벌레에서 열 nociception 공부를 assays를 보여줍니다. 두 번째는 대부분의 도매 (전역) 활성화 또는 이러한 모든 뉴런 3을 포함하면서 한 분석은 열 nociceptors 1,2의 (로컬) spatially - 제한 자극을 포함한다. 함께 이러한 기법은 Drosophila nociceptive 감각 뉴런의 행동 기능의 시각화 및 부량을 허용합니다. Drosophila의 유충은 온도 nociception, evolutionarily 종의 1,2 걸쳐 보존되고 잠재적으로 유해한 온도 감각 반응을 연구하기 위해 설립 모델 시스템입니다. 이러한 연구 Drosophila의 장점은 respons, 모든 metazoans에서와 같이, 그 신경계의 상대적인 단순 성과 Drosophila에서 근본적인 생물학 4-6의 분자 기초를 해부하는 데 사용할 수있는 유전자 기술의 고도화이다유해 열 자극에 전자는 일반적으로 제시 자극 7 &quot;nocifensive&quot;aversive 탈퇴 관련이 있습니다. 이러한 자극은 무료 신경 엔딩이나 nociceptors 통해 감지하고 organismal 응답의 진폭은 유해 자극에게 8을받은 nociceptors의 숫자에 달려있다. Drosophila에서는 photoreceptors 10들은 최근에 발견된 역할 이외에 유해 열 및 기계적 자극에 9 감지 클래스 IV의 돌기를 arborization 감각 뉴런이다. 잘 발달 수준에서 연구되어 이들 뉴런은 장벽 표피 시트 위에 arborize과 11,12 거의 모든 상피 세포와 연락처를 확인하십시오. 그들은 두 번째 순서 뉴런에 연결할 수있는 중추 신경계 11 복부 신경 코드로 각 클래스 IV 뉴런 프로젝트의 단일 축삭 그 뇌로 프로젝트. 기준 조건 하에서 nociceptive 감각 신경상대적으로 높은 임계값에 도달할 때까지 NS는 해고되지 않습니다. 여기에 설명된 assays는 조사가 기준선 행동 반응이나, 아마도, 다음과 같은 조직의 손상을 ensues sensitization.를 정할 수 있습니다 각 분석은 유해 열 자극에 뚜렷한하지만 관련 locomotory 행동 반응을 유발하고 Drosophila의 애벌레에 열 nociception의 다양한 측면을 시각화하고 수치 연구자를 허용합니다. assays는 원하는 genotypes의 유충이나 nociception에 영향을 미칠 수도 서로 다른 환경 조건 하에서 사육 유충에 적용할 수 있습니다. 열 nociception는 수종에 걸쳐 보존되어 있기 때문에, Drosophila의 유전자 해부에서 gleaned 결과 가능성이 척추 동물 등 다른 생물에서 열 nociception 우리의 이해를 통지합니다.

이 문서에서 우리는 assays가 열 nociception 공부를 입증<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레. 한 분석은 열 nociceptors의 (로컬) spatially - 제한 자극을 포함<sup&gt; 1,2</sup&gt; 반면 두 번째는 대부분의 도매 (전역) 활성화 또는 이러한 모든 뉴런을 포함<sup&gt; 3</sup&gt;. 함께 이러한 기술의 행동 기능의 시각화 및 부량을 허용<em&gt; Drosophila</em&gt; nociceptive 감각 뉴런.

에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

본 논문에서 우리는 초파리 유충의 열성 통각을 연구하기 위한 분석법을 제시합니다. 한 가지 분석법은 ...의 공간적 제한(국소적) 자극을 포함합니다.

다음 실험의 전체적인 목적은 초파리 유충의 열 통각 수용을 분석하는 것입니다. 이는 초파리 유충을 채집한 후, 선택적인 두 번째 단계로 유해한 열 자극에 노출시킴으로써 이루어집니다. 유충에 UV 조사를 실시하여 조직 손상 및 열 통각 과민성을 유도할 수 있습니다. 다음으로, 정량적으로 측정 가능한 통각 반응을 유도하기 위해 열 프로브를 사용하여 국소적으로 자극하거나 가열판을 사용하여 전신적으로 자극할 수 있습니다.열 프로브를 통해 유충이 열에 대한 통각 수용 반응의 한계점을 가지고 있으며, 입력 온도와 유도된 반응의 진폭 사이에 놀라운 관계가 있음이 확인되었습니다. 열판 분석에서는 유충이 주변 물의 온도와 통각 수용 감각 뉴런의 활성에 따라 정형화된 통각 수용 행동 시퀀스를 보인다는 점이 나타납니다. 본 연구에서 설명하는 방법들은 동물이 국소적으로 또는 전신적으로 제시되는 유해한 열 자극에 대해 서로 다르게 반응하는지 등 열 통각 수용 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로 열 프로브 분석(heat probe assay)을 처음 접하는 연구자는 가해지는 프로브의 압력, 위치, 도입 각도의 편차를 최소화하기 위한 숙련 과정이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 온도 상승에 따라 유도되는 행동을 직접 확인해야 가장 정확하게 이해할 수 있으므로, 열 플레이트 분석의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 관심 있는 특정 유전형의 자손 유충을 충분히 확보하려면, 원하는 계통을 직접 배양하거나 알 부화 5일 후 20~30마리의 처녀 암컷과 15~20마리의 수컷을 초파리 배지가 들어있는 병에 넣어 교배를 유도하십시오. 3령 초기 유충을 수확하려면 무른 배지를 걷어내고 630 micron 공극 크기의 메쉬를 사용하여 흐르는 물에 부드럽게 걸러 세척하십시오. 이후 3령 초기 유충을 작고 습한 배지 패드로 옮겨 굶주림과 건조를 방지하십시오.마취 챔버를 제작한 후, 포셉이나 붓을 사용하여 3령 초기 유충 10마리를 뚜껑 안쪽에 조심스럽게 배치하고 닫습니다. 흄 후드 내에서, 1.5 mL의 diethyl ether에 적신 솜 뭉치가 담긴 10 mL 비커가 들어 있는 커플링 자(coupling jar) 안에 마취 챔버를 넣습니다. 커플링 자의 캡을 돌려 잠그고 유충을 2~2.5분 동안 ether 증기에 노출시킵니다.마취 후, Coplan jar에서 마취 챔버를 꺼내고 후드 내에서 잔류 에테르 증기가 사라질 때까지 몇 초간 둡니다. 분무기로 마취 챔버의 유충을 작은 페트리 접시로 조심스럽게 헹구어 옮깁니다. 마취된 유충의 물기를 닦아낸 후, 3인치 x 1인치 유리 현미경 슬라이드에 부착된 양면 테이프 위에 유충의 등 쪽이 위로 향하도록 조심스럽게 고정합니다.슬라이드를 UV 조사 챔버의 바닥면에 놓고, 20 millijoules per centimeter squared 강도로 6초 동안 유충에 UV 광선을 조사합니다. 조사 후, 슬라이드를 물에 담가 양면 스카치테이프에서 유충이 부드럽게 떠오르게 합니다. 핀셋이나 붓을 사용하여 조사된 유충을 15 by 45 millimeter 용기에 조심스럽게 옮깁니다.재숙주시키기 전, 25 °C 또는 원하는 배양 온도에서 8~24시간 동안 회복시키기 위해 1 mL의 초파리 먹이가 들어 있는 1 dram 유리 배양 바이알을 준비합니다. 열 통각 분석의 경우, 먼저 열 프로브의 온도를 원하는 설정값으로 미리 설정합니다. 붓이나 핀셋을 사용하여 개별 유충을 평평한 플랫폼 위로 조심스럽게 옮기며, 이때 유충이 얇은 수막으로 덮여 있는지 확인합니다.압력 변동을 최소화하고 열 프로브의 정확한 위치와 각도를 확보하기 위해서는 충분한 연습이 필요합니다. 프로브 팁을 유충의 A4 분절에 부드럽게 대고, 프로브와 유충 표면이 약 45도 각도가 되도록 가벼운 압력을 가하십시오. 이 정도의 압력은 유충 표면에 약간의 함몰을 일으켜야 하며, 일반적으로 유충의 이동을 방지하기에 충분한 수준입니다.회피 반응이 나타나거나 22번째 컷오프 지점에 도달할 때까지 유충에 계속 자극을 줍니다. 반응하는 유충은 일반적으로 먼저 머리와 꼬리를 들어 올리는 예비 행동을 보인 후, 최소 360도 회전하는 회피 행동을 보입니다. 회피 행동이 시작되면 프로브와의 접촉을 해제하고, 회피까지 걸린 잠복기 또는 시간을 기록합니다.20초 이내에 회피 반응이 관찰되지 않으면 해당 유충은 무반응군으로 간주합니다. 충분한 고대비 조명이 확보될 수 있도록 광섬유 라이트 가이드를 배치하십시오. 유충을 관찰하려면 가열 블록의 평평한 면이 위로 향하게 하여 가열 플레이트에 넣은 다음, 가열 플레이트를 현미경 베이스 위에 올리십시오.가열판을 고온 설정으로 켜고 온도가 95 °C에서 안정될 때까지 약 15분 동안 기다립니다. 마이크로 피펫을 사용하여 증류수 80 µL를 측정하고, 60 x 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시 중앙에 물방울을 떨어뜨립니다. 포셉을 사용하여 깨끗한 3령 중기 유충을 물방울 중앙에 조심스럽게 놓으며, 이때 추가적인 물이 최대한 섞이지 않도록 합니다.페트리 접시를 가열판 위의 고체 가열 블록 위에 조심스럽게 놓습니다. 유충 전체와 물방울이 시야에 들어오도록 접시의 위치를 빠르게 조정합니다. 타이머를 시작합니다.현재, 페트리 접시를 핫플레이트의 고체 가열 블록 위에 놓고 각 행동이 시작되는 시간을 기록합니다. 다섯째, 물에 잠긴 유충을 핫플레이트로 옮기면 정형화된 운동 행동이 관찰됩니다. 열이 없는 상태에서의 정상적인 행동은 머리를 움직여 탐색하는 동작을 동반한 파라솔 운동(parasol locomotion)을 포함합니다.다음으로는 유충이 머리를 앞쪽이나 옆쪽으로 빠르게 움직이는 헤드 스래시(Head thrash) 행동이 나타날 수 있습니다. 이 움직임은 물속에서의 일반적인 이동 방식과 유사하지만, 더 급격하게 발생하며 지속적으로 구르는 특성이 있습니다. 유충이 측면으로 최소 360도 이상 완전히 구를 때 이러한 행동이 발생하는 것으로 간주합니다.이 동작은 가변적인 횟수로 발생할 수 있으며, 때로는 불완전한 회전이 포함되기도 합니다. 행동 점수를 매길 때는 360도 전체 회전만 계산하십시오. 이 행동은 채찍질 행동(whip behavior) 중에 열 프로브를 국소적으로 적용했을 때의 장면과 가장 유사합니다.유충은 전후축을 따라 머리가 꼬리에 매우 짧게 접근하는 빠른 수축 및 이완 운동을 보입니다. 채찍질 동작은 종종 굴러가기 동작과 동시에 또는 빠르게 연달아 관찰됩니다. 마지막으로, 유충은 발작 행동을 보이며 이는 종종 마비로 이어집니다. 발작 행동 동안 유충은 전후축을 따라 몸을 쭉 펴고 높은 빈도의 전신 떨림을 보입니다.굽힘 마비 없는 떨림 행동은 유충이 움직임을 멈출 때 발생합니다. 일부 유충에서는 이것이 영구적으로 지속되는 반면, 다른 유충들은 이후 저주파 맥동 운동을 보입니다. 각 범주에 속하는 반응 유충의 백분율을 나타낸 이 도표에서 유충의 열성 통각 수용 반응에는 한계점이 존재합니다. 열 프로브 분석에서 유충의 100%는 프로브 온도가 52 °C에 도달할 때까지 빠른 반응을 보입니다.하지만 54 °C 이상의 온도에서는 20초 동안 접촉한 후에도 90% 이상의 유충이 반응하지 않습니다. 이러한 유충들은 22번째 컷오프 이후에도 계속해서 움직이지만, 구르는 횟수나 혐오 회피 행동에 소요된 시간을 측정하여 도표로 나타낼 수 있습니다. 놀랍게도, 프로브 입력 온도가 낮을수록 더 많은 횟수의 구름 반응을 유도하는 것으로 보여, 입력 온도와 반응의 강도 사이에 역관계가 있는 것으로 나타납니다.물에 담긴 유충을 가열판으로 옮기면 다섯 가지의 정형화된 운동 행동이 관찰됩니다. 이러한 행동이 관찰되는 평균 잠복기와 본 연구에서 제시한 최적의 분석 조건 하에서 각 잠복기마다 측정된 평균 물방울 온도가 여기에 표시되어 있습니다. 각 개별 행동을 보이는 유충의 비율은 77%에서 100% 사이였으나, 때때로 구르기(rolling) 및 휘젓기(whipping) 행동이 생략되거나 중첩되거나 또는 역순으로 발생하기도 했습니다. 가열판 분석에서 마비 행동이 시작된 후 생존한 유충의 비율이 여기에 표시되어 있습니다. 유충은 마비 상태가 될 때까지 가열한 후, 회복을 위해 표준 배양 조건으로 옮겨졌습니다.모의 처리된 유충은 열 노출을 제외하고 동일한 처리를 받았으며, 생존한 성충에서 PPE의 형성은 7일째부터 13일째까지 정량적으로 분석되었습니다. 여기서, MD G four는 4가지 클래스의 다수지성 말초 감각 뉴런 모두에서 UAS 조절 트랜스유전자의 발현을 유도합니다. UAS or one delta C는 시냅스 전달에 필요한 초파리 개방형 정류 칼륨 채널의 변형 버전을 발현하며, UAS orrc one delta NC는 시냅스 전달을 방해하지 않는 동일 채널의 추가 변형 버전을 발현합니다.MD GALF 4 드라이버와 UAS ORC 1 delta C 트랜스진을 모두 보유한 유충만이 관찰된 5가지 행동 중 4가지에서 잠복기가 증가했다는 점에 유의하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 유해한 열 자극에 대한 GE 유충의 국소적 및 전신적 반응을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 절차는 유전자 분석과 같은 다른 방법과 결합하여 열성 통각 수용에 필요한 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 열 프로브 분석을 시도할 때는 프로브의 압력, 위치 및 접촉 각도의 편차를 최소화하는 것이 중요함을 기억하십시오.

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기서는, 쥐가이나 쥐가 nocifensive 동작 표시되는 최저 온도를 결정하는 빠른 안정적이고 간단한 절차를...

당뇨병 쥐의 열전달 Nociceptive 본부 신속한 결정

초파리 유충은 잠재적으로 해로운 열 자극에 대한 반응이 동물의 혐오적 또는 소위 "통각" 행동을 유발하는 전용 감각 뉴런(통각 수용기)을 가지고 있습니다. 이 비디오는 열 프로브를 큐티클에 국부적으로 적용한 것에 대한 반응으로 유충 행동을 기록하여 열 통각을 평가하는 방법을 설명합니다. 따라서 이 방법을 국소 열 프로브 분석이라고 합니다.

국소 열 프로브 분석: 초파리 유충의 고온 통각을 평가하는 방법

초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다.

제거<em&gt; 초파리</em감각 뉴런과 표피 세포의 면역 형광 분석을위한 애벌레 필렛에서&gt; 근육 조직

여기에서 우리는 초파리 유충의 차가운 통각을 연구하는 새로운 분석을 보여줍니다. 이 분석은 초점 유해 냉 자극을인가 할 수있는 맞춤식 펠티에 프로브를 이용하여 정량화하고 초기 특정 행동을 초래한다. 이 기술은 차가운 통각의 추가 세포 및 분자 해부를 허용합니다.

콜드 통각에 대한 소설 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

여기, 우리는 연속 열 그라디언트를 사용 하 여 초파리 애벌레의 기본 환경 온도 결정 하는 프로토콜 제시.

초파리 애벌레의 열 환경 설정을 결정 하는 온도 분석 결과

여기 우리는 자동으로 시간과 공간에 신속 하 고 정확한 온도 변화를 생성 하는 프로그래밍 가능 온도 제어 경기장을 사용 하 여 온도 변화에 초파리 의 운동 성능을 결정 하는 프로토콜을 제시.

시간과 공간에서 온도 변화에 대 한 응답에서 초파리 의 성능을 결정 하는 자동화 된 방법

열 제한은 급속한 기후 변화에 직면하여 중요한 정보인 유기체가 견딜 수 있는 환경을 예측할 수 있습니다. 여기에 설명된 곤충의 중요한 열 미니마 및 열 녹다운 시간을 평가하는 고처리량 프로토콜이 있습니다. 두 프로토콜 모두 처리량을 최대화하고 분석 비용을 최소화합니다.

곤충의 중요한 열 한계에 대한 높은 처리량 해석

이 프로토콜의 목표는 Drosophila 애벌레에서 기계적 고치에 대한 향상된 분석법을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 우리는 기계적 과민성 (알로디니아 및 과민증)이 Drosophila 애벌레에 존재한다는 것을 보여주기 위하여 여기에서 분석기를 이용합니다.

드로소필라 애벌레의 기계적 고치절 측정을 위한 향상된 분석 및 도구

유아는 구두로 자신의 경험을보고 수 없기 때문에 유아의 고통의 평가 및 치료 어렵습니다. 이 비디오에서 우리는 양적 electrophysiological 방법과 유아의 신경 시스템에서 유해 이벤트에 대한 응답을 측정하는 데 사용할 수있는 분석 기법을 설명합니다.

Electrophysiological 측정과 인간 유아의 Nociception 분석

Drosophila melanogaster은 한 세기 이상에서 많은 중요한 생물 학적 과정의 분자 및 세포 기초를 이해하기 위해 사용되었습니다 유전자와 behaviorally 다루기 쉬운 모델 시스템이다. Drosophila 잘 플라이 행동의 유전적 기초에 대한 통찰력을 얻기 위해 악용되었습니다.

분석의 방법 Drosophila 행동

학습하세요 Drosophila 애벌레의 열 통각 반응을 평가하는 국소 및 전역 자극 방법을 통해 행동 반응을 정량화하고 통각 처리 메커니즘을 연구하는 기법을 익히세요.

에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법

더 많은 동영상 탐색