에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법 Drosophila 애벌레

다음 실험의 전반적인 목표는 초파리 유충의 열성 통각 수용을 측정하는 것입니다. 이는 초파리 유충을 채집한 후, 선택적인 두 번째 단계로 유해한 열 자극에 노출시킴으로써 수행됩니다. 유충에 UV 조사를 실시할 수 있으며, 이는 조직 손상과 열성 통각 예민화를 유발합니다. 다음으로, 통각 반응을 유도하여 정량적으로 측정하기 위해 열 프로브를 이용해 국소적으로 자극하거나 가열판을 이용해 전신적으로 자극할 수 있습니다.

열 프로브(heat probe) 결과, 유충은 열에 대한 통각 반응의 한계치가 있으며, 입력 온도와 유발된 반응의 진폭 사이에 놀라운 상관관계가 있음이 나타났습니다. 열 플레이트 분석(heat plate assay)에서는 유충이 주변 물의 온도와 통각 sensory 뉴런의 활성에 따라 정형화된 일련의 통각 행동을 보인다는 것이 확인되었습니다. 본 문서에서 설명하는 방법들은 동물들이 국소적 또는 전신적으로 제시된 유해 열 자극에 서로 다르게 반응하는지와 같은 열 통각 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

일반적으로 열 프로브 분석(heat probe assay)을 처음 접하는 연구자들은 압력, 위치, 프로브의 적용 각도에서 발생하는 편차를 최소화하기 위해 숙련된 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 온도 상승에 따라 유도되는 행동들을 직접 확인해야 가장 잘 이해할 수 있으므로, 열 플레이트 분석의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 관심 있는 특정 유전형의 자손 유충을 충분히 확보하려면, 원하는 계통을 직접 배양하거나 알을 낳은 지 5일 후에 처녀 암컷 20~30마리와 수컷 15~20마리를 이용하여 파리 먹이가 들어 있는 병에 교배를 설정하십시오. 3령 초기 유충을 수집하고 세척하려면, 뭉글뭉글한 파리 먹이를 걷어내고 630 micron 공극 크기의 메쉬를 통해 흐르는 물로 부드럽게 걸러내십시오. 굶주림과 건조를 방지하기 위해 3령 초기 유충을 작고 습한 먹이 패드로 옮기십시오.

마취 챔버를 제작한 후, 핀셋이나 붓을 사용하여 3령 초기 유충 10마리를 뚜껑 안쪽을 따라 조심스럽게 배치하고 닫습니다. 흄 후드 내에서, 1.5 mL의 디에틸 에테르(diethyl ether)를 적신 솜 뭉치가 담긴 10 mL 비커가 들어 있는 커플링 자(coupling jar) 안에 마취 챔버를 넣습니다. 커플링 자의 캡을 돌려 잠근 후 유충을 2~2.5분 동안 에테르 증기에 노출시킵니다.

마취 후, Coplan 용기에서 마취 챔버를 꺼내 후드 내에서 잔류 에테르 증기가 소산될 때까지 몇 초간 둡니다. 분무병을 사용하여 마취 챔버 내의 유충을 작은 페트리 접시로 부드럽게 헹구어 옮깁니다. 마취된 유충의 물기를 닦아낸 후, 3인치 x 1인치 유리 현미경 슬라이드에 부착된 양면 테이프 위에 유충의 등 쪽이 위로 향하도록 조심스럽게 고정합니다.

슬라이드를 UV 조사 챔버의 바닥면에 놓고 20 millijoules per centimeter squared 강도로 6초 동안 유충에 UV 광선을 조사합니다. 조사 후, 슬라이드를 물에 담가 양면 스카치테이프에서 유충이 부드럽게 떠오르게 합니다. 핀셋이나 붓을 사용하여 조사된 유충을 15 by 45 millimeter 용기에 조심스럽게 옮깁니다.

재숙주시키기 전 25 °C 또는 원하는 배양 온도에서 8~24시간 동안 회복시키기 위해 1 mL의 초파리 먹이가 담긴 1 dram 유리 배양 바이알을 준비합니다. 열성 통각 분석을 위해 먼저 열 프로브의 온도를 원하는 설정값으로 미리 설정합니다. 붓이나 핀셋을 사용하여 개별 유충을 평평한 플랫폼 위로 조심스럽게 옮기고, 이때 유충이 얇은 수막으로 덮이도록 합니다.

압력의 편차를 최소화하고 열 프로브의 정확한 위치와 각도를 확보하기 위해서는 충분한 연습이 필요합니다. 프로브 팁을 분절 A4에 위치한 유충에 대고, 프로브와 유충 표면이 약 45도 각도가 되도록 가볍게 압력을 가하며 누릅니다. 이때 가해지는 압력은 유충 표면에 약간의 자국을 남길 정도여야 하며, 일반적으로 유충의 움직임을 방지하기에 충분한 수준이어야 합니다.

유충이 회피 반응을 보이거나 22번째 컷오프(cutoff)에 도달할 때까지 자극을 계속하십시오. 반응하는 유충은 일반적으로 머리와 꼬리를 들어 올리는 예비 행동을 먼저 보인 후, 최소 360도 회전하는 회피 행동을 보입니다. 회피 행동이 시작되면 프로브와의 접촉을 풀고, 회피까지 걸린 잠복기 또는 시간을 기록하십시오.

20초 이내에 회피 행동이 관찰되지 않으면 해당 유충은 무반응군으로 간주합니다. 충분한 고대비 조명이 확보되도록 광섬유 라이트 가이드를 배치하십시오. 유충을 관찰하려면 가열 블록의 평평한 면이 위로 오도록 히팅 플레이트에 넣은 후, 히팅 플레이트를 현미경 베이스 위에 올리십시오.

가열판을 고온 설정으로 켜고 온도가 95 °C에서 안정될 때까지 약 15분 동안 기다립니다. 마이크로 피펫을 사용하여 증류수 80 µL를 측정하고, 이를 60 x 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시 중앙에 떨어뜨립니다. 핀셋을 사용하여 깨끗한 3령 중기 유충을 물방울 중앙에 조심스럽게 놓으며, 이때 추가적인 물이 최대한 들어가지 않도록 합니다.

페트리 접시를 가열판 위의 고체 가열 블록 위에 조심스럽게 올립니다. 유충 전체와 물방울이 시야에 들어오도록 접시의 위치를 빠르게 조정합니다. 타이머를 시작합니다.

현재, 페트리 접시를 가열판의 고체 가열 블록 위에 올려놓고 각 행동이 시작되는 시간을 기록합니다. 다섯째, 물에 잠긴 유충을 가열판으로 옮기면 정형화된 이동 행동이 관찰됩니다. 열이 없는 상태에서의 정상적인 행동은 탐색을 위한 머리 움직임이 동반된 파라솔 이동(parasol locomotion)을 포함합니다.

다음으로 유충이 머리를 앞쪽 또는 측면으로 빠르게 움직이는 헤드 쓰래시(head thrash) 행동이 나타날 수 있습니다. 이러한 움직임은 물속에서의 일반적인 이동 방식과 유사하지만, 더 급격하고 지속적인 회전 동작으로 나타납니다. 유충이 측면으로 최소 360도 전체 회전할 때 이 행동이 발생하는 것으로 간주합니다.

이는 가변적인 횟수로 발생할 수 있으며 때로는 불완전한 회전이 포함되기도 합니다. 행동 점수를 매길 때는 360도 완전한 회전만 계산하십시오. 이 행동은 채찍질 행동 중 열 프로브를 국소적으로 적용했을 때의 장면과 가장 유사합니다.

유충은 머리가 꼬리에 아주 짧게 근접하게 되는 전후축을 따른 빠른 수축 및 이완 운동을 보입니다. 휘젓기(whipping) 동작은 종종 빠르게 연속적으로 또는 구르기(rolling)와 동시에 관찰됩니다. 마지막으로, 유충은 발작 행동을 보이며 이는 흔히 마비로 이어집니다. 발작 행동 동안 유충은 전후축을 따라 몸을 쭉 뻗으며 고빈도의 전신 떨림을 보입니다.

구부러짐 마비 없는 떨림 행동은 유충이 움직임을 멈출 때 발생합니다. 일부 유충에서는 이것이 영구적으로 지속되는 반면, 다른 유충들은 이후 저빈도 맥동 운동을 보입니다. 각 카테고리에 속하는 반응자의 백분율을 나타낸 이 그래프에서 유충의 열성 통각 반응에는 한계치가 존재합니다. 열 프로브 분석(heat probe assay)에서 유충의 100%는 프로브 온도 52 °C까지 빠른 반응을 보입니다.

하지만 54 °C 이상의 온도에서는 유충의 90% 이상이 20초간 접촉한 후에도 반응하지 않습니다. 이러한 유충들이 22번째 컷오프 이후에도 계속해서 움직이기는 하지만, 회전 횟수나 혐오 회피 행동에 소요된 시간 또한 측정하여 그래프로 나타낼 수 있습니다. 놀랍게도, 프로브 입력 온도가 낮을수록 더 많은 횟수의 회전이 유도되는 것으로 보여, 입력 온도와 반응의 강도 사이에는 역관계가 있는 것으로 보입니다.

물에 잠겨 있던 유충을 가열판으로 옮기면 다섯 가지의 정형화된 운동 행동이 관찰됩니다. 이러한 행동들이 관찰되는 평균 잠복기와 본 실험의 최적 분석 조건에서 각 잠복기마다 측정된 평균 물방울 온도가 여기에 제시되어 있습니다. 각 뚜렷한 행동을 보이는 유충의 비율은 77%에서 100% 사이였으나, 때때로 구르기(rolling) 및 휘두르기(whipping) 행동이 생략되거나, 중첩되거나, 역순으로 나타나기도 합니다. 가열판 분석에서 마비 행동이 시작된 후 생존한 유충의 비율이 여기에 제시되어 있습니다. 유충은 마비가 일어날 때까지 가열한 후, 회복을 위해 표준 배양 조건으로 옮겨졌습니다.

모의 처리된 유충은 열 노출을 제외하고 동일한 처리를 받았으며, 생존한 성체에서 PPE의 형성은 7일에서 13일 사이에 정량화되었습니다. 여기서 MD G four는 다수지성 말초 감각 뉴런의 4가지 클래스 모두에서 UAS 조절 트랜스진의 발현을 유도합니다. UAS or one delta C는 시냅스 전달에 필요한 초파리 개방형 정류 칼륨 통로의 변형 버전을 발현하며, UAS orrc one delta NC는 시냅스 전달을 방해하지 않는 동일한 통로의 추가 변형 버전을 발현합니다.

MD GALF four 드라이버와 UAS ORC one delta C 트랜스진을 모두 보유한 유충만이 관찰된 다섯 가지 행동 중 네 가지에서 잠복기가 증가함을 유의하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 유해한 열 자극에 대한 GE 유충의 국소적 및 전신적 반응을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 절차는 유전자 분석과 같은 다른 방법과 결합하여 열성 통각 수용에 필요한 유전자를 식별하는 데 활용될 수 있습니다. 열 프로브 분석을 시도할 때는 프로브의 압력, 위치 및 접촉 각도의 변동을 최소화하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.