Name: ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 학습하세요 ECIS/Taxis 시스템을 이용한 세포 화학주성 측정 방법으로, 전기 세포 기질 임피던스 감지 기술을 활용하여 실시간으로 세포 이동을 정량화합니다. 이 자동화 분석법은 약물 테스트와 세포 반응 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 국립 보건원 (ES07408 및 EB00208)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. ECIS / 택시 전극 준비 <ol><li> ECIS / 택시 전극 배열 (슬라이드 당 8 방으로 구성된)의 금색 표면이 먼저 무균 조건 하에서 실온에서 15 분 대한 탈이온수 (DH 2 O)의 멸균 10 밀리미터 시스테인과 사전 치료에 의해 ​​안정화된다. </li><li> 각 전극 챔버에서 시스테인 솔루션을 대기음, 멸균 DH 2 O로 3 회 씻어, 그리고 완전한 매체 250 μl (RPMI 1640 10 % FBS, 25 밀리미터 HEPES 완충액)으로 바꿉니다. </li><li> 전극 검사를 수행하기 위해 악기 배열 홀더의 핀에 연락을 전극 배열을 연결합니다. </li><li> 제대로 연결되어 챔버 스가 컴퓨터 화면에 녹색으로 강조 표시됩니다. 챔버 스는 빨간색으로 강조되어있다면, 그들은 연결되어 있지 않으며 전극은 모든 챔버에 대한 연락처를 설정하는 배열의 홀더에 다시 배치해야합니다. </li><li> 모든 챔버가 연결되면, 억제하기 위해 소프트웨어 컨트롤러에 '확인'버튼을 클릭각 챔버의 초기 저항 및 커패시턴스 값을 내꺼야. 저항 값은 1600 사이 및 2000 ohms 있어야하고, 커패시턴스 값은 8 챔버 어레이 5 사이와 6 nanofarads 있어​​야합니다. 실로이 허용치 안에 있지 않다면, 각각의 챔버는 데이터를 수집하는 데 사용해서는 안됩니다. </li><li> 개별 아가로 오스의 챔버를 준비하는 배열 자의 전극 연결을 끊습니다. 챔버에서 미디어를 기음과 멸균 DH 2 O를 사용하여 각 챔버에게 3 회 ​​씻어 </li></ol> 2. 아가로 오스 챔버 준비 <ol><li> 멸균 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브에서 측정 0.03 Seakem GTG 아가로 오스의 G와 1 ML 멸균 PBS를 추가합니다. 느슨한 튜브 뚜껑을 교체하고, 2 분 액체주기 위해 압력솥에서 아가로 오스를 (전자 레인지에 녹는이 분석을 위해 효과적이지 않을 것입니다) 용융. 이 짧은 시간은 원뿔 튜브를 용융하지 않습니다. (예 : Dictyostelium의 discoideum) 0.5 %, 문화 혈청 필요하지 않습니다 덜 까다로운 세포에 대한아가로 오스는 적절한 매체를 만들어 전자 레인지에 녹인 수 있습니다. 전자 레인지에 녹인 경우가 변성되므로 압력솥은 혈청이 필요 세포가 필요합니다. </li><li> 물 목욕으로 예열 완료 RPMI 매체의 5 ML 추가 (55 ° -60 ° C)에 직접적으로 뜨거운 아가로 오스로, 0.5 % 아가로 오스와 pipet 최대의 최종 농도로 아래로 부드럽게 섞는다하기. </li><li> 각 챔버로 녹인 아가로 오스 매체 Pipet 300 μl는 ECIS / 택시 배열 덮개를 교체하고 실온에서 젤 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스의 겔화을 평가하기 위해 15 ML 튜브의 뚜껑에 아가로 오스 남은 Pipet. 이 과잉 아가로 오스는 부분 4도 사용됩니다 : 아가로 오스로 우물을 절단. </li></ol> 3. 그럼 절삭 공구를 건설하고 정맥을 선명하게 <ol><li> , 64분의 5 '비트. 느린 속도 훈련과 각 정맥 개구부의 드릴 비트의 팁을 회전을 사용하는 드릴 비트는 각 정맥 조합의 전체 내부 가장자리를 깎는 특정 만드는 두 개의 14 게이지 뭉툭한 끝 캐뉼러를 선명하게날카로운 커팅 에지 (그림 4A)를 형성 ening. </li><li> 드릴 프레스의 비트 1 "X 2"X ¼ "64분의 5와 플렉시 글라스 (그림 4B-D) '을 통해 구멍을 드릴 다운합니다. 이는 각 플렉시 글라스 구멍을 통해 동등한 거리를 protrudes 있도록 각 둘레에 14 게이지 정맥을 삽입합니다. </li></ol> 4. 아가로 오스로 웰스를 절단 <ol><li> 가볍게 팁을 불타는하여 14 게이지 캐뉼러를 소독. 이전 ECIS 챔버에 우물을 절단하기 캐뉼러는 실내 온도에 냉각 허용하거나, 15 ML 튜브의 뚜껑에 아가로 오스를 만지고하여 캐뉼러 진정해. 정맥의 온도가 너무 높으면 챔버 우물이 절단되면서, 아가로 오스는 우물이 결함 및 결함 렌더링, 용융 것입니다. </li><li> 각 챔버의 대상 전극 (그림 2C 및 5)을 둘러싼 두 골드 도트 위에 정맥 쌍을 맞춥니다. 정맥 사이의 부드러운 접촉시 중지, 모든 수평 움직임없이 정맥 세로를 삽입전극 표면. 조심스럽게 모든 수평 움직임없이 다시 정맥을 제거하십시오. 그라디언트에 반대에 대한 추가 우물의 위치는 정맥의 지그의 재구성과 함께도 가능합니다. </li><li> 부드럽게 아가로 오스 폐기물을 잡으면 진공 트랩으로 낮은 진공 압력에 연결된 멸균 9 "파스퇴르 피펫을 사용하여, 정맥으로 남아 아가로 오스 플러그를 기음. </li><li> 아가로 오스를 포화 위해 2 분 동안, 37 각 챔버의 표면 ° C로 완벽한 RPMI 미디어 300 μl를 추가한 다음 부드럽게 아가로 오스를 방해하지 않고 표면과 우물에서 미디어를 기음. </li></ol> 5. 웰스로드 <ol><li> 각도 7 μl의 볼륨을 들고이 가능합니다. 각 침실에 잘하려면, 셀 서스펜션 7 μl를 추가합니다. Jurkat T 세포의 경우, 2 개의 x10 7 셀 / ML을 사용합니다. 이러한 세포는 200 혈청 부족 불완전 RPMI로 희석 NG / ML SDF-1α, 7 μl에 응답할 것입니다. 부정적인 cont로 혼자 완벽한 미디어를 사용rol. </li><li> 우물이로드되고 나면, 모든 우물을 중단하고 적절하게 가득 차 있었다되도록 거꾸로 현미경과 함께 배열의 각 챔버를 볼 수 있습니다. 세포가 잘의 경계의 범위 내에서에 있어야합니다. 그들이 우물에 모두 볼 수있다, 또는 셀 아니라 테두리 넘어서 퍼져있다면 큰 차이가 아가로 오스 아래 형성 하였다. 데이터가 안정적으로 그 챔버에서 해석할 수 없으므로, 부적절하게 설정 우물을 적어 둡니다. </li></ol> 6. 데이터 수집 <ol><li> 배열 홀더에 전극을 배치하고 소유자의 용수철 포고 핀에 전극 배열에 금색 패드를 다시 연결하고 "설정"을 클릭합니다. 제대로 연결되어있는 우물은 녹색으로 강조 표시됩니다. 우물 빨간색으로있다면, 그들은 연결되어 있지 않으며 전극이 배열 보유자로 재지정해야합니다. </li><li> 배열 구성을 표시하는 소프트웨어 패널의 드롭 다운 메뉴에서 "8WE1"을 (8 아니라 한 전극)을 선택합니다. </li><li> 소프트웨어 contr에서 "확인"을 선택각도에 대한 초기 저항 및 정전 용량 값을 결정하는 마셨다 패널. 커패시턴스 값이 5와 6 사이 nanofarads이어야하는 동안 저항 값은, 1600 사이 및 2000 ohms 있어야합니다. </li><li> 여러 주파수에서 저항을 측정하는 여러 주파수를 선택합니다. 주파수를 사용자 정의하거나 권장 주파수의 집합을 사용하는 선택이있다. 표준 다중 주파수 인수 설정은 8 우물 / 분 속도로 11 미리 설정된 주파수 (52.5, 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 16,000, 32,000 및 64,000 Hz에서)에서 데이터를 캡처. 측정 사이의 시간 간격도 사용자 정의할 수 있습니다. 여러 주파수 데이터를 수집하는 것은 정전 용량, 임피던스, 그리고 저항의 분석을 허용합니다. 4,000 Hz에서에서 저항 값을 수집하는 것은 포유 동물 세포 chemotaxis 연구를 위해 일반적으로 충분하지만, 추가 주파수가 다른 문맥 12,13에 정보를 제공할 수 있습니다. </li><li> 총 실험 기간은 오른손에 설정할 수 있습니다패널이나 실험은 세포가 전극에 도착 지표 저항을 제작하시면 "Finish"를 클릭하여 수동으로 중지 할 수 있습니다. 세포가 전극에 도달하는 데 걸린 시간은 사용된 전지 종류에 따라 다릅니다. </li><li> 데이터 수집을 시작하려면 '시작'을 클릭하십시오. </li></ol> 7. 데이터 관리 <ol><li> 데이터를 Excel로 내보낼 수 있지만, ECISθ 시스템을 함께 ECIS 1600R 소프트웨어는 ECIS / 택시 데이터를 분석하기위한 가장 효율적인 방법입니다. </li><li> 소프트웨어 데이터 분석 도구 막대가 라디오 버튼 Z, R 및 C. 이들은 각각 임피던스, 저항 또는 커패시턴스는, X 축 (경과 시간)에 대한 수직 축에 꾸몄다 여부를 확인 포함되어 있습니다. </li><li> ECIS / 택시 데이터를 가장 효율적으로 4,000 Hz에서에서 시간에 따른 저항으로 표시됩니다. 신속한 저항의 변동, 또는 microtransients (그림 1) 전극 위에 세포 운동의 증거입니다. O를 컴파일,R의 binning는 데이터 포인트가 있으므로 모든 포인트가 그래프로 나타납니다 것으로, ECIS / 택시 권장하지 않습니다 그것이 데이터의 평균 microtransients을 때문에. </li><li> 그래프가 ECIS1600R 소프트웨어로 만든되면, 그것은 파일 메뉴에서 "수출 그래프"를 선택하고. TIF 또는. JPG 파일로 저장하여 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 셀룰러 chemotaxis은 4,000 Hz에서에서 저항의 증가로 표시됩니다. 대상 전극에 대한 세포의 도착도 OPP 동부 표준시에 설명된대로 microtransients, 또는 micromotion라는 저항의 급격한 변동의 모양으로 표시됩니다. 알., 2009 (그림 1) 14. 부정적인 결과는 일관된로 표시하거나, 그림 1에 빨간색으로 볼 수 4,000 Hz에서에서 저항이 약간 감소,있다. microtransients의 부재 또한 전극의 세포 운동의 부재의 표시이다. 저항의 증가는 직접적으로 프로입니다전극 10 건너 숫자 셀 portional. G 단백질 결합 수용체를 방해하는 것으로 알려져 단클론 항체의 추가는 chemoattractant에 대한 특정 또는 독소가 chemotaxis 11을 차단할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg"> 1 그림. SDF1α. 인간의 Jurkat T 세포 (2.0x10 6 세포 / ml) 쇼핑에 대한 반응으로 인간의 Jurkat T 세포의 Chemotaxis은 SDF-1α의 구배에 노출되었다 부정적 컨트롤이나 RPMI 1640 (농도 펴기 100 NG / ML부터). 4,000 Hz에서에서 표준 저항 그래프되었다. 아무런 움직임은 RPMI 1640에 대한 노출로 본적이있는 동안 인간의 Jurkat T 세포는 같은 저항 및 microtransients의 증가에 의해 입증, SDF-1α에 대한 응답으로 옮겼습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg"> 그림 2. ECIS / 택시 위로보기 withou를 전극t 아가로 오스. 각 ECIS / 택시 전극은 8 각 방으로 구성되어 있습니다. 각 챔버 대형 전극 () 공유 및 개인 대상 전극 (B)가 포함되어 있습니다. 각 챔버는 또한 캐뉼러와 아가로 오스의 우물을 절단했을 때 가이드로 사용되는이 금색 동그라미를 (다)이 있습니다. 황금 사각형 (D)는 전극에 교류 전류를 적용하기 위해 포고 핀에 연결 접촉 패드입니다. 개별 대상 전극은 큰 카운터 전극 (E)와 각 회로에 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg"> 그림 3. 두 웰스는 각 아가로 오스-채워진 챔버로 침입한다. chemoattractant 잘 하나 추가하면 그것이 잘 chemoattractant에 가장 가까운 chemoattract 가장 높은 농도로, 아가로 오스의 그라디언트를 만들 diffuses. 세포 chemoattractant 높은 농도쪽으로 아가로 오스 아래 여행하고 대상 전극을 통해 전달할 수 있습니다. 으로세포가 대상 전극을 건너, 저항의 증가는 ECIS 1600R 소프트웨어에 의해 기록됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg"> 4 그림. 플렉시 글라스 둘이 14 게이지 캐뉼러의 삽입. ) 64분의 5 "드릴 비트가 정맥 팁을 선명하게하는 데 사용됩니다. B) 두 개의 구멍이 배치 장면에 따라 14 게이지 캐뉼러을 수용하기 위해 플렉시 글라스로 뚫고는되어야한다. C)에 구멍을 보장하기 위해 드릴 프레스를 사용하여 수직 위치 pleixglass 표면. D)에 두 날카롭게 캐뉼러는 ¼ "플렉시 글라스, 간격 2mm (안쪽 가장자리에서 측정)를 통해 삽입됩니다. 이 날카롭게 캐뉼러 신중 우물를 잘라 아가로 오스에 삽입됩니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg"> 그림 5. ECIS / 택시 챔버의 황금 점 캐뉼러를 정렬. 우물을 잘라내려면 날카롭게 캐뉼러가 있어야합니다ECIS / 택시 챔버의 바닥에 대상 전극 측면을 노릴 골드 도트로 정렬됩니다. 캐뉼러은 어떤 수평 움직임없이 수직으로 삽입하고, 같은 방식으로 제거해야합니다.

<ol><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li>
<li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li>
<li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li>
<li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li>
<li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis%3A+an+evaluation+of+the+cortical+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li>
<li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li>
<li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li>
<li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li>
<li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells%3A+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li>
<li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li>
<li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li>
<li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li>
<li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li>
</ol>

데이비드 Knecht와 마이클 Lynes은 응용 생물 물리학, 주식 회사로 코네티컷의 대학에 의해 라이센스가되어 ECIS / 택시 기술에 대한 발행된 특허를 가지고

ECIS / 택시 분석의 소설 특성은 세포의 chemoattractant에 반응으로 실시간 데이터 수집을 자동화하는 기능을 포함합니다. 이 기술의 가장 일반적인 응용 프로그램이 개별 chemotactic의 그라디언트로 세포 반응을 측정하거나, chemotaxis의 agonists 및 antagonists의 혼합물로 구성되어 그라디언트로하는 반면, ECIS / 택시 접근도에서도 상당히 도움이 될 수있는 이러한 구성으로 유사 의무가있다 세포 반응 평가. 중복 또는 연속 그라디언트 것은 소설적인 방법으로 세포의 행동에 영향을 미칠 수있다는 좋은 증거가있다. 또한, 그것이 더 복잡한 그라디언트가 원위치 12, 13의 규범이다 가능성이 높습니다. ECIS / 택시 분석은 다른 기술로 수없는 방법으로 이러한 다양한 그라디언트 구성의 모델링을 활성화할 수 있습니다. 예를 들어, 추가로 웰스를 추가하여, 한 g의 방향을 배포할 수 있습니다...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> 응용 생물 물리학 </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS 전극 배열 </td><td> 응용 생물 물리학 </td><td> 8W Chemotaxis </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG 아가로 오스 </td><td> BioWhittaker 분자 응용 </td><td> 50,070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone 태아 소 혈청 </td><td> 써모 과학 </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> PEnicillin / 스트렙토 마이신 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 1,670,049 </td><td> 페니실린 5,000 IU / ML, 스트렙토 마이신 5 밀리그램 / ML </td></tr><tr><td> HEPES 버퍼 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 1,688,449 </td><td> 1M 용액, 세포 배양 등급 </td></tr><tr><td> 14 게이지 스테인레스 스틸 정맥 (2) 4 인치 </td><td> 일반 실험실 공급 </td><td> 5-8365-1 </td><td> 무딘 지점 </td></tr></tbody></table>

ecis / 택시와 셀룰러 chemotaxis 측정

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

외부 자극에 대한 반응으로 세포 운동은 상처 치유, 염증 및 감염에 대한 응답을 포함하여 많은 세포 과정에 필수적입니다. chemotaxis를 측정하기위한 일반적인 방법은 세포 chemoattractant는 다공성 막에 의해 분리되는 Boyden 챔버 분석이다. 세포 chemoattractant 향해 막 통해 마이 그 레이션함으로써, 그들은 멤브레인, 또는 기본 미디어에 가을의 아래쪽을 준수하고, 이후 물들일 시각 1 포함됩니다. 이 방법에서는 세포 조직이 발견 그라디언트의 가난한 표현이 될 것으로 생각됩니다 가파른 및 과도 chemoattractant 그라데이션에 노출됩니다. 또 다른 분석 시스템, 세 이하 아가로 오스 chemotaxis 분석, 3, 아가로 오스 층 아래에 형성 얇게 수성 영화에서 고체 기판에 걸쳐 네 대책 전지 운동. 아가로 오스에서 개발하고 기울기는 얕은이며 애플 리케이션이 될 것으로 생각된다자연스럽게 그라디언트를 발생의 표현을 ropriate. Chemotaxis은 여행 거리 미세한 영상으로 평가할 수 있습니다. Boyden 챔버 분석과 세 이하 아가로 오스 분석 모두는 일반적으로 끝점 assays로 구성됩니다. 자동 ECIS / 택시 시스템은 전기 세포 기질 임피던스 감지 (ECIS) 5, 6 세 이하 아가로 오스의 접근 방식을 결합한 제품입니다. 본 분석에서는 대상 전극은 8 실 각에 위치해 있습니다. 대규모 반대 전극은 8 실 (그림 2) 각을 통해 실행됩니다. 각 챔버는 아가로 오스 가득한 두 개의 작은 우물이 대상 전극의 양쪽에있는 아가로 오스의 상처가있다. 다른 diffusing chemoattractant의 소스 (그림 3)을 보유하면서 하나가 아니라, 테스트 셀 인구들로 가득 차 있습니다. 시스템을 통해 전달되는 전류는 세포가 대상 전극을 통해 전달로 발생하는 저항의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 표적 세포는 electrod전자 시스템 6 저항을 증가시킵니다. 또한, 저항의 급속한 변화는 전극 표면과 세포의 상호 작용의 변화를 나타내며 지속적인 세포의 형태 변화는 지표. ECIS / 택시 시스템은 장시간 동안 실시간으로 세포 인구의 움직임을 측정할뿐만 아니라 대상 전극에 단일 세포의 도래를 감지 정도를 구분하실 수 있습니다. Dictyostelium discoidium는 엽산 그라디언트 7, 8 및 chemotactic 응답을 정확하게 ECIS / 택시 9 측정할 수의 면전에서 마이 그 레이션하는 것으로 알려져 있습니다. 백혈구 chemotaxis은 SDF1α 및 chemotaxis의 antagonists에 대한 응답도 ECIS / 택시 10, 11로 측정되었습니다. SDF1α에 백혈구 응답의 ​​예제는 그림 1에 표시됩니다.

ECIS / 택시 시스템은 세포 chemotaxis를 측정하는 자동화된 실시간 분석이다. 본 분석에서는 세포 표적 전극에 도착하는 아가로 오스의 레이어 아래로 이동합니다. 세포 운동은 AC 전류를 0으로 저항의 발병에 의해 측정됩니다.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

외부 자극에 반응하는 세포 이동은 상처 치유, 염증 및 ...에 대한 반응을 포함한 많은 세포 과정의 핵심입니다.

본 실험 절차의 전체적인 목적은 전기 세포 기질 임피던스 센싱(electric cell substrate impedance sensing, EISs)을 활용하여 자동화된 실시간 분석으로 화학주성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 각 챔버에 complete RPMI 배지가 포함된 0.5% agros를 채워 axxis 전극을 준비합니다. 다음 단계로, 14 gauge cannula jig를 사용하여 각 챔버의 agros에 두 개의 웰을 동시에 뚫고, 각 챔버에서 두 개의 agros 플러그를 흡인하여 제거합니다.한쪽 웰에는 단일 세포 현탁액을 채우고, 다른 쪽 웰에는 화학 유인 물질을 채웁니다. 다음으로, 테스트하려는 세포 유형에 적합한 대기 파라미터로 설정된 인큐베이터 내의 어레이 홀더를 통해 전극을 ISIS theta 시스템에 연결합니다. 최종적으로, 세포가 두 웰 사이의 표적 전극에 도달함에 따라 저항 변화를 실시간으로 측정함으로써 세포 화학성(cellular chemotaxis)을 관찰할 수 있습니다.axxis 분석법이 Boyden 챔버 분석법이나 기존의 현미경 기반 agar-under 분석법과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 시스템을 지속적으로 조작할 필요 없이 화학주성에 대한 실시간 자동 측정이 가능하다는 점입니다. 전극 준비를 시작하려면, 멸균 상태의 실온에서 10 millimolar cysteine 탈이온수 용액으로 15분 동안 전처리하여 ISIS Texas 전극 어레이의 금 표면을 안정화하십시오. 전처리 후, 각 전극 챔버에서 cysteine 용액을 흡입하여 제거하십시오.멸균된 탈이온수로 3회 헹구고 250 µL의 완전 배지로 교체합니다. 다음으로, 전극 확인을 수행하기 위해 전극 어레이를 기기 어레이 홀더의 접점 핀에 연결합니다. 제대로 연결된 챔버는 컴퓨터 화면에 녹색으로 표시됩니다.챔버가 빨간색으로 표시되면 연결되지 않은 상태이므로, 모든 챔버의 접촉을 형성하기 위해 어레이 홀더 내 전극의 위치를 재조정해야 합니다. 모든 챔버가 연결되면, ISYS Theta 소프트웨어 컨트롤러의 확인(check) 버튼을 클릭하여 각 챔버의 초기 저항 및 정전용량 값을 측정합니다. 8-챔버 어레이의 경우, 저항 값은 1600에서 2000 ohms 사이여야 하며, 정전용량 값은 5에서 6 nanos 사이여야 합니다. 개별 챔버가 이러한 허용 범위 내에 있지 않은 경우, 해당 챔버는 데이터 수집에 사용해서는 안 됩니다.다음으로, 개별 aros 챔버를 준비하기 위해 어레이 홀더에서 전극을 분리합니다. 챔버에서 배지를 흡입하여 제거하고, 각 챔버를 멸균 탈이온수로 3회 세척합니다. aros 챔버 설정을 시작하려면, 서면 프로토콜에 기술된 대로 RPMI 배지가 포함된 aros 용액을 준비하십시오.녹인 agros 배지 300 µL를 각 챔버에 피펫팅하고, 남은 agros는 15 mL 튜브 캡에 피펫팅합니다. agros의 젤화를 평가하려면 ISIS axxis 어레이 커버를 다시 덮고 실온에서 젤화시켜 재사용 가능한 캐뉼라를 제작합니다. 웰 커팅 툴을 사용하여 14 gauge 뭉툭한 끝단 캐뉼라 두 개를 날카롭게 다듬습니다.5/64인치 드릴 비트를 사용하여 저속 드릴로 각 캐뉼라 개구부의 끝부분을 회전시켜, 드릴 비트가 각 캐뉼라 개구부의 내부 가장자리 전체를 절삭하도록 합니다. 날카로운 절삭날을 형성하기 위해 5/64인치 비트로 플렉시글라스에 구멍 두 개를 뚫습니다. 드릴 프레스를 사용하여 끝을 날카롭게 만든 14게이지 캐뉼라를 각각의 구멍에 삽입하여, 플렉시글라스로부터 동일한 거리만큼 돌출되도록 합니다.EIS 챔버에 웰을 만들기 전, 14 gauge 캐뉼라 툴의 끝부분을 가볍게 화염 멸균하십시오. 15 milliliter 튜브 캡의 아그로스를 터치하여 캐뉼라를 식힙니다. 캐뉼라의 온도가 충분히 낮아지지 않으면, 챔버 웰을 컷팅할 때 아그로스가 녹아 웰의 모양이 변형되거나 결함이 생길 수 있습니다.Agros의 무결성을 손상시키지 않고 웰(well)을 절개하는 것이 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다. 이를 위해서는 캐뉼라의 정밀한 정렬과 매우 낮은 진공 압력이 필요합니다. 각 챔버에서 대상 전극을 둘러싸고 있는 두 개의 금색 점 위에 캐뉼라 쌍을 정렬하십시오.수평 이동 없이 캐뉼라를 수직으로 삽입하며, 캐뉼라와 전극 표면이 가볍게 접촉하면 멈춥니다. 진공 트랩이 연결된 저진공 압력의 멸균 5인치 파스퇴르 피펫을 사용하여, 다시 수평 이동 없이 캐뉼라를 조심스럽게 제거합니다. 아가로스 폐기물을 수거하기 위해 캐뉼라 도구에 의해 남겨진 아가로스 플러그를 부드럽게 흡입합니다.그런 다음 37°C에서 2분 동안 각 챔버 표면에 300 µL의 완전 RPMI 배지를 첨가하여 aros를 포화시킵니다. 2분 후, aros가 흐트러지지 않도록 표면과 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 각 챔버의 웰 하나당 7 µL의 부피를 수용할 수 있으며, 여기에 7 µL의 세포 현탁액을 넣습니다.본 시연에서는 jca T 세포를 2×10⁷ cells/mL 농도로 사용합니다. 그다음 챔버의 두 번째 웰에 화학 유인 물질 7 µL를 넣습니다. JCA T 세포의 경우, 불완전 배지로 희석한 200 ng/mL의 sdf one alpha를 사용합니다.음성 대조군 부하를 위해 RPMI를 화학 유인물질로 사용합니다. 두 번째 웰에 완전 배지만 7 µL 넣습니다. 웰 부하가 완료되면, 도립 현미경으로 어레이의 각 챔버를 관찰하여 모든 웰이 제대로 절단되고 채워졌는지 확인합니다.세포는 웰 경계 내에 위치해야 합니다. 만약 세포가 두 웰 모두에서 관찰되거나 세포 웰 경계를 넘어 퍼져 있다면, aros 아래에 틈이 형성된 것입니다. 적절하게 설정되지 않은 웰에서 얻은 데이터는 신뢰성 있게 해석될 수 없음에 유의하십시오.데이터 수집을 시작하려면 전극을 어레이 홀더에 배치하십시오. 전극 어레이의 골드 패드를 홀더의 스프링 장착 포고 핀(pogo pins)에 다시 연결한 후, ISIS theta 소프트웨어에서 설정(set up)을 클릭하십시오. 제대로 연결된 웰(well)은 녹색으로 표시됩니다.웰이 빨간색으로 표시되면 연결되지 않은 것이므로, 드롭다운 메뉴에서 어레이 홀더 내의 전극 위치를 다시 지정해야 합니다. 소프트웨어 패널에서 'eight W one semicolon'을 선택하십시오. 이는 어레이 구성이 'Eight'임을 나타냅니다.소프트웨어 제어 패널에서 웰 전극을 선택하고 check를 선택하여 초기 저항값과 정전용량값을 결정합니다. 각 웰에 대해 여러 주파수를 선택하여 다양한 주파수에서 저항을 측정합니다. 다중 주파수 데이터를 수집하면 정전용량, 임피던스 및 저항에 대한 분석이 가능합니다.주파수를 직접 설정하거나 권장되는 주파수 세트를 사용할 수 있습니다. 표준 다중 주파수 획득 설정을 사용하면 분당 8개의 웰 속도로 11개의 사전 설정된 주파수에서 데이터를 캡처합니다. 측정 간의 시간 간격 또한 사용자 정의가 가능합니다.전체 실험 시간은 우측 패널에서 설정할 수 있습니다. 또는, 종료 버튼을 클릭하여 실험을 수동으로 중단할 수 있습니다. 세포가 전극에 도달했음을 나타내는 저항을 생성하면, 시작 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 개시하십시오.데이터를 Excel로 내보낼 수 있지만, EISs theta 시스템과 함께 제공되는 EISs 1600 R 소프트웨어가 EISs taxes 데이터를 분석하는 가장 효율적인 방법입니다. 소프트웨어의 데이터 분석 툴바에는 Z, R, C 라디오 버튼이 있습니다. 이 버튼들은 세로축에 임피던스, 저항 또는 커패시턴스를 각각 설정하여 가로축인 경과 시간과 대비해 도식화할지를 결정합니다. EISs taxes 데이터는 4,000 hertz에서의 시간 경과에 따른 저항으로 표시하는 것이 가장 효율적입니다.저항의 급격한 변동 또는 미세 일시적 변화(micro transient)는 전극 위에서의 세포 이동을 나타내는 증거입니다. 데이터 포인트들이 겹치거나 굴곡질 수 있으므로, 모든 포인트가 그래프에 표시되지 않는 방식은 미세 일시적 변화가 데이터에서 평균화되어 사라질 수 있기 때문에 y축 설정 시 권장되지 않습니다. 그래프가 작성되면, ISIS 1600 R 소프트웨어의 파일 메뉴에서 '그래프 내보내기(export graph)'를 선택하여 JPEG 파일로 저장하고 내보낼 수 있습니다.인간 Jurkat T 세포를 SDF-1α 농도 구배에 노출시켜 이동을 자극하거나, 음성 대조군으로서 RPMI 1640에 노출시켰습니다. 4,000 Hz에서의 정규화된 저항값이 여기에 기록되었습니다. 인간 Jurkat T 세포가 SDF-1α에 반응하여 이동함에 따라 4,000 Hz에서의 저항값이 증가하며, 이는 세포 화학성(chemotaxis)을 나타냅니다.표적 전극에 세포가 도달하면 마이크로 트랜지언트(micro transients)라고 불리는 급격한 저항 변동이 나타납니다. 저항의 증가는 전극을 통과하는 세포의 수에 정비례합니다. 음성 결과는 4,000 hertz에서 저항이 안정적으로 유지되거나 저항이 약간 감소하는 것으로 나타납니다.이는 세포가 RPMI 1640에 노출되었을 때 관찰됩니다. 미세 일시 전류(micro transient)의 부재는 전극에서 세포의 이동이 없음을 나타내는 징후이기도 합니다. 이러한 기본 절차 외에도, 화학 유인 물질에 특이적인 단클론 항체, 약물 수정제 또는 독소가 존재하는 상태에서 세포 이동을 모니터링하기 위해 Esys, Texas를 사용하는 다른 수정 방법을 적용할 수 있습니다.

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 chemoeffectors의 안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis 조사를위한 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

이 비디오는 선충 C. elegans의 화학주성을 소개하고 황산구리에 대한 화학주성 혐오를 테스트하는 샘플 프로토콜을 보여줍니다.

C. 예쁜꼬마선충 Chemotaxis Assay: 웜에서 Chemosensation을 테스트하는 방법

정량의 화학 주성 반응을 평가하는...

C. elegans의 주 화성 분석

세포 이동은 인간의 발달과 생활에서 중요한 부분을 차지합니다. 세포 이동을 변경할 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 3D 콜라겐 매트릭스에서 화학주성을 조사할 수 있는 평면 구배 확산 시스템을 제시하여 기존 분석법의 최신 확산 챔버 한계를 극복할 수 있습니다.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

여기는 심각한 기계적인 자극에 세포질 응답을 평가 하기 위한 방법에 설명 합니다. 현미경 기반 분석 결과에서 우리 전단 흐름 간략 한 자극에 따라 붙일 표시 된 바이오 센서의 지역화를 검사 합니다. 우리는 또한 화학적 심각한 기계적인 자극에 응답에 대 한 관심의 다양 한 단백질의 활성화를 테스트합니다.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

여기에 제시된 것은 환경에서 직접 미생물 행동의 연구를 가능하게 하는 최근 개발된 미세 유체 장치인 시투 화학분석분석의 프로토콜이다.

수생 생태계에서 미생물 행동을 검사하는 시투 화학 분석분석

여기에서는 모델 유기체 C. elegans에서 고전적 조건화를 수행하여 연상 학습을 테스트하는 프로토콜을 제시합니다. 이 패러다임은 환경 내 염분의 농도를 음식의 유무와 짝을 이루는 것을 기반으로 하며, 이는 화학주축을 소금 쪽으로 또는 소금에서 멀어지게 합니다.

선충 Caenorhabditis elegans의 화학주축에서 연관 학습 측정

Microfluidics를 사용하여 세균 Chemotaxis의 연구 - 인터뷰

학습하세요 ECIS/Taxis 시스템을 이용한 세포 화학주성 측정 방법으로, 전기 세포 기질 임피던스 감지 기술을 활용하여 실시간으로 세포 이동을 정량화합니다. 이 자동화 분석법은 약물 테스트와 세포 반응 연구에 활용됩니다.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

더 많은 동영상 탐색