의 Proprioceptors의 시각화 Drosophila 애벌레와 Pupae

이 절차의 전반적인 목표는 초파리의 유충과 푸비에서 고유 수용성 피톤 기관을 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 사육하고 유충 또는 번데기를 해부 한 후 별 유충 또는 푸비에서 세 번째 사육 및 수집에 의해 수행됩니다. 면역 염색을 위해 고정되어 있습니다.

다음으로, 고정 유충 또는 번데기는 적절한 항체로 면역 염색됩니다. 마지막 단계는 현미경 검사를 위해 염색된 샘플을 장착하는 것입니다. 궁극적으로 컨포칼 현미경은 피톤 기관을 시각화하는 데 사용됩니다.

이 방법은 oph에서 소품 수용체의 사후 공생체 발달 및 패턴화에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 소품 수용체 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 유형의 감각 기관 및 힘줄과 같은 다른 기관에도 적용될 수 있습니다. 먼저 필요한 도구, 솔루션 및 방황의 유리병을 조립합니다.

별 유충에서 세 번째, PBS 및 FIXATIVE 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 바이알 벽에서 떠돌이 별 유충 중 세 번째를 골라 조직 배양 접시에서 시가 엘라스토머로 만든 해부 플레이트에 50마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS 방울에 넣습니다. 해부 현미경을 사용하여 유충의 등쪽을 위로 향하게 하고 입 가까이로 갈고리를 만들고 곤충 핀을 뇌에 꽂습니다.

집게로 유충의 뒤쪽 끝을 잡습니다. 부드럽게 당겨 유충을 세로로 부드럽게 늘립니다. 스프링 가위를 사용하여 두 개의 후방 구형 사이에 다른 곤충 핀을 붙입니다.

전방 후방 축에 수직으로 신체 벽에서 두 개의 수평 절개를 자르고 전방 및 후방 핀에 가깝게 유지합니다. 다음으로, 등쪽 정중선을 따라 전방에서 후방 절개까지 유충 체벽을 자릅니다. 가는 집게를 사용하여 내부 장기와 기관을 제거합니다.

그런 다음 PBS로 한두 번 부드럽게 씻으십시오. 집게로 두 개의 몸통 벽 덮개를 잡습니다. 그것들을 펴고 양쪽에 두 개의 곤충 핀을 사용하여 플레이트에 고정합니다.

PBS를 제거하고 50마이크로리터의 고착 용액을 추가합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다. 고정제를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 스프링 가위를 사용하여 곤충 핀을 당겨 빼냅니다.

애벌레의 머리와 꼬리를 잘라 직사각형 필레를 남깁니다. 고정 조직을 PBS가 있는 냉각된 einor 튜브로 옮깁니다. 충분한 수의 유충이 고정되면 항체 염색을 직접 계속할 수 있습니다.

즉각적인 염색을 원하지 않는 경우, 고정 유충을 95% 에탄올로 각각 5분씩 3번 세척한 다음 영하 20도의 에탄올에 보관해야 합니다. 세 번째 instar 유충이 먹기 시작할 때까지 유충 고정과 같이 유리병에 주의를 기울입니다. 매시간 유리병을 검사하고 먹은 유충을 표시하십시오.

표시된 pube가 섭씨 30도에서 40-24시간 동안 또는 미세한 집게를 사용하여 섭씨 24도에서 27-29시간 동안 발달하도록 합니다. 적절한 연령의 20-30 pube를 선택하여 어두운 도자기 멀티 웰 해부 접시에 넣으십시오. 관심 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 동공 케이스에서 번데기를 추출합니다. operculom을 벗겨내는 것으로 시작하고 번데기가 자유로워질 때까지 계속합니다. 모든 번데기를 추출하여 PBT로 채워진 우물에 넣으십시오.

마이크로 해부 칼을 사용하여 해부 접시의 우물 사이의 평평한 표면에 5개의 puy를 놓습니다. 머리 끝과 복부 뒤쪽 끝을 자릅니다. 가는 집게를 사용하여 번데기를 제자리에 잡고 1ml 주사기를 사용하여 앞쪽 구멍을 통해 PBT를 주입하여 번데기의 내부 장기를 씻어냅니다.

해부된 번데기를 PBS로 채워진 우물에 담궈 잠시 씻고 얼음 위에 보관된 아이노르 튜브의 냉기 고정제로 옮깁니다. 퓌이를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날.

정착액을 버리고 PBT로 Puby를 씻을 때마다 5분 동안 3회 씻습니다. 워시 푸비를 얼음에 보관하십시오. 해부 접시의 두 웰을 PBT로 채웁니다.

폴리에틸렌 pasti 피펫을 사용합니다. 여러 개의 puby를 우물 중 하나로 옮깁니다. 그런 다음 한 번에 한 마리의 번데기를 두 번째 번데기로 이동합니다. 잘.

끝이 완벽하게 정렬된 두 쌍의 날카로운 집게를 사용하여 번데기를 우물 바닥에 고정한 다음 큐티클을 부드럽게 찢습니다. 날개 표피를 제거하는 것은 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다. 우리는 항상 이 단계에서 날개의 일부를 잃기 때문에 상대적으로 많은 수의 번데기로 절차를 시작합니다.

큐티클이 찢어지면 날개에서 벗겨냅니다. 번데기에서 날개가 분리되지 않도록 주의하십시오. 날개 날개에서 큐티클을 벗긴 후 날개 경첩의 큐티클을 계속 벗겨냅니다.

날개 큐티클이 벗겨지면 비슷한 방법으로 다리 큐티클을 벗겨낼 수 있습니다. 이 과정에서 많은 다리를 잃을 가능성이 높지만, 낮은 수율에도 불구하고 이 단계는 다리 피톤 장기의 염색을 크게 개선하므로 적극 권장됩니다. 번데기를 메탄올로 채워진 einor 튜브에 넣고 실온에 보관하십시오.

모든 퓌이의 큐티클을 계속 벗겨내고 같은 튜브에 추가하여 총 10개 이상의 멋지게 벗겨진 퓌를 만듭니다. 각 염색을 위해 메탄올을 제거하고 95% 에탄올로 각각 5분 동안 3번 세척합니다. 고정 puy는 면역 염색 전에 영하 20도에서 95% 에탄올에서 장기간 보관할 수 있습니다.

유충을 장착하려면 현미경 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 떨어뜨린 다음 큐티클이 아래를 향하고 체벽 근육이 위를 향하도록 유충을 배치합니다. 깨끗한 커버 슬립에 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고 장착된 유충에 압력을 가하지 않고 준비물을 덮는 데 사용합니다. 음모를 마운트합니다.

먼저, 장착 매체를 한 방울 떨어뜨린 두 개의 현미경 슬라이드를 준비하는데, 하나는 해부용이고 다른 하나는 장착용입니다. 슬라이드 중 하나에 여러 개의 pu를 놓고 스프링 가위를 사용하여 머리와 복부 뒤쪽 부분을 제거합니다. 다음으로, 날개와 다리 사이를 잘라 흉부의 등쪽 절반과 복부 절반을 분리합니다.

번데기의 절개된 신체 부위를 장착 매체의 드롭에 놓습니다. 두 번째 슬라이드에서는 날개와 다리를 쭉 뻗고 조직이 겹치는 것을 최대한 최소화합니다. 마지막으로, 커버 슬립에 장착 매체 한 방울을 떨어뜨리고 과도한 압력을 가하지 않고 샘플 위에 놓습니다.

별 유충의 세 번째 유충에서 면역 염색 코르톤 기관에 대한 이 컨포칼 현미경 사진은 8개의 코르톤 기관 중 7개가 명확하게 보이는 멋지게 늘어난 복부 분절을 보여줍니다. 함께 penasco lipid organ을 형성하는 5개의 측면 기관, 단일 측면 기관 및 두 개의 복부 피질 기관 중 하나가 분명합니다. 피질 기관의 뉴런은 뉴런 마커, 단클론 항체 22 C 10으로 표지되고 빨간색으로 표시됩니다.

인대 캡과 부착 세포는 Antifa tubulin 85 E로 표지되어 있으며 파란색으로 표시되어 있습니다. 캡(cap)과 인대(ligament cells)는 피질 긴장 기관(corti tonal organ)으로 추가적으로 표지됩니다. Delilah 유전자 자리에 대한 규제 요소를 품고 있는 특정 GFP 기자.

여기서, 복부 요골 정맥(ventral radial vein)에 있는 날개 피질 긴장 기관(wing corti tonal organs)은 35시간 된 번데기의 컨포칼 현미경 사진에 나와 있습니다. 뉴런은 뉴런 마커 22 C 10으로 표시되며, 빨간색과 패널 B로 표시되며, 인대와 캡 세포는 파란색과 패널 C로 표시된 Antifa tubulin 85 E 항체와 함께 표지되어 있으며, 피질 긴장 기관도 있습니다. 녹색으로 표시된 특정 GFP 리포터 이식유전자.

이 비디오를 시청한 후에는 oph의 유충과 번데기 모두에서 고유 수용성 코르톤 기관을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안, 기술된 항체의 사용에 최적화되었다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 항체에 따라 약간 다른 고정 및 염색 조건이 필요할 수 있습니다.

따라서 다른 항체에 대해 이 절차를 사용할 때 사용 중인 항체에 대한 최적의 조건을 찾아야 합니다.