Name: Визуализация проприорецепторов в Drosophila Личинки и куколки (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Узнайте метод иммуноокрашивания для визуализации хордотональных органов в личинках и куколках Drosophila melanogaster. Этот подход позволяет изучать развитие проприорецепторов с помощью конфокальной микроскопии.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы хотели бы поблагодарить развития исследований Hybridoma банка в Университете штата Айова для отправки нам антител. Эта работа была поддержана грантом (№ 29/08) из Израиля научного фонда. AS также поддерживает исследования грант DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Перед тем как начать <ol><li> Рост желаемого культуры лету. Хранить флаконы непереполненные (около 30 мух на 50 мл флакон). Пусть мухи откладывают яйца только на один день в каждом флаконе. Это обеспечит достаточное количество личинок пищей и дать им возможность достичь максимального размера до вылезая из пищи. Хранить флаконы в соответствующем температуре до третьего возраста личинки начинают бродить на флаконе стены. </li><li> Подготовить новый запас фосфатным буферным раствором (PBS) и PBT (0,1% Tween в PBS). Держите 10 мл PBS на льду. </li><li> Подготовить 1-5 мл свежего фиксатора (4% формальдегида в PBT) и держать его на льду. Мы используем бутылки 37-38% формальдегида в качестве исходного раствора. </li></ol> 1. Вскрытие и фиксации личинки третьего Инстар <ol><li> Выберите блуждающих третьей взрослой личинки из флакона стены и поместить его в 50 мкл капли ледяной PBS на тарелку Sylgard рассечение (из 184 Sylgard силиконового эластомера комплект корпорации Dow Corning вкультуры тканей блюдо). </li><li> Держите личинки, спинной стороной вверх, в районе устья крючки, с помощью тонкой щипцы (Дюмон # 5 щипцы), и придерживаться насекомых контактный (minutien, 0,1 мм, нержавеющая сталь) с помощью мозга личинок. </li><li> Возьмите задний конец личинки пинцетом, осторожно тянуть и растягивать личинку аккуратно продольно. Придерживайтесь другое насекомое контактный двух задних дыхальца. </li><li> Используя ножницы весной вырезать две горизонтальные разрезы в стенке тела (перпендикулярно передне-задней оси), недалеко от переднего и заднего контактов. </li><li> С помощью ножниц разрезать весной личиночной стенкой тела вдоль спинной средней линии от передней к задней разрез. </li><li> Удалить внутренних органов (кишечника, слюнных желез, мальпигиевых сосудов и т.д.) и трахеи с использованием тонких щипцов. Мойте мягко один или два раза PBS. </li><li> Возьмите двух створок стенки тела щипцами, растянуть их и прикрепите их к пластине с помощью двух насекомых контактов с каждой стороны. </li><li> Удалить PBS и добавить 50 мкл фиксирующем растворе (4% формальдегида в PBT). Инкубировать 20 минут при комнатной температуре. </li><li> Снимите фиксатор. Мыть два раза PBS. Вытяните насекомых булавками. Используя ножницы весной сократить личиночной голову и хвост оставить прямоугольной филе. Передача фиксированной ткани охлажденной трубки Эппендорф с PBS. </li><li> После того, как достаточное количество личинок являются фиксированными, можно продолжить непосредственно на антитела окрашивания. Если немедленно окрашивание не требуется, фиксированные личинки должны быть вымыты в 3 раза, 5 минут, с 95% этанола и хранят в 95% этанола при -20 ° C. </li></ol> 2. Вскрытие и фиксации Куколки Часть I <ol><li> Участие в ампулах, как и для личинок фиксации, до третьего возраста личинки начинают pupariate. Изучить флаконов в час и знак личинки, которые pupariated. Позвольте отмеченной куколки развиваться 30-40 часов при температуре 24 ° С, или 24-27 часов при 29 ° C. </li><li> Используя тонкий пинцет выбрать 20-30 куколок-йэлектронной соответствующего возраста и поместить их в темное фарфора мульти-и рассечения блюдо. Будьте осторожны, чтобы не повредить ткани интерес. </li><li> Извлечение из куколки куколки случае. Начнем с отшелушивающим крышечки и продолжаются до куколки бесплатно. Положить в куколку и заполнены PBT. Продолжить извлечения всех куколок. Шаги 2.4-2.6 должно быть сделано в маленьких партиях из пяти куколок одновременно. </li><li> Разместить пять куколок на ровную поверхность между скважин вскрытия блюдо. Использование микро-нож рассечение сократить кончик головы и задний конец брюшка (в качестве альтернативы, можно использовать две пары щипцов рвать отверстиями на обоих концах куколки). </li><li> Держите куколки на месте с помощью пинцета и тонких использовать 1 мл шприц промыть внутренних органов куколки, вводя PBT через передние отверстия. </li><li> Вымойте расчлененный куколки кратко, опуская его в хорошо заполнены PBS и переместить его в холодную фиксатор в пробирку Эппендорфа держится на льду. </li><li> Выдержите в течение ночи (ON) при 4 ° C. </li></ol> Часть II <ol start="8"><li> Откажитесь от фиксатора и мыть куколок три раза по 5 минут каждая, с PBT. Храните вымытые куколок на льду. </li><li> Заполнить две скважины на вскрытии блюдо с PBT. Использование полиэтиленовой пипетки Пастера передачи несколько куколок в одной из ям. </li><li> Перемещение на одну куколку в то время, во второй хорошо. С помощью двух пар острый пинцет с идеально ровные советы, снимите прозрачную куколки кутикулы крыла: обеспечить куколки на дно и с помощью одной пары щипцов и аккуратно оторвать кутикулы используя вторую пару щипцов. После того, кутикула разрывается, очистить его от крыла. Будьте осторожны, чтобы не отключать крыла из куколки. После пилинга от кутикулы от крыла лезвие, продолжают пилинг кутикулы крыла петли (там, где крыло Chos расположены). </li><li> После пилинга с крылом кутикулы, можно попытаться отшелушивающим ногу кутикулы в подобной манере.Многие ноги, вероятно, будут потеряны в процессе, но, несмотря на низкую доходность, то этот шаг рекомендуется, поскольку она значительно улучшает окрашивания ног Chos. Chos из haltere и живота могут быть визуализированы без дальнейшего отшелушивающим кутикулы. </li><li> Поместите &quot;очищенные&quot; куколки в пробирку Эппендорфа заполнены метанола и держать при комнатной температуре. Продолжить отшелушивающим кутикулы всех куколок, и добавить их к той же трубе. По меньшей мере 10 хорошо очищенные куколки должны быть собраны для каждого окрашивания. </li><li> Удалите метанол и промыть три раза, 5 минут, с 95% этанола. Исправлена ​​куколок можно хранить в течение длительного периода времени в 95% этанола при -20 ° C. </li></ol> 3. Иммуноокрашивание личинок и куколок <ol><li> Вымойте фиксированной ткани с PBT в три раза, 30 минут при комнатной температуре. Личинки можно мыть с мягким тряски на вращающейся тарелке. Куколки моются без встряхивания. </li><li> Замените PBT блокирующим буфером (PBT + 5% нormal сыворотки козьего) и инкубировать ON при 4 ° C. </li><li> Удалите блокирующий буфер и инкубировать с первичными антителами (разбавленный в блокирующем буфере) ON при 4 ° C. </li><li> Промойте в четыре раза с PBT, как описано в шаге 3.1. </li><li> Удалить PBT и инкубировать с вторичными антителами (разбавленный в блокирующем буфере) ON при 4 ° C. </li><li> Мыть два раза PBT и один раз PBS, как описано в пункте 3.1. </li><li> Замените PBS с монтажной среды (Dako флуоресцентная Монтаж среднего (Dako Cytomation, Glostrup, Дания) и инкубировать при температуре 4 ° C ON. </li></ol> 4. Монтаж Личинки <ol><li> Личинки установлены на предметное стекло в каплю монтаж средств массовой информации с их кутикулу вниз и мышцах стенки тела вверх. Нанесите небольшое падение монтажа среды на чистую скольжения крышки и использовать его для покрытия подготовки. Не применять любое давление на смонтированном личинок. </li></ol> 5. Монтаж Куколки <ol><li> Приготовьте два слайды микроскопомс каплей установки среды, по одному для вскрытия, а второй для монтажа. </li><li> Положите несколько куколок на одном из слайдов. </li><li> Используя ножницы весной удалить головы и задней части брюшной полости. </li><li> Отделите спинной половине грудной клетки от брюшной половина резки между крыльями и ногами. </li><li> Поместите расчлененные части тела куколки на втором предметное стекло в каплю решение для монтажа. Убедитесь, что крылья и ноги вытянуты и стараются свести к минимуму наложение тканей как можно больше. </li><li> Поместите каплю монтаж среды на покровным стеклом и поместить его по образцу. Не давите на смонтированном образца. </li></ol> 6. Представитель Результаты Например иммуно-окрашенных Chos третьего возраста личинка показано на рисунке 1. Этот пример показывает, хорошо растягивается брюшной сегмент, в котором семь из восьми Chos четко видны. Нейроны являются лабораторииeled с MAb22C10 (1:20, полученные от Банка развития исследований Hybridoma в Университете штата Айова), шапки, связки, шапка-приложения и клетки связки вложений помечены анти-αTub85E (1:10, Клейн и др.. 2010). Вторичные антитела для флуоресцентной окраски были Cy3 или Cy5-сопряженных anti-mouse/rabbit (1:200, Джексон Immunoresearch Laboratories). Образцы были просмотрены с помощью конфокальной микроскопии (LSM 510, Zeiss). Кластер крыла Chos на вентральной радиальные вены на 35 часов от роду куколки показано на рисунке 2. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> Рисунок 1 (А) Схематическое изображение из шести типов клеток, которые составляют единый орган Ch. Крышка крепления (CA), шапка (C), scolopale (S), нейронов (N), связки (L) и связки вложений (LA ). LCh5 орган, в котором пять Chos сгруппированы, растягивается по всей группе боковых поперечных мышц (LT1-4). Боковые продольные мышцы (LL1), вентральных продольных мышц (VL1-4) и боковые косые мышцы (LO1) также показано на рисунке. Сухожилия клеток показано, как коричневые сферы (Взято из Klein и соавт., 2010). (B) один сегмент брюшка третьего возраста личинка посмотреть на 10-кратным увеличением. Семь из восьми Chos присутствует в каждом сегменте брюшка очевидны: пять боковых органов, которые вместе образуют pentascolopidial органа (LCh5), один боковой орган (LCh1) и один из двух вентральных Chos (VChB). Нейронов (N) в Chos помечены маркером нейронной MAb 22C10 (красный). Связки (L), шапка (C) и вложений клеток (Лос-Анджелес, Калифорния) помечены анти-αTub-85E (синий). Шапка и связки клетки дополнительно помечены ХО конкретных GFP репортер укрывательство регуляторного элемента из деи локус (Нахмана и соавт., Неопубликованные данные). <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> Рисунок 2. </sЧонг&gt; крыло хордотональные органов в брюшной радиальной жилки рассматриваются в 40-кратном увеличении. Нейронов (N) отмечены нейронов 22C10 маркера (красный, B). Связки (L) и крышки (C) клетки помечены совместно с анти-αTub85E антител (синий, С) и ХО конкретных GFP репортер трансгена (Нахмана и соавт., Неопубликованные данные).

<ol><li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li>
<li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li>
<li>Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+the+vibes%3A+chordotonal+mechanisms+in+insect+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).</li>
<li>Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Johnston%27s+organ+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Johnston's organ in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+adhesion+in+the+Drosophila+wing+is+mediated+by+Delilah%2C+a+potent+activator+of+%CE%B2PS+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression.</a> Dev Biol. 351, 99-109 (2011).</li>
<li>Field, L. H., Matheson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordotonal+organs+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chordotonal organs of insects.</a> Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).</li>
<li>Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+interdependent+TRPV+channel+subunits%2C+inactive+and+Nanchung%2C+mediate+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).</li>
<li>Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+ectodermal+attachment+cells+via+an+EGFR-dependent+mechanism+during+the+organogenesis+of+Drosophila+proprioceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors.</a> Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).</li>
<li>Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atonal+is+a+proneural+gene+that+directs+chordotonal+organ+formation+in+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system.</a> Cell. 73, 1307-1321 (1993).</li>
<li>Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+proneural+gene%2C+atonal%2C+in+formation+of+Drosophila+chordotonal+organs+and+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors.</a> Development. 121, 2019-2030 (1995).</li>
<li>Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRPV+family+ion+channel+required+for+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila.</a> Nature. 424, 81-84 (2003).</li>
<li>Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+and+contractile+systems+in+Drosophila+are+both+patterned+by+the+EGR+family+transcription+factor+Stripe%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe.</a> Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).</li>
<li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila%3A+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments%2C+developing+muscle%2C+and+testis+cyst+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li>
<li>Okabe, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+induction+of+chordotonal+organ+precursors+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis.</a> Development. 124, 1045-1053 (1997).</li>
<li>Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li>
<li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li>
<li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Протокол, описанный в этом видео дает возможность визуализировать проприоцептивной Chos во личинок и куколки. Исследования о строении и развитии проприоцептивной Chos были до сих пор ограничены главным образом эмбриональной стадии и личиночной имагинальной дисков. Таким образом, многие аспекты более поздних стадиях развития, как личинок и взрослых Chos, остаются в основном неизвестными. Описанный протокол, в сочетании с общим генетическим инструментов у дрозофилы, может быть использована для выявления и изучения новых генов и путей, которые играют определенную роль в более поздних стадиях развития Chos. Этот протокол был оптимизирован для визуализации ХО, но она может быть адаптирована для окрашивания других тканей, таких как куколки крылья 6.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента / инструмент </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Дюмон № 5 (или № 55), щипцы, Biologie наконечник </td><td> FST </td><td> 11252-20 и 11252-10 (Или аналогичный щипцы) </td><td></td></tr><tr><td> Аустерлиц нержавеющей стали насекомых булавками, minutiens 0,1 мм </td><td> Roboz хирургические инструменты сотрудничества </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 силиконового эластомера комплект </td><td> Корпорация Dow Corning </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas микро-ножницы (прямые, 7,5 см, лезвие 3 мм) </td><td> AS Mdeizintechnik GmbH </td><td> 11-590-00 </td><td> Vannas Весна Ножницы с идентичными спецификациями можно приобрести Roboz хирургические инструменты Ко </td></tr><tr><td> Орбитальный шейкер - Rotamax-120 </td><tг&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako флуоресцентная Монтаж среднего </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, Дания </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS разработки </td><td colspan="2"> 2 г / л KCl, 2 г / л KH 2 PO 4, 80 гр / л NaCl, 21,7 г / л Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> Качество PBS имеет решающее значение для успеха этого протокола </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> PBS X1 + 0,1% Твин-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Проприоцепция это возможность ощутить движение или положение частей тела, реагируя на стимулы, возникающие в организме. В fruitflies и других насекомых проприоцепции осуществляется специализированными органами чувств называется хордотональные органов (Chos) 2. Как и многие другие органы, у дрозофилы, Chos развивать два раза в течение жизненного цикла лету. Во-первых, личиночной Chos развиваться во время эмбриогенеза. Затем взрослый Chos начинают развиваться в личиночной имагинальной диски и продолжают дифференцироваться во время метаморфоза. Развитие личинок Chos во время эмбриогенеза была изучена 10,11,13,15,16. Центральное место в каждом ХО является сенсорный блок состоит из нейронов и scolopale клетки. Сенсорный блок растягивается между двумя типами вспомогательных клеток, которые крепятся к кутикуле через специализированные клетки эпидермиса вложений 1,9,14. Когда личинка мухи перемещается, относительное смещение электроннойpidermal клеток вложений приводит к растяжению сенсорные устройства и последующее открытие конкретных переходный рецепторный потенциал ваниллоидных (TRPV) каналов на внешнем сегменте дендритов 8,12. Вызвало сигнал затем передается опорно-двигательного центральной цепи генератора картина в центральной нервной системе. Несколько Chos были описаны у взрослых мух 7. Они расположены вблизи суставов у взрослых мух придатки (ноги, крылья и поводов) и в области грудной клетки и живота. Кроме того, несколько сотен Chos вместе образуют орган Джонстона во взрослом антенны, преобразовывать акустические в механическую энергию 3,5,17,4. В отличие от обширных знаний о развитии Chos в эмбриональной стадии, очень мало известно о морфологии этих органов в личиночной стадии. Кроме того, за исключением бедренной Chos 18 и орган Джонстона, наши knowledGE о развитии и структуре Chos во взрослой мухи очень отрывочны. Здесь мы опишем метод окрашивания и визуализации Chos в третьем личинок и куколок возраста. Этот метод может применяться вместе с генетическими инструментами, чтобы лучше характеризуют морфологию и понять развитие различных Chos в лету.

Метод immunostain и визуализировать хордотональные органов у личинок и куколок<em&gt; DROSOPHILA MELANOGASTER</em&gt; Описано.

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Проприоцепция — это способность ощущать движение или положение частей тела в ответ на стимулы, возникающие внутри организма. У плодовых мушек и других...

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации проприоцептивных кордональных органов у личинок и куколок дрозофилы. Для этого сначала выращивают и собирают личинок третьего возраста или куколок, после чего проводят диссекцию личинок или куколок. Затем образцы фиксируют для иммуноокрашивания.Затем фиксированные личинки или куколки подвергают иммуноокрашиванию с использованием соответствующих антител. Заключительным этапом является помещение окрашенных образцов на предметные стекла для микроскопии. В конечном итоге для визуализации кортновых органов используется конфокальная микроскопия.Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы о постсимбиотическом развитии и формировании паттерна проприорецепторов у oph. Хотя эта процедура может дать представление о развитии проприорецепторов, она также может быть применена к другим органам, таким как сенсорные органы других типов и сухожилия. Сначала подготовьте необходимые инструменты, растворы и флакон с личинками на стадии блуждания.Для личинок третьей стадии развития (third instar) держите растворы PBS и ФИКСАТОРА на льду. Возьмите одну из перемещающихся личинок третьей стадии со стенки флакона и поместите её в каплю ледяного PBS объемом 50 µL на препарировочную пластину из сигаретного эластомера, расположенную в чашке для культивирования тканей. С помощью диссекционного микроскопа зажмите личинку за крючки ротового аппарата тонким пинцетом, удерживая её дорсальной стороной вверх, и проткните мозг энтомологической булавкой.Захватите задний конец личинки пинцетом. Осторожно потяните и аккуратно растяните личинку вдоль ее оси. С помощью пружинных ножниц вставьте еще одну энтомологическую булавку между двумя задними сферическими сегментами.Сделайте два горизонтальных разреза в брюшной стенке перпендикулярно передне-задней оси, проходя максимально близко к передним и задним булавкам. Затем разрежьте брюшную стенку личинки вдоль дорсальной срединной линии от переднего к заднему разрезу. Удалите внутренние органы и трахеи с помощью тонкого пинцета.Затем осторожно промойте один или два раза раствором PBS. Захватите двумя пинцетами две створки брюшной стенки. Растяните их и закрепите на планшете с помощью двух энтомологических булавок с каждой стороны.Удалите PBS и добавьте 50 µL фиксирующего раствора. Инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. После удаления фиксатора и двукратной промывки раствором PBS извлеките энтомологические булавки с помощью пружинных ножниц.Отрежьте голову и хвост личинки, оставив прямоугольное филе. Перенесите фиксированную ткань в охлажденную пробирку Эппендорфа с PBS. После фиксации достаточного количества личинок можно приступать непосредственно к окрашиванию антителами.Если немедленное окрашивание не требуется, фиксированных личинок следует трижды промыть 95% ethanol в течение пяти минут каждая, после чего хранить в ethanol при температуре минус 20 градусов. Следите за пробирками так же, как при фиксации личинок, пока личинки третьей стадии не начнут линять. Проверяйте пробирки каждый час и отмечайте линявших личинок.С помощью тонкого пинцета перенесите помеченные куколки и дайте им развиваться от 30 до 40 часов при 24 °C или от 24 до 27 часов при 29 °C. Отберите от 20 до 30 куколок соответствующего возраста и поместите их в темный фарфоровый многолунковый планшет для диссекции. Будьте осторожны, чтобы не повредить исследуемые ткани.Затем извлеките куколки из их оболочек. Начните с отделения оперкулума и продолжайте до тех пор, пока куколка не будет полностью освобождена. Извлеките все куколки и поместите их в лунку, заполненную PBT.С помощью микродиссекционного ножа поместите пять куколок на плоскую поверхность между лунками диссекционного лотка. Отрежьте кончик головы и задний кончик брюшка. Удерживая куколку тонкими пинцетом, промойте ее внутренние органы, вводя PBT через переднее отверстие с помощью шприца объемом 1 ml.Кратковременно промойте диссекированную куколку, погрузив ее в лунку с PBS, и перенесите в холодный фиксатор в пробирку типа «эппендорф», помещенную на лед. Инкубируйте куколку в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день.Слейте фиксатор и промойте puby раствором PBT трижды, по пять минут на каждую промывку. Держите промываемый puby на льду. Заполните две лунки диссекционной формы раствором PBT.Используя полиэтиленовую пастеризационную пипетку, перенесите несколько куколок в одну из лунок. Затем перемещайте куколок по одной в следующую лунку.Используя два пары острых пинцетов с идеально совмещенными кончиками, зафиксируйте куколку на дне лунки, затем осторожно надрвите кутикулу. Удаление кутикулы крыльев является самым сложным этапом данной процедуры. На этом этапе мы неизбежно теряем часть крыльев, поэтому начинаем процедуру с относительно большого количества куколок.После того как кутикула будет разорвана, снимите ее с крыла, стараясь не отделить крыло от куколки. После удаления кутикулы с пластинки крыла продолжите снимать кутикулу в области основания крыла.После того как кутикула крыла будет отделена, можно попытаться аналогичным образом отделить кутикулу ног. В процессе этого многие ноги, скорее всего, будут утрачены, но, несмотря на низкий выход, этот этап настоятельно рекомендуется, так как он значительно улучшает окрашивание кортоновых органов ног. Поместите куколку в пробирку Эппендорфа с метанолом и выдержите при комнатной температуре.Продолжайте снимать кутикулу со всех puy и помещайте их в ту же пробирку, пока общее количество тщательно очищенных puy не достигнет как минимум 10. Перед каждым окрашиванием удалите метанол и трижды промойте образцы 95% ethanol, по пять минут за каждую промывку. Фиксированные puy могут длительно храниться в 95% ethanol при температуре минус 20 градусов до проведения иммуноокрашивания.Для того чтобы закрепить личинок, нанесите каплю среды для заключения на предметное стекло микроскопа, затем поместите личинок кутикулой вниз, а мышцами теловой стенки вверх. Нанесите небольшую каплю среды для заключения на чистое покровное стекло и накройте им препарат, не оказывая давления на закрепленных личинок. Для закрепления пубы.Сначала подготовьте два предметных стекла с каплей среды для заключения: одно для диссекции, другое — для монтирования. Поместите несколько куколок на одно из стекол, затем с помощью пружинных ножниц удалите голову и заднюю часть брюшка. Далее отделите дорсальную половину груди от вентральной, сделав разрез между крыльями и ногами.Поместите препарированные части тела куколки в каплю фиксирующего средства. На втором предметном стекле убедитесь, что крылья и ноги расправлены, и постарайтесь максимально избежать перекрытия тканей. Наконец, нанесите каплю фиксирующего средства на покровное стекло и накройте ею образец, не оказывая чрезмерного давления.На данной конфокальной микрофотографии иммуноокрашенных органов Кортона в личинках третьей стадии звездочки виден хорошо растянутый брюшной сегмент, в котором отчетливо просматриваются семь из восьми органов Кортона. Заметны пять латеральных органов, совместно образующих пенаско-липидный орган, один отдельный латеральный орган и один из двух вентральных органов Кортона. Нейроны органа Кортона помечены нейрональным маркером — моноклональным антителом 22 C 10 — и отображены красным цветом.Клетки колпачка и места прикрепления связки помечены антителами к тубулину 85 E и показаны синим цветом. Клетки колпачка и связки дополнительно помечены с помощью специфического GFP-репортера, содержащего регуляторный элемент локуса Delilah.На данной конфокальной микрофотографии куколки в возрасте 35 часов показаны кортональные органы крыла у вентральной радиальной вены. Нейроны помечены нейрональным маркером 22 C 10 и отображены красным цветом на панели B. Клетки связки и колпачка, а также кортональный орган, ко-маркированы антителами к α-тубулину 85 E и отображены синим цветом на панели C. Специфический GFP-репортерный трансген показан зеленым цветом.После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как визуализировать проприоцептивные кортоновые органы как в личинке, так и в куколке oph. При выполнении этой процедуры важно помнить, что она была оптимизирована для использования описанных антител. Другие антитела могут потребовать несколько иных условий фиксации и окрашивания.Таким образом, при использовании данной процедуры с различными антителами следует подобрать оптимальные условия для конкретных используемых антител.

visualization-of-proprioceptors-in-drosophila-larvae-and-pupae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Нейронауки

Личинки дрозофилы обеспечивают идеальную модель системы для исследования механизмов аксонального транспорта в личиночной сегментарных нервов. Используя эту процедуру, 3-й возраста личинок проведения различных мутаций можно сравнить с диким личинки типа.

Визуализация личинок Сегментные Нервы у 3 Й Инстар Drosophila Подготовка личинок

Мы описываем процедуру подготовки...

Визуализация Эмбриональные нервной системы в целом монтажа Drosophila Эмбрионы

Этот протокол описывает надежный метод обезболивания и обработки изображений...

В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

В этом видео мы опишем метод для живого изображения ячейки асимметричного деления органа чувств и клетки-предшественники клеток эпидермиса в...

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Источник: Чонг, С. Визуализация проекционного паттерна аксонов эмбриональных моторных нейронов у Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Это видео демонстрирует визуализацию проекций аксонов у эмбрионов Drosophila. Иммуномаркировка моторных нейронов, точное препарирование для выявления нейронных структур и дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия в совокупности позволяют выявить детальную архитектуру нейронов, подчеркивая проекционные паттерны аксонов.

Визуализация проекционных паттернов аксонов эмбриональных моторных нейронов у дрозофил

Этот протокол представляет собой эффективный метод визуализации нейроэпителия глаза куколки дрозофилы в живом виде. Этот метод компенсирует движение тканей и неравномерную топологию, улучшает визуализацию клеточных границ за счет использования нескольких GFP-меченых соединительных белков и использует легко собираемую установку для визуализации.

Live-визуализация Drosophila Куколки глаз

Мы опишем протокол для рассечения, фиксации и иммунных стероидогенных органов у дрозофилы личинок и взрослые самок для изучения стероидного биосинтеза гормонов и его механизма регулирования. Помимо стероидогенеза органов, мы визуализируем иннервации стероидогенных органов, а также стероидогенеза клеток-мишеней, таких как зародышевые стволовые клетки.

Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки<em&gt; Дрозофилы</em

В этой работе подробно описан метод иммуногистохимии для визуализации проекций моторных нейронов эмбрионов Drosophila melanogaster поздней стадии 16. Филеарный препарат фиксированных эмбрионов, окрашенных антителом FasII, представляет собой мощный инструмент для характеристики генов, необходимых для отслеживания моторного аксона и распознавания мишеней при развитии нервной системы.

Визуализация шаблона аксонной проекции эмбриональных моторных нейронов в<em&gt; Drosophila</em

Здесь мы представляем простой в использовании и универсальный метод для выполнения живых визуализации процессов развития в целом и мышц сухожилие морфогенеза в частности жизни дрозофилы куколок.

В естественных условиях Imaging мышц сухожилие морфогенеза в куколки дрозофилы

Здесь мы описываем протокол для визуализации аксональное ориентации с флуоресцентными белка в взрослых ноги дрозофилы , фиксации, монтаж, обработка изображений и шаги пост изображений.

Визуализировать дрозофилы ноги мотонейрона аксоны через взрослых кутикулы

Здесь представлен протокол для долгосрочной визуализации ноги дрозофилы в реальном времени на стадии куколки, включая полное удаление пупария. Этот протокол также может быть применен к другим тканям.

Долгосрочная визуализация развития ноги куколки дрозофилы после удаления пупария в реальном времени

Узнайте метод иммуноокрашивания для визуализации хордотональных органов в личинках и куколках Drosophila melanogaster. Этот подход позволяет изучать развитие проприорецепторов с помощью конфокальной микроскопии.

Визуализация проприорецепторов в

Больше видео