Name: GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 학습하세요 GIRK 채널 변조기를 식별하는 형광 검사 분석법을 AT20 세포와 형광 판독기를 활용하여. 이 고속 스크리닝 기법은 신경질환 치료제 발굴에 활용됩니다.

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1. 세포의 준비 <ol><li> 5% CO 2의 humidified 분위기에서 10 %의 목마 혈청 및 37 ° C에서 문화를 유지와 보완 Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM)에서 뇌하수체 AtT20 세포를 성장. </li><li> 표준 trypsinization 절차를 사용하여 세포에게 5-7일마다 subculturing하여 문화를 유지합니다. </li><li> 검정, 투명 하단의 문장은 우물, 폴리-L-라이신의 50 μL와 96 - 웰 플레이트. 우물은 인큐베이터에서 30 분 동안 건조하도록 허용합니다. </li><li> 물론 당 30,000의 세포 밀도에서와 3-4일 동안 배양기에 세포를 저장하는 200 μL 미디어를 포함하는 96 - 웰 플레이트에 플레이트 세포를. </li><li> 천천히 세포 단일층에서 문화 매체를 기음 한 끝에 진공에 연결된 마개 4리터 항아리와 다른 끝에 200 μL 피펫 팁으로 구성된 열망 설정을 사용합니다. </li><li> 정상적인 완충 용액 200 μL (132 MM NaCl, 5 KCl MM, 1m로 세포를 씻어M CaCl 2, 1 밀리미터 MgCl 2, 5 밀리미터 덱스 트로 오스, 5 밀리미터 HEPES, NaOH로 pH를 7.4). </li><li> 각도에 막 잠재적인 감광 염료 (MPD) DiBAC 4 (3) 또는 HLB 021-152 (5 μm의)를 포함하는 완충 용액 200 μL를 추가하고 37에서 40 분 대한 세포를 품어 ° C. </li></ol> 2. 시험 화합물과 세포 치료의 작성 <ol><li> Versette (ThermoFisher) 자동 액체 처리 시스템을 사용하여 화합물 라이브러리에서 테스트 화합물의 시리얼 희석 (DMSO의 주식 = 10 밀리) (96 - 웰 형식) 준비합니다. </li><li> , 96 - 웰 플레이트를 제거 AtT20 세포를 포함, 인큐베이터에서와 플레이트는 실내 온도로 돌아갈 수 있습니다. 오래된 버퍼를 기음과 세포에 MPD를 포함하는 새로운 버퍼 솔루션을 적용합니다. </li><li> 액체 처리 시스템은 다양한 시험 화합물의 농도 (10 NM 10 μm의까지) (2-20 μL) 및 제어 솔루션 (0.1 % DMSO)을 (버퍼 용액 containi에 적용 사용세포를 포함하는 96 - 웰 플레이트에 NG MPD). </li><li> 형광 측정에 대한 사전 테스트 화합물로 약 5 분 동안 세포를 품어. </li></ol> 3. GIRK 채널의 활성화, 형광 측정 및 분석 <ol><li> Biotek Synergy2 형광 플레이트 판독기에 96 - 웰 플레이트를 삽입하고 각각 여기 및 방출 520의 파장과 560 nm의에서 형광 배경 신호를 구하십시오. </li><li> Synergy2 인젝터 시스템을 사용 GIRK 채널을 활성화 (총 부피 = 220 μL)을 우물에 GPCR의 리간드 (somatostatin = 200 nm의 또는 carbachol이 = 10 μm의) 또는 제어 솔루션 (버퍼 혼자) (20 μL)을 적용합니다. 각각 여기 및 방출 520의 파장과 560 nm의에서 300의 샘플링 기간 동안 10의 간격으로 데이터 포인트를 수집합니다. </li><li> 시간 코스와 Biotek Gen5 소프트웨어를 사용하여 형광 변화의 피크 진폭을 확보하고 추가 분석을 위해 Excel로 데이터를 내보냅니다. </lI&gt; <li> 분석의 신뢰성을 결정하는 Z&#39; 팩터를 계산합니다. Z&#39; 팩터 결정에 사용되는 플레이트는 2 행 긍정의 각 (GPCR의 리간드)과 부정 (버퍼 혼자) 컨트롤이 포함되어 있습니다. Z&#39; 팩터과 같이 정의됩니다 : Z &#39;= 1 - (3σ P + 3σ N) / | μ의 P - μ N | μ P &amp; μ N은 긍정적인 제어 및 부정적인 제어 신호의 수단입니다, 그리고 σ P는 &amp; σ N 긍정적인 컨트롤의 표준 편차와 부정적인 제어 신호를 각각 6 있습니다. 0.5-1.0의 범위에서 Z&#39; - 요인 분석의 품질 6 우수한 것으로 나타났습니다. 0.5 아래 Z&#39;-요인과 플레이트는 분석에서 제외됩니다. </li><li> 형광 신호를 변조 화합물은 내향 정류기 K + 채널 특이성을 확인하는 바 2의 존재 + 또는 tertiapin-Q에 retested됩니다. </li></ol> 4. Representative 결과 GIRK 채널 분석을 사용하여 측정된 형광 신호의 예제는 그림 2에 표시됩니다. AtT20 세포 GPCR의 리간드 somatostatin (200 NM)의 추가는 HLB 021-152 형광 신호의 빠른 시간 종속적인 감소 (그림 2) 발생했습니다. 대조적으로, 제어 솔루션의 첨가 시간 (그림 2) 기준선에 반환되는 형광의 작은 순간적인 상승을 생산했다. 제어 및 somatostatin 솔루션으로 주입 96 - 웰 플레이트에서 최대 형광 값의 비교는 0.7에 0.5의 범위에서 Z&#39;-요인을 주었다. 자세한 부량 들어, 제어 레코드는 somatostatin 레코드에서 빼는되었고 결과 somatostatin에 민감한 신호는 (그림 2) 분석했다. 분석은 신속하게 GIRK 채널 조절 약물을 식별하는 방법을 제공합니다. 예를 들어, 마약 GIRK 차를 억제 그nnel는 세포에서 K + 유출을 방지하여 형광의 GPCR 리간드 - 중재 감소을 감소해야합니다. 차단 GIRK 채널 7, somatostatin-매개 형광 변화의 억제를 생산하는 그림 3, tertiapin-Q, 독소와 세포 치료에 나와 있습니다. Propafenone, 심장 8 블록 GIRK 채널도 형광 변화 (그림 4)를 저해하는 안티 arrhythmic 약물. 분석은 또한 GIRK 채널의 activators을 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 용액 (P&gt; 0.5)을 제어할 비해 그러나 에탄올의 응용 (100 &amp; 200 MM)는 GIRK 채널 2,3의 활성은 형광 신호의 큰 변화도 원인이 없습니다. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. GIRK 채널 형광 분석의 실험적 디자인. AtT20 세포 membran를 포함하는 버퍼에 incubated 있습니다전자 가능성에 민감한 형광 염료 (D). 염료 분자 세포에 입력하고 세포 내 단백질 (맨 위 패널)에 바인딩시 형광된다. 은 GPCR로 (Som) somatostatin의 바인딩 GIRK 채널 (하단 패널)의 활성화를 일으키는 G 억제 단백질을 (G I) 자극. K는 세포 밖으로 +의 후속 유출은 세포를 종료 것이 더 부정적와 염료 분자가 될 멤브레인 잠재됩니다. 따라서 형광 신호 감소 (하단 패널). <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig2.jpg" alt="그림 2"/> somatostatin 또는 제어 솔루션뿐만 동안 AtT20 세포에서 시간이 지남에 따라 측정 그림 2. 대표 HLB 021-152 형광 신호. 형광 강도 (F / F O)의 비율 (F O) 광고를하기 전에 측정 기준 신호에 의한 somatostatin의 존재 (F) (또는 제어 솔루션)의 신호를 나누어 계산somatostatin의 dition (또는 제어 솔루션). 각 포인트는 평균 ± SE 5-6 우물에서 얻어진을 나타냅니다. Somatostatin 또는 제어 솔루션은 시간이 영 (↓)에 추가되었습니다. 제어 솔루션의 추가는 형광 신호의 작은 과도 증가를 일으켰습니다. 이것은 솔루션의 주입에 의한 온도 변화에서 발생했습니다. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. tertiapin-Q (500 NM)와 AtT20 세포 치료로 묶는 방식과 GIRK 채널을 차단하여 형광 신호의 somatostatin-매개 감소를 억제. 각 포인트는 평균 ± SE 4-6 우물에서 얻어진을 나타냅니다. Somatostatin 시간이 영 (↓)에 추가되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3850/3850fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. propafenone (20 μm의)와 AtT20 세포의 치료도에서 somatostatin-매개 감소를 억제형광 신호. 각 포인트는 평균 ± SE 5-6 우물에서 얻어진을 나타냅니다. Somatostatin 시간이 영 (↓)에 추가되었습니다.

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<li>Bridal, T. R., Marquilis, M., Wang, X., Donio, M., Sorota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+Ether-%C3%A1-go-go+related+gene+screening+assays+based+on+IonWorks+Quattro+and+thallium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of human Ether-á-go-go related gene screening assays based on IonWorks Quattro and thallium flux.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8, 755-765 (2010).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

막 잠재력에 민감한 형광 염료가 이온 채널 조절 약물 9,10을 식별하는 데 사용되었습니다 있지만, 이것의 연결을 GIRK 채널 약물 발견에 대한 자신의 응용 프로그램의 첫 번째 보고서이다. 여기서 제시 GIRK 채널 형광 분석은 리간드 게이트 K + 채널의 심사를위한 빠르고, 신뢰할 수있는 실시간 방식을 제공합니다. 검정은 외인성 재조합 GIRK 채널 11 clonal 셀 라인 (AtT20, PC-12) 내생 채널을 표현하는 표현을 영원히 기억 세포 라인 (HEK293, CHO 등)을 포함한 세포의 광범위한 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. 또한, 분석 결과는 배아 줄기 세포 및 기본 세포 배양의 심사 의약품에 대한 적응 수 있습니다. AtT20 세포와 함께 사용로서 분석도 GIRK 채널에 여러 GPCR의 리간드 (somatostatin 및 carbachol)의 연구를 허용하는 추가 혜택을 제공합니다. 어떤 형광 분석과 마찬가지로 제어 실험은 전자로 수행되어야합니다...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> CellGro </td><td> 10-013 </td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 16050-114 </td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3603 </td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P4707 </td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S9129 </td></tr><tr><td> Carbachol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C4382 </td></tr><tr><td> HLB 021-152 </td><td> AnaSpec </td><td> 89,300 </td></tr><tr><td> Versette 자동 액체 처리기 </td><td> ThermoFisher </td><td> 650-01 </td></tr><tr><td> Synergy2 형광 플레이트 리더 </td><td> Biotek </td><td></td></tr><tr><td> Gen5 분석의oftware </td><td> Biotek </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비의 표.

girk 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G 단백질 문이 안쪽 정류기 K + (GIRK) 채널은 호르몬과 신경 전달 물질의 광범위한 셀룰러 중재자 역할과 뇌, 심장, 골격근 및 내분비 조직 1,2로 표현됩니다. GIRK 채널들은 플라즈마 멤브레인 바인딩된, G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)에 (신경 전달 물질, 호르몬, 약물 등) 리간드의 바인딩에 따라 활성화된다. 이 바인딩은 이후에 바인딩하고 GIRK 채널을 활성화 G 단백질 (G i와 G O)의 자극을 초래합니다. 일단 GIRK 채널은 K의 움직임 +에서 더 많은 부정이 될 가능성이 휴식 멤브레인를 일으키는 세포의 수 있습니다 열었습니다. 결과적으로 뉴런에 GIRK 채널 인증은 자발적인 행동 잠재력의 형성을 감소하고 흥분성의 신경 전달 물질의 석방을 억제. 마음에 GIRK 채널의 활성화함으로써 심장 박동을 둔화 맥박 조정기의 활동을 억제. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; GIRK 채널은 치료 neuropathic 고통, 마약 중독, 심장 arrhythmias 및 기타 장애 3에 대한 새로운 치료 대리인의 개발을위한 소설 대상을 나타냅니다. 그러나 이러한 채널 약리학이 크게 미개척 남아 있습니다. 안티 arrhythmic 대리인, 치료약의 약물과 항우울제를 포함한 약물의 숫자 GIRK 채널을 차단 있지만, 이러한 억제는 선택 아니므로 상대적으로 높은 약물 농도 3 시에 발생합니다. 여기서는 GIRK 채널의 새로운 변조기를 식별을위한 실시간 검사 분석을 설명합니다. 본 분석에서는 GIRK 채널을 표현의 연결을 AtT20 세포는 같은 비스 - (1,3-dibutylbarbituric 산)와 같은 멤브레인 가능성에 민감한 형광 염료와 함께로드됩니다 trimethine oxonol [DiBAC 4 (3)] 또는 HLB 021-152 (그림 1 ). 염료 분자 세포 (그림 1)에 강력하게 형광등 아래의 이해가된다. 치료GPCR의 리간드와 세포 열 GIRK 채널 자극. 세포의 결과 K + 유출 아웃 더 음수가 될 수있는 멤브레인 잠재력과 감소하는 형광 신호 (그림 1)을 일으 킵니다. 따라서 GIRK 채널을 통해 K + 유출을 조절 약물은 형광 플레이트 리더를 사용 assayed 수 있습니다. 다른 이온 채널 심사 assays 같은 원자 흡수 분광법 4 radiotracer 분석 5와는 달리, GIRK 채널 형광 분석은 빠른 실시간 저렴 심사 절차를 제공합니다.

G 단백질 문이 안쪽 정류기 K와 상호 작용하는 약물을 식별을위한 실시간 검사 절차<sup&gt; +</sup&gt; (GIRK) 채널이 설명되어 있습니다. 검정은 GIRK 채널 활동을 측정하는 막 잠재력에 민감한 형광 염료를 활용합니다. 이 기술은 세포 라인의 숫자에 사용하기위한 적응이다.

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

G 단백질 작동성 내향 정류 K+ (GIRK) 채널은 광범위한 호르몬과 신경전달물질의 세포 매개체로 작용하며, ...에 발현됩니다.

본 절차의 전반적인 목표는 grk 채널을 조절하는 새로운 약물을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 A TT 20 세포를 96 웰 플레이트에 도말함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 Verset 액체 플레이트 핸들링 시스템을 사용하여 테스트 화합물을 희석하는 것입니다.다음으로, 희석된 테스트 화합물을 verset을 사용하여 세포에 처리합니다. 마지막 단계로 96-well plate를 Synergy two 형광 플레이트 리더기에 삽입하고, 대조군 및 소마토스타틴 용액을 well에 주입합니다. 최종적으로, 형광 플레이트 리더기를 사용하여 소마토스타틴으로 유도된 형광 신호를 변화시켜 Grk 채널을 조절하는 화합물을 확인합니다.이 절차의 패치 클램프 기록(patch clamp recording)과 같은 기존 방법 대비 장점은, 다수의 화합물을 빠르게 스크리닝하여 이들이 gerk 채널을 조절하는지 여부를 결정할 수 있다는 점입니다. Gerk 채널을 활성화하여 FI 통각 수용성 전달의 억제를 유도하는 화합물을 식별할 수 있기 때문에, 이 기술의 영향은 통증 치료까지 확장될 수 있습니다. 96웰 플레이트 코팅 및 세포 플레이팅 절차를 시연하는 사람은 Maribel Vasquez입니다.실험실의 학생은 먼저 5% CO2가 포함된 습윤 환경의 37°C에서 10% horse serum이 첨가된 DMEM으로 pituitary ATT 20 세포를 배양하여 이 절차를 시작합니다. 표준화된 절차에 따라 5~7일마다 세포를 계대 배양하여 배양 상태를 유지합니다. 다음으로 black clear의 웰을 코팅합니다.96-웰 플레이트 바닥에 50 µL의 poly L lysine을 분주합니다. 인큐베이터 내에서 30분 동안 웰을 건조시킵니다. 그 후 과량의 poly L lysine을 제거하고, 200 µL의 배지가 포함된 96-웰 플레이트에 웰당 30,000 cells의 밀도로 세포를 접종합니다.그 후 세포를 인큐베이터에 3~4일 동안 보관합니다. 흡입 장치를 사용하여 세포 단일층에서 배양액을 천천히 흡입한 다음, 200 µL의 일반 완충액으로 세포를 세척합니다. 이어서, 막 전위 민감성 염료가 포함된 완충액 200 µL를 각각 첨가합니다.세포를 37°C에서 40분 동안 배양합니다. 40분 후, 인큐베이터에서 ATT 20 세포를 꺼내 실온으로 되돌린 다음, 기존의 버퍼를 흡입하여 제거합니다. 그 후 MPD가 포함된 신선한 버퍼 용액을 세포에 처리합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

출처: Rugjee, K. N., et al. 녹농균에서 c-di-GMP 신호 전달을 조절하는 소분자를 스크리닝하기 위한 고처리량 설정 구축.  J. Vis. 경험. (2016).이 비디오는 c-di-GMP 민감성 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 유전자 변형 박테리아를 사용하여 순환 di-GMP 조절제의 스크리닝을 보여줍니다. 형광은 서로 다른 테스트 화합물을 포함하는 멀티웰 플레이트에서 측정됩니다. c-di-GMP 생성을 억제하는 화합물은 형광을 감소시킵니다. 그런 다음 데이터를 분석하여 박테리아에서 c-di-GMP 신호 전달의 잠재적 조절자를 식별합니다.

형광 리포터 단백질을 발현하는 박테리아를 이용한 고리형 di-GMP 조절제의 스크리닝 

이 동영상은 형광 기반 분석을 통한 면역 조절 화합물의 스크리닝을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질 발현 카세트를 가진 형질전환 마우스 유래 T 림프구는 이러한 화합물로 처리됩니다. 향상된 GFP 신호와 감소된 GFP 신호를 통해 화합물의 자극 및 억제 효과를 각각 식별할 수 있습니다.

면역조절 화합물 스크리닝을 위해 엔지니어링된 림프구를 사용한 형광 기반 분석

이 비디오는 CXCR4 케모카인 수용체를 발현하는 교모세포종 세포와 관련된 세포 분석을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 염료를 사용하여 제제 상호 작용에 따른 형광 변화를 측정하여 세포 신호 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

CXCR4 상호 작용 제제의 식별을 위한 세포 분석

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

여기, 우리 소설 간격 접속점 세포 통신 분석 결과 갭 정션 변조 화학 약물 발견 및 독성 평가의 높은 처리량 검열에 대 한 설계에 대 한 프로토콜을 제시.

요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 분석 결과

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

이 프로토콜은 막 전위의 변화를 측정하여 전기적 막 단백질을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 상피 세포주에서 내인성으로 발현되는 여러 이온 채널의 기능적 판독을 위한 플랫폼을 제공합니다.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

학습하세요 GIRK 채널 변조기를 식별하는 형광 검사 분석법을 AT20 세포와 형광 판독기를 활용하여. 이 고속 스크리닝 기법은 신경질환 치료제 발굴에 활용됩니다.

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

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