Name: Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 인간 배아줄기세포와 유도만능줄기세포 배양에 적합한 마우스 배아섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 표준화된 절차는 줄기세포 연구의 재현성을 높입니다.

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. 2,007 Greber 외에 발표된대로 Activin에게 엘리사 프로토콜을 설정하기위한 박사 보리스 Greber에 대한 특별 감사합니다. 우리는 그래픽 개요를 준비하기위한 부인 모니카 Shevack들에게 특별히 감사를드립니다. 우리는 촬영 전, 동안의 모든 도움과 귀중한 제안 박사 Heiko Fuchs 매우 감사하고 있습니다. 우리는 MEFs와 CM의 지속적인 공급을 유지하기위한 Adjaye 연구실, 특히 엘리자베스 Socha의 모든 구성원에게 감사를 표합니다. 우리는 또한 그들의 영구 지원 MPIMG의 동물 시설에서 우리의 동료를 인정합니다. 이 작품은 부분적으로 맥스 플랑크 사회와 추진하는 사업 [BMBF, 보조금 번호 0315717A] ERASysBio의 파트너 + EU FP7의 방어율-NET 플러스 체계 하에서 지원 계​​획.

1. 마우스 배아의 섬유아 세포의 절연 (MEFs) 다음 두 단계는 아닌 무균 조건 하에서 수행됩니다. <ol><li> 경추 탈구하여 13 또는 14 dpc (일 이후 coitum)에서 임신한 쥐 (CF1, 할렌, 미국)를 희생. </li><li> 자궁 뿔을을 해부, 짧게 칼슘 2 + MG이없이는 PBS를 포함 팔콘 튜브에 70% (V / V) 에탄올과 장소에 린스 + (Gibco, Invitrogen). </li></ol> 다음 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 수행하고 멸균 악기를 사용하고 있습니다. <ol start="3"><li> 배양 접시에 자궁 뿔을를 삽입하고 태반과 태아의 SAC에서 각 배아를 구분합니다. </li><li> 머리와 붉은 장기를 해부, PBS로 씻고 깨끗한 배양 접시에있는 모든 배아를 넣습니다. 잘게 그것 피펫 것이 가능하게됩니다 때까지 멸균 면도날을 사용하여 조직을 말하다. </li><li> 0.05 %의 1 ML 추가 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Gibco, Invitrogen), inclu배아 당 DNase I (USB)의 딩 100 Kunitz 단위. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브에 조직을 전송 37시 15 분 동안 품어 ° C. 부화의 각 5 분 후, 철저하게하고 아래로 최대 pipetting하여 세포를 떼어 놓다. </li><li> 신선한 MEF 매체의 1 볼륨에 대해 추가하여 트립신을 Inactivate. MEF 문화 매체 (부품, 미디어 500 ML을 모든 구성 요소 및 필터를 섞어) : 450 DMEM의 ML, FBS 50 ML (10 % (V / V)), 200 MM L-글루타민 (1 / 100 (V / V)) 5 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신의 5 ML (1 / 100 (V / V)). </li><li> 5 분, (300 XG) 저속으로 세포를 원심 분리기, 신중 따뜻한 MEF 매체에 뜨는 및 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. </li><li> 플레이트 약 2 시간에 대해 0.2 % 젤라틴 (소 피부 타입 B, 시그마에서 젤라틴)로 코팅 각 T150 (TPP) 플라스크에 3-4 배아 것과 같습니다 세포의 수. 섬유아 세포 (P0, 통로 0) 젤라틴 코팅 flasks에 첨부할 수있는 기능을 가지고있는 유일한 세포입니다. </lI&gt; <li> 이상적으로, 세포는 24 시간 후에 80-90% 지류이며,이 단계에서 P0 세포의 주요 부분은 향후 사용을 위해 냉동 있습니다. </li><li> P3 또는 P4까지 P0 세포의 나머지 T150 플라스크 (들)을 확장한 다음 inactivate과 모이통는 hESCs를 replate하거나 에어컨 매체 (CM)을 생산로 사용합니다. </li></ol> 2. 불활 성화 및 도금 MEFs (피더 셀 준비) 모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 이루어졌습니다. <ol><li> 적어도 2 시간을위한 RT에서 0.2 % 젤라틴 및 부화와 코트 T150 flasks합니다. </li><li> mitomycin PBS에서 C (1 밀리그램 / ML)와 필터를 희석. </li><li> MEFs에서 미디어를 대기음 및 CA 2 + MG 2 +없이 PBS로 씻는다. </li><li> 10 μg / MEFs에서 mitomycin C의 ML을 포함하는 매체의 장소 20 ML. </li><li> 37에서 2 시간 동안 품어 ° 매체를 포함하는 mitomycin C와 C 그리고 PBS, trypsinize, 원심 분리기 (300 XG에서 5 분)과 따뜻한 매체 resuspend 세포로 두 번 씻는다. </li><li>56.000 세포 / T150 flasks의 cm 2의 농도에서 세포와 접시를 카운트하고 다음 6 일간 CM 제작을 위해 사용합니다. </li></ol> 3. 에어컨 매체 (CM) 준비 모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 이루어졌습니다. <ol><li> hESC 매체 (어 .. 무조건 중간) (0.5 ML / cm 2)와 MEF 매체를 교체 56.000 세포 / ㎝ 2의 밀도에 inactivated MEFs을 도금 후 일 4 NG / FGF2의 ML과 갓 보충. </li><li> 24 H 보육 후에 피더 flasks에서 CM을 모아서 4 NG / 모이통에 FGF2의 ML을 포함하는 신선한 hESC 매체를 추가하십시오. </li><li> 다음 6 일간이 절차를 반복합니다. 매일 저장소는 -20 ° C.에 CM을 수집 </li><li> 육일는 중간 및 필터 (코닝, 0.22 μm의, PAS)의 모든 aliquots를 섞어 후에. -80에서 50 ML aliquots 및 매장 만들기 ° C. </li><li> Matrigel에서 성장 hESCs에 추가하기 전에 추가 4 NG / FGF2의 ML과 CM을 보완. &lt;/ 리&gt; </ol> 4. 에어컨 미디어를 Activin 측정 (엘리사) 15 <ol><li> 모든 샘플 및 시약 실내 온도로 와요. </li><li> microplate에 추가, 1 % BSA와 PBS에 (인간 \ 마우스 \ 쥐 Activin MAb, R &amp; D 시스템) 항체를 캡처 (100 μl / 음)와 RT에서 밤새 품어 희석. </li><li> 24 시간은 블록 (1 % BSA / PBS 300 μl / 잘) RT에서 1 시간 동안 후 PBST (0.05 % 십대 초반 20과 PBS) (물론 300 μl /)와 우물 세 번 씻어 후. </li><li> 이 시간에는 Activin을 7 dilutions (30 NG / ML보다 농도 이하) 및 빈 샘플을 포함하여 (R &amp; D 시스템) 표준 곡선, 준비합니다. Activin의 선형 작동 범위는 0.25 사이 및 32 NG / ML입니다. </li><li> 우물 (물론 100 μl /)를 표준 및 샘플 중복을 넣고 RT에서 2 시간 동안 알을 품다. </li><li> 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으십시오. </li><li> 보조 (biotinylated) 항체 (인간 / 마우스 / 쥐 Activin MAb, R &amp; D 시스템을 Biotinylated) (0을 추가합니다.25 μg / ML 1% BSA / PBS) 및 RT에서 2 시간 동안 알을 품다. </li><li> 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으, Streptavidin-HRP를 (1 % BSA / PBS, R &amp; D 시스템에 희석) 추가하고 RT에서 20 분 동안 품어. </li><li> 우물 세 번 (PBST 300 μl)를 씻으, 기판 솔루션을 100 μl (Quantikine, R &amp; D 시스템)을 추가하고 어둠 RT에서 30 분 동안 품어. </li><li> 각도에 스톱 솔루션의 100 μl (Quantikine, R &amp; D 시스템)을 추가하고 가볍게 섞는다. </li><li> 물론 각각의 광학 밀도를 결정하기 위해 540 또는 570 nm의 파장에서 보정과 450 nm의까지 세트 Microplate 리더 (분자 소자 스펙트럼 최대 250 글로벌 의료 계측, 주식, 미네소타),. </li></ol> 5. 대표 결과 분리 절차의 전반적인 체계는 그림 1에 표시됩니다. hESCs 서로 다른 조건에서 배양해 hiPSCs의 전형적인 형태는 그림 2에 표시됩니다. 의 형태<html> MEFs 및 CM을 준비하는 데 사용 inactivated 피더 세포는 그림 3에 표시됩니다. 일반적으로 세포는 24 시간 이후 고립 합류 및 동결하거나 확장할 준비가되어 있어야합니다. 그러나, 가끔 합류 문화를 취득하기 전에 2-3일 걸릴 수 있습니다. CM은 통로 4, 늦어도의 세포에서 준비되어야한다. 일차 전지에만 노화의 발병 전에 4-5 구절에 대한 확장시킬 수 있기 때문에 이것은 중요합니다. 시토킨, Activin는 pluripotent 세포 14 undifferentiated 성장 지원을위한 피더 세포에 의해 분비 가장 중요한 요소로 간주됩니다. CM에를 Activin 수준의 측정은 (그림 4) MEFs의 품질을 모니터링하는 매우 편리한 정량 분석이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> 그림 1. MEFs 격리 절차의 개략도 표현. ontent &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> 그림 2. (A) 피더 세포, (B) 시설 매체 및 (C) 정의된 매체의 면전에서 배양해 undifferentiated hESCs의 전형적인 형태. (D, E) 피더 세포의 면전에서 배양해 hiPSCs의 전형적인 형태. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> 그림 3. 마우스 배아의 섬유아 세포의 전형적인 형태 (MEFs). () 항로 0 (P0) 도금 / 절연 이틀 후에, 56.000 세포 / ㎝의 밀도에서 (B) inactivated 피더 계층 2. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> 그림 4. 효소 결합 면역 분석 (엘리사) 기반 시설 매체 (CM) 홍보에를 Activin의 농도의 측정CF1 마우스 변형에서 파생 마우스 배아 섬유아 세포와 epared. CM는 6 일 동안 수집된 후 풀링된되었다. CM &quot;1&quot;과 CM &quot;2&quot;미디어 무조건 미디어 보시죠의 다른 일괄 처리를 참조하십시오. 에어컨 프로세스의 함수가 MEFs, Activin에 의해 매체로 분비를 Activin되면서, 음 거의 탐지가있다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기서 제시 MEFs 절연 절차는 hESCs과 hiPSCs을위한 표준화된 문화 조건의 설립을 가능하게합니다. 또한 피더 세포에 의해 시토킨 생산을 평가하는 데 사용 엘리사 기반 시스템은 MEF-파생 에어컨 미디어의 품질에 유용한 지표입니다. 지원 섬유아 세포를 제공하는 마우스 변형 (CF1)의 정기 점검은 문화 미디어의 배치 - 투 - 배치 변화를 방지하는 데 필요합니다. 더욱이, 그것은 동시에 세포의 일관된 품질을 얻기 위해 여러 생쥐에서 배아를 분리하는 것이 좋습니다. 물론 갓 격리 MEFs는 P0과 P1에서 냉동 보관 할 수 있습니다. 또한 inactivated MEFs는 세포 배양을위한 요구 사항에 따라 적절한 양의 aliquots에서 냉동 보관 할 수 있습니다. 보통 약 250.000 세포 문화 hESCs 및 IPS 세포에 6 - 잘 접시의 한 우물로 도금한다. 설립 및 최적화 방법은 정기적으로 diffe 간의 다양성을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다실험을 임대.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM (높은 혈당) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 진공 필터 시스템 </td><td> 코닝 </td><td> 431,097 </td><td> 500 ML, 0.22 μm의, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> 마네 DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> 마네를 빼앗아음 교체 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> 베타 - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 시그마 </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomycin C </td><td> 로슈 </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> 기본 Fibroblast 성장 팩터 </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin 항체 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> / 인간 / 마우스쥐 Activin MAb </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> 추가 얇은 홍채 가위 </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> 엑스트라 파인 Graefe의 집게 </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pierse 고정 집게 </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

culturing 인간의 배아와 유도 pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 fibroblast 세포의 준비

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

일반적으로 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs) 1 가변 조건 하에서 배양해 수 있습니다. 그러나 culturing위한 효과적인 시스템이 이러한 세포를 확립하는 것은 쉽지 않다. 문화 조건 hESCs과 hiPSCs의 pluripotency 수여 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 최적화 및 문화 방법의 표준화가 중요합니다. hESC 라인의 설립이 먼저 피더 세포와 태아 소 혈청 (FBS) 함유 배지 2로 MEFs를 사용하여 설명되었다. 다음으로, FBS는 hESCs 3의 증식을 향상 녹아웃 혈청 교체 (KSR)과 FGF2,로 대체되었습니다. 마지막으로, 공급기 - 무료 문화 시스템에 Matrigel 코팅 접시에 culturing 세포를 활성화 KSR-포함된 에어컨 매체 (매체가 MEFs에 의해 조건) 4. 그 후, hESCs 문화 조건은 화학적 defin에 피더 무료 문화쪽으로 이사5-7 에드 조건입니다. 또한, 외부의 무료 구성 요소를 사용 병원균과 동물 단백질 배양 방법에 의한 잠재적인 오염을 피하기 위해 8 설립되었습니다. 향상된 상태를 얻으려면 마우스 피더 세포는 인간 세포 라인 (예 : 태아의 근육과 피부 세포 9, 성인 피부 세포 10, 포피의 섬유아 세포 11-12, amniotic mesenchymal 세포 13)로 대체되었습니다. 그러나 인간의 포피 fibroblast 파생 피더 레이어를 사용하여 undifferentiated hESCs을 유지의 효율성은 14 Activin의 분비의 낮은 수준으로 인해 마우스 피더 세포의 그만큼 높은 아니다. 분명히, 마우스 및 인간 피더 세포에 의한 성장 인자의 생산에 분명 차이가있다. 마우스와 인간 피더 세포 transcriptomes의 분석은지지와 비지지 세포 사이의 중요한 차이점을 공개했다. 외인성 FGF2는 maintai 데 중요hESCs과 hiPSCs의 자기 갱신을 닝과 Tgfβ1, Activin와 피더 세포의 괴물 (BMP 길항제)의 표현을 규제하는 핵심 요소로 확인되었습니다. Activin은 OCT4, SOX2 및 hESCs 15-16의 NANOG의 표현을 유발을 보여줘왔다. 장기적인 문화의 경우 hESCs 및 hiPSCs들은 undifferentiated 상태를 유지하기 위해 mitotically inactivated MEFs이나 Matrigel - 코팅 접시에 MEF-CM (MEF-에어컨 중간)에서 피더없는 조건 하에서 재배 할 수 있습니다. 그들이 직접 hESCs의 성장에 영향을 미칠 이후 두 문화 조건의 성공은 완전히 피더 세포의 품질에 따라 달라집니다. 여기서는 마우스 배아 섬유아 세포의 격리와 문화 (MEFs)에 대한 최적화된 방법이 갖추어진 매체 (CM)과 미디어 사이를 Activin의 수준을 평가하는 효소 결합 면역 분석 (엘리사)의 준비를 제시.

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

일반적으로 인간 배아줄기세포(hESC)와 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)는 다양한 조건에서 배양할 수 있습니다. 하지만, 그것은...

본 절차의 전반적인 목표는 인간 배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포 배양에 적합한 마우스 배아 섬유아세포를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 각 배아를 분리하고 머리와 붉은색 장기들을 제거함으로써 수행됩니다. 그다음, 조직을 잘게 다진 후 최종적으로 소화시킵니다.그 후, 플라스크당 3~4개의 배아를 사용하여 세포를 플레이팅하고 확장합니다. 마지막으로, 불활성화된 myths를 사용하여 조건 배지를 준비합니다. 최종적으로, e LSA를 사용하여 다능성 줄기세포의 미분화 성장을 지원하는 조건 배지 내 활성 성분의 최적 농도를 보여줍니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 인간 배아 줄기세포와 유도 만능 줄기세포 모두의 미분화 성장을 가능하게 하는 고품질의 마우스 배아 섬유아세포를 생산하기 위해 절차의 표준화가 필요하기 때문입니다. 마우스 배아의 취급에는 특정 숙련도가 요구되므로, 배아의 분리 및 해부 단계는 학습하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 절차의 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Justina Suk과 대학원생인 Caterina Dres가 진행할 예정입니다.교배 후 13일 또는 14일 된 임신 마우스를 희생시킨 후 자궁각을 적출하고, 조직 배양 후드 내 무균 조건에서 70% ethanol로 짧게 헹군 뒤 PBS가 담긴 Falcon tube에 넣습니다. 자궁각을 Petri dish에 옮기고 각 배아를 태반 및 배아낭으로부터 분리합니다. 머리와 붉은색 장기를 제거하고, 남은 배아 조각들을 PBS로 세척한 후 멸균 면도날을 사용하여 깨끗한 Petri dish에 옮깁니다.마지막으로 조직을 피펫으로 취할 수 있을 때까지 잘게 다집니다. 다음으로, 0.05% trypsin-EDTA 1 mL와 배아당 100 K units의 DNase I을 첨가합니다. 그런 다음 조직을 50 mL Falcon tube로 옮기고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.5분마다 배양 후, 피펫팅을 충분히 하여 세포를 해리시킵니다. 갓 조제한 meth.Medium을 약 1배 부피만큼 첨가하여 트립신을 불활성화합니다. 세포를 저속에서 5분 동안 원심분리합니다.상청액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 따뜻한 meth 배지에 다시 현탁합니다. 0.2% 젤라틴이 코팅된 플라스크를 준비하여 최소 2시간 동안 배양합니다. 실온에서 약 3~4개의 배아로부터 얻은 세포를 각각의 0.2% 젤라틴 코팅 플라스크에 분주합니다. 섬유아세포만이 젤라틴 코팅 플라스크에 부착될 수 있는 능력을 가지고 있습니다.약 24시간 후, 세포의 밀도가 80에서 90%에 도달하면 일부 세포를 -80 °C에서 동결합니다. 향후 사용을 위해 나머지 세포를 P3 또는 P4까지 증식시킵니다. P3 또는 P4 세포를 사용하여 피더 세포(feeder cells)를 준비하려면, 먼저 T150 플라스크를 0.2% gelatin으로 코팅하고 상온에서 최소 2시간 동안 배양합니다.mitomycin C를 PBS로 희석하고 시린지 필터로 여과합니다. 배양액을 흡입하여 제거한 후 칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS로 세척합니다. 10 µg/mL 농도의 mitomycin C가 포함된 배양액 20 mL를 처리하고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.다음으로, 세포를 PBS로 두 번 세척하고 트립신 처리합니다. 배양 후 세포를 meth 배지에 현탁시킨 다음, 원심분리하여 세포 침전물을 얻고 따뜻한 meth 배지로 다시 현탁합니다. T150 플라스크에 cm²당 56,000 cells의 밀도로 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양하며, meth 세포를 분주한 다음 날까지 배양합니다.배양액을 4 ng/mL의 신선한 FGF2가 첨가된 HESC 무조건화 배지로 교체하고 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다. 24시간 후, 플라스크에서 조건화 배지를 수집하고 이를 신선한 HESC 배지로 교체합니다. 수집한 배지는 -20 °C에서 보관합니다.여섯 번째 수집 후 총 6일 동안 수집을 반복합니다. 모든 배지를 합쳐 여과합니다. 그런 다음 50 milliliter씩 분주하여 minus 80 degrees Celsius에서 보관합니다.조건 배지 내의 active in a를 측정하기 위해, 모든 시료와 시약을 상온으로 맞춥니다. 1% BSA가 포함된 PBS로 active in a 항체를 희석한 후, 마이크로플레이트의 웰에 100 µL씩 첨가합니다. 상온에서 하룻밤 동안 배양하여 24시간이 지나도록 합니다.PBST로 웰을 3회 세척합니다. 그다음 실온에서 1시간 동안 웰을 블로킹합니다. 그동안 0.25에서 32 ng/mL의 작동 범위를 사용하여 7개의 희석액과 공시료(blank sample)를 포함하는 활성 표준 곡선을 준비합니다.표준물질과 시료의 중복 시료를 웰에 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. PBST로 웰을 3회 세척합니다. 그다음, 비오틴화된 2차 항체를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.그런 다음 웰을 PBST로 3회 세척하고 streptavidin HRP를 첨가합니다. 혼합 후 기질을 첨가하고, 빛 차단을 위해 벽면을 감싼 뒤 상온에서 20분 동안 배양합니다. 각 웰에 100 µL의 정지액을 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.마지막으로, 마이크로플레이트 리더기를 540 nm로 설정하고 570 nm에서 파장 보정을 수행한 후, 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 다음은 피더 세포(feeder cells)가 포함된 배지, 조건화 배지(conditioned medium) 및 정의 배지(defined medium)에서 배양한 분화되지 않은 hESC의 전형적인 형태입니다. 본 예시에서 HI PSC는 피더 세포가 포함된 환경에서 배양되었습니다.이 이미지들은 조건 배지 준비에 사용되는 마이토스(myths) 및 비활성화된 피더 세포의 형태를 보여줍니다. 일반적으로 세포는 분리 후 24시간 이내에 합류(confluent) 상태가 되어 동결 또는 확장이 가능해야 합니다. 하지만 합류 배양 상태에 도달하기까지 2~3일이 소요될 수도 있습니다.조건화 배지는 반드시 계대 배양 4대 이하의 세포로 준비해야 합니다. 이는 일차 세포가 노화가 시작되기 전까지 4~5대까지만 확장될 수 있기 때문에 매우 중요합니다. a에 활성화된 사이토카인은 다능성 세포의 미분화 성장을 지원하기 위해 공급세포(feeder cells)가 분비하는 가장 결정적인 인자 중 하나로 간주됩니다.여기에 표시된 것처럼, 조건배지 내의 활성 수준을 측정하는 것은 메타볼라이트의 품질을 모니터링하기 위한 편리한 정량 분석법입니다. 마우스 배아 섬유아세포의 분리는 숙련된 상태에서 적절히 수행될 경우 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 미리 동물을 번식시키고 모든 기구를 사전에 준비하여 오토클레이브 멸균하는 것이 중요합니다.

preparation-mouse-embryonic-fibroblast-cells-suitable-for-culturing

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 3 부 1.

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이 작품은 세부 3D 섬유소의 준비 culturing 및 plutipotent 줄기 세포를 구별을 위해 공사장 공중 발판. 이러한 공사장 공중 발판이 아니라 약물 전달 시스템을 포함하도록 수정으로 줄기 세포의 행동에 대한 다양한 생물 학적 화합물의 효과를 차단하는 데 사용할 수 있습니다.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

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유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 비디오는 마우스 배아 줄기 세포에서 피질 중간뉴런 전구체를 생성하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 줄기세포의 증식 및 배아체(EB)로의 응집을 촉진하는 특정 소분자 억제제를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 수반합니다. 그 후, EB는 효소와 해리되고 접착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 웰에 도금되어 피질 중간뉴런 전구체로의 분화를 촉진합니다.

Generating Cortical Interneuron Precursors from Mouse Embryonic Stem Cells(마우스 배아 줄기세포에서 피질 중간뉴런 전구체 생성)

여기에서는 해리된 단일 세포의 비집락형 단층(NCM) 성장을 기반으로 하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배양 프로토콜을 제시합니다. Rho 관련 키나아제 억제제 또는 라미닌 동형(laminin isoform 521, LN-521)을 활용하는 이 새로운 방법은 다량의 동질적인 hPSC 생산, 유전자 조작 및 약물 발견에 적합합니다.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

이 프로토콜은 혈청에서 파생 마우스 배아 줄기 세포의 수집 (MESC) -conditioned 매체 (MESC-CM)하는 방법을 제공한다 (소 태아 혈청, FBS) - 및 공급 장치 (마우스 배아 섬유 아세포, MEFs에) 셀에 대한 - 무료 조건 - 무료 방법. 이는 노화 및 노화 관련 질환의 치료에 적용될 수있다.

무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기

이 문서는 효율적으로 파생 하 고 만능 마우스 배아 줄기 세포 라인 blastocyst 단계에서 문화 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

배우세요 인간 배아줄기세포와 유도만능줄기세포 배양에 적합한 마우스 배아섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법을. 이 표준화된 절차는 줄기세포 연구의 재현성을 높입니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

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