Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

본 절차의 전반적인 목표는 인간 배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포 배양에 적합한 마우스 배아 섬유아세포를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 각 배아를 분리하고 머리와 붉은색 장기들을 제거함으로써 수행됩니다. 그다음, 조직을 잘게 다진 후 최종적으로 소화시킵니다.

그 후, 플라스크당 3~4개의 배아를 사용하여 세포를 플레이팅하고 확장합니다. 마지막으로, 불활성화된 myths를 사용하여 조건 배지를 준비합니다. 최종적으로, e LSA를 사용하여 다능성 줄기세포의 미분화 성장을 지원하는 조건 배지 내 활성 성분의 최적 농도를 보여줍니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 인간 배아 줄기세포와 유도 만능 줄기세포 모두의 미분화 성장을 가능하게 하는 고품질의 마우스 배아 섬유아세포를 생산하기 위해 절차의 표준화가 필요하기 때문입니다. 마우스 배아의 취급에는 특정 숙련도가 요구되므로, 배아의 분리 및 해부 단계는 학습하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 절차의 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Justina Suk과 대학원생인 Caterina Dres가 진행할 예정입니다.

교배 후 13일 또는 14일 된 임신 마우스를 희생시킨 후 자궁각을 적출하고, 조직 배양 후드 내 무균 조건에서 70% ethanol로 짧게 헹군 뒤 PBS가 담긴 Falcon tube에 넣습니다. 자궁각을 Petri dish에 옮기고 각 배아를 태반 및 배아낭으로부터 분리합니다. 머리와 붉은색 장기를 제거하고, 남은 배아 조각들을 PBS로 세척한 후 멸균 면도날을 사용하여 깨끗한 Petri dish에 옮깁니다.

마지막으로 조직을 피펫으로 취할 수 있을 때까지 잘게 다집니다. 다음으로, 0.05% trypsin-EDTA 1 mL와 배아당 100 K units의 DNase I을 첨가합니다. 그런 다음 조직을 50 mL Falcon tube로 옮기고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.

5분마다 배양 후, 피펫팅을 충분히 하여 세포를 해리시킵니다. 갓 조제한 meth.Medium을 약 1배 부피만큼 첨가하여 트립신을 불활성화합니다. 세포를 저속에서 5분 동안 원심분리합니다.

상청액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 따뜻한 meth 배지에 다시 현탁합니다. 0.2% 젤라틴이 코팅된 플라스크를 준비하여 최소 2시간 동안 배양합니다. 실온에서 약 3~4개의 배아로부터 얻은 세포를 각각의 0.2% 젤라틴 코팅 플라스크에 분주합니다. 섬유아세포만이 젤라틴 코팅 플라스크에 부착될 수 있는 능력을 가지고 있습니다.

약 24시간 후, 세포의 밀도가 80에서 90%에 도달하면 일부 세포를 -80 °C에서 동결합니다. 향후 사용을 위해 나머지 세포를 P3 또는 P4까지 증식시킵니다. P3 또는 P4 세포를 사용하여 피더 세포(feeder cells)를 준비하려면, 먼저 T150 플라스크를 0.2% gelatin으로 코팅하고 상온에서 최소 2시간 동안 배양합니다.

mitomycin C를 PBS로 희석하고 시린지 필터로 여과합니다. 배양액을 흡입하여 제거한 후 칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS로 세척합니다. 10 µg/mL 농도의 mitomycin C가 포함된 배양액 20 mL를 처리하고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.

다음으로, 세포를 PBS로 두 번 세척하고 트립신 처리합니다. 배양 후 세포를 meth 배지에 현탁시킨 다음, 원심분리하여 세포 침전물을 얻고 따뜻한 meth 배지로 다시 현탁합니다. T150 플라스크에 cm²당 56,000 cells의 밀도로 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양하며, meth 세포를 분주한 다음 날까지 배양합니다.

배양액을 4 ng/mL의 신선한 FGF2가 첨가된 HESC 무조건화 배지로 교체하고 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다. 24시간 후, 플라스크에서 조건화 배지를 수집하고 이를 신선한 HESC 배지로 교체합니다. 수집한 배지는 -20 °C에서 보관합니다.

여섯 번째 수집 후 총 6일 동안 수집을 반복합니다. 모든 배지를 합쳐 여과합니다. 그런 다음 50 milliliter씩 분주하여 minus 80 degrees Celsius에서 보관합니다.

조건 배지 내의 active in a를 측정하기 위해, 모든 시료와 시약을 상온으로 맞춥니다. 1% BSA가 포함된 PBS로 active in a 항체를 희석한 후, 마이크로플레이트의 웰에 100 µL씩 첨가합니다. 상온에서 하룻밤 동안 배양하여 24시간이 지나도록 합니다.

PBST로 웰을 3회 세척합니다. 그다음 실온에서 1시간 동안 웰을 블로킹합니다. 그동안 0.25에서 32 ng/mL의 작동 범위를 사용하여 7개의 희석액과 공시료(blank sample)를 포함하는 활성 표준 곡선을 준비합니다.

표준물질과 시료의 중복 시료를 웰에 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. PBST로 웰을 3회 세척합니다. 그다음, 비오틴화된 2차 항체를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 웰을 PBST로 3회 세척하고 streptavidin HRP를 첨가합니다. 혼합 후 기질을 첨가하고, 빛 차단을 위해 벽면을 감싼 뒤 상온에서 20분 동안 배양합니다. 각 웰에 100 µL의 정지액을 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.

마지막으로, 마이크로플레이트 리더기를 540 nm로 설정하고 570 nm에서 파장 보정을 수행한 후, 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 다음은 피더 세포(feeder cells)가 포함된 배지, 조건화 배지(conditioned medium) 및 정의 배지(defined medium)에서 배양한 분화되지 않은 hESC의 전형적인 형태입니다. 본 예시에서 HI PSC는 피더 세포가 포함된 환경에서 배양되었습니다.

이 이미지들은 조건 배지 준비에 사용되는 마이토스(myths) 및 비활성화된 피더 세포의 형태를 보여줍니다. 일반적으로 세포는 분리 후 24시간 이내에 합류(confluent) 상태가 되어 동결 또는 확장이 가능해야 합니다. 하지만 합류 배양 상태에 도달하기까지 2~3일이 소요될 수도 있습니다.

조건화 배지는 반드시 계대 배양 4대 이하의 세포로 준비해야 합니다. 이는 일차 세포가 노화가 시작되기 전까지 4~5대까지만 확장될 수 있기 때문에 매우 중요합니다. a에 활성화된 사이토카인은 다능성 세포의 미분화 성장을 지원하기 위해 공급세포(feeder cells)가 분비하는 가장 결정적인 인자 중 하나로 간주됩니다.

여기에 표시된 것처럼, 조건배지 내의 활성 수준을 측정하는 것은 메타볼라이트의 품질을 모니터링하기 위한 편리한 정량 분석법입니다. 마우스 배아 섬유아세포의 분리는 숙련된 상태에서 적절히 수행될 경우 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때, 미리 동물을 번식시키고 모든 기구를 사전에 준비하여 오토클레이브 멸균하는 것이 중요합니다.