Name: 의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 CFTR 단백질을 발현하고 정제하는 방법을 GFP 태그를 활용하여 고효율로 대량 생산하는 기술입니다. 이 프로토콜은 낭성 섬유증 연구와 신약 개발에 중요한 기초를 제공합니다.

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우리는 CFTR 3D 구조 컨소시엄 (보조금 번호 FORD08XX0)를 통해이 작품을 자금에 대한 낭성 섬유증 재단 (CFF)을 감사드립니다. 우리는 CFTR 유전자의 디자인 특히,이 작품에 대한 컨소시엄 내의 모든 동료들의 거대한 공헌을 인정합니다. 우리는 또한 Drs의 소중한 기여를 인정합니다. 제임스 Birtley (NCSR Demokritos, 그리스), 마크 영 (카디프 대학교, 영국)과 데이비드 드류 (임페리얼 칼리지, 런던, 영국) 작업의 초기 단계 인치 우리는 특히 원고의 비판적 읽기를 위해 박사 인애 Urbatsch (텍사스 테크. 대학, Lubbock)에 감사드립니다.

1. 미디어와 버퍼의 작성 <ol><li> YNB : 일리터 들어, 1 난 물속에 uracil없이 아미노산과 0.77 g 완전한 보충 혼합없이 6.9 g 효모 질소 기지를 일시 중지합니다. 압력솥. 4 ° C.에 저장 </li><li> YNBA : 400 ML 들어, 아미노산없이 2.76 g 효모 질소 기지를 일시 중지, 350 ML 물에서 uracil과 8g 세균 한천없이 0.38 g 완벽한 보완 혼합물. 압력솥. 녹아 때까지 부드럽게 50 ML 물 및 열로 8g 포도당을 섞는다. 0.2 μm의 필터를 통해 Sterilise과 한천은 용융입니다면서 YNBA에 추가합니다. 상온에서 보관하십시오. </li><li> 20 % 포도당 매체 : 해산까지 500 ML 들어, 부드럽게 500 ML YNB와 더위와 100g의 포도당을 섞는다. 멸균 듀란 병에 0.2 μm의 필터를 통해 전달합니다. 상온에서 보관하십시오. </li><li> 20 %의 갈락토 오스 매체 : 해산 때까지 2리터의 경우는 부드럽게 2리터 YNB와 더위와 400g의 갈락토 오스를 섞는다. 멸균 듀란 병에 0.2 μm의 필터를 통해 전달합니다. 객실 템퍼에서 스토어ature. </li><li> 테아제 억제제 주식 : CFTR은 proteolysis 4 ~ 매우 쉽습니다. 저자는 독자들이 자신의 요구 사항을 충족 맞게이 목록에하실 수 있지만 다음 억제제가 proteolysis를 제한에 효과 발견. 동결 - 해동 문제를 줄이기 위해 -20 ° C ~ 100 μl aliquots의 상점. 모든 저해제들은 주식 솔루션에서 아래와 같은 작업 농도로 희석되어야합니다 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 억제제 </td><td> 주식 농도 </td><td> 주식 준비 </td><td> 근무 농도 </td></tr><tr><td> AEBSF </td><td> 200 MM </td><td> 1ml 증류수에 48mg를 해산 </td><td> 0.2 MM </td></tr><tr><td> Benzamidine </td><td> 300 MM </td><td> 1ml 증류수에 36mg를 해산 </td><td> 0.3 MM </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> 4 MM </td><td> 1ml 건조한 DM에 2.5mg를 해산SO </td><td> 4 μm의 </td></tr><tr><td> E-64 </td><td> 7 MM </td><td> 1ml 증류수에 2.5mg를 해산 </td><td> 7 μm의 </td></tr><tr><td> 류펩틴 </td><td> 20 MM </td><td> 1ml 증류수에 10mg를 해산 </td><td> 20 μm의 </td></tr><tr><td> Pepstatin </td><td> 15 MM </td><td> 1ml 건조 DMSO에 10mg를 해산 </td><td> 15 μm의 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 M </td><td> 1ml 건조 DMSO에 174mg를 해산 </td><td> 1 ㎜ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> DTT (1 M) : 1ml 증류수 154 MG dithiothreitol을 디졸브. -20 ° C.에 저장 버퍼의 1:1000 희석에 사용 지적했다. </li><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.5 M) : 100 ML 워터와 믹스 29.22 g ethylenediaminetetraacetic 산. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 모두 해산했으며 산도 8에 도달할 때까지 10 N NaOH dropwise를 추가합니다. 물 200 ML까지 만들어 멸균 듀란 병에 필터 0.2 μm의 통과. 상온에서 보관하십시오. </li><li> CRB (300 MM 트리스-HCL,산도 7.4, sorbitol 0.56 M, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))는 : 350 ML의 물에 18.17 g 트리스베이스를 해산하고 HCL의 추가에 의해 7.4로 산도를 조정합니다. sorbitol 51.35 g을 넣고 물 500 ML에 볼륨을 구성합니다. 압력솥. 4에 1 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 주식 솔루션 및 매장 ° C를 추가 </li><li> CFTR 버퍼 (50 MM 트리스, 산도 8.0 10 % V / V 글리세롤) : 500 ML의 물에 6.06 g 트리스베이스를 해산. HCL과 8 산도를 조절, 100 ML의 글리세롤을 추가하고 물 1 개 패까지합니다. 4 ° C.에서 압력솥 및 매장 </li><li> 50 MM 트리스-HCL (산도 7.6), 5 % 글리세롤, 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0), 0.02 % bromophenol 블루 4 % SDS, 0.05 M DTT :로드 염료를 2X. -20 ° C. 10 ML, 나누어지는 및 매장 만들기 </li></ol> 2. 상영 Transformants 이 프로토콜은 CFTR-GFP-8His 융합 유전자가 GAL1 갈락토 오스 프로 모터 (Fig.1)에 효모 플라스미드 스트림에 그 삽입되었음을 가정 플라스미드는 FGY217 세포, S.cerevisiae 10 돌연변이 Pep4 삭제로 변환되었습니다 </em&gt;. 세포 YNBA 조각 위에 성장과 4 ° C.에 몇 주 동안 저장될 수 장기 보관의 경우 글리세롤 주식이 이루어져야하며 -80에 저장된 ° C. 복제 및 변환하는 방법은 드류 외. (2008) 10에 의해 상세하게 설명되어 있습니다. <ol><li> 변환 접시에서 5-10 잘 구분하여 식민지를 선택하십시오. 20 % 포도당 매체의 9 ML YNB과 1ml를 포함하는 별도의 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 각 식민지를 전송합니다. 이 단계의 경우는 세포 성장을 유지하기 위해 문화의 2 % 포도당 (W / V)의 최종 농도가하는 것이 중요합니다. 궤도 떨고 배양기에서 30 ° C, 250 rpm을 16 시간 동안 밤새 성장. </li><li> 스크린 식민지 각각 글리세롤 주식을 만듭니다. 무균 표시된 나사 탑 튜브의 0.2 ML 멸균 글리세롤, -80에서 와동 간략 및 매장 ° C.에 하룻밤 문화의 0.8 ML 추가 </li><li> 20 % 포도당 배지 250 μl를 포함한 YNB 50 ML의 최종 볼륨에 남아있는 야간 문화를 희석.높은 포도당이 GAL1 발기인 10을 주체할 수 있기 때문에이 단계를 위해, 그것은 문화의 약 0.1 % (W / W)에 포도당 농도를 희석하는 것이 중요합니다. 분류 250 ML Erlenmeyer의 문화를 성장 250 RPM, 궤도 떨고 인큐베이터에서 30 ° C에서 0.7-0.8의 OD 600 flasks을 당황하고. </li><li> 각 플라스크 5 ML 20 %의 갈락토 오스 매체뿐만하여 문화를 유도 및 16 시간 동안의 성장. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 CFTR의 표현을 확인합니다. 문화 100 μl를 타고 용액에 세포 이동성을 제한하여 100 μl 글리세롤을 추가합니다. FITC 필터 (490 nm의 및 528-538 nm의의 방출 파장의 여기 파장)에서 청색 레이저를 사용하여 델타 비전 RT 복원 현미경 (또는 이와 유사한 것)에 세포를, Analyse. CFTR-GFP 융합 단백질의 긍정적인 표현은 효모 세포의 플라즈마 막에서 형광 고리로서 표시한다. Untransformed 효모 세포는 컨트롤로 사용할 수 있습니다. </li><li> 전송50ml 팔콘 튜브에 문화. 벤치 톱 원심 분리기에서 10 분 동안 3,500 XG, 4 ° C에서 원심 분리하여 세포를 수확. 원심 분리기가 실행되고 수시로 찾아내는 &#39;얼음 약 500 μl 산성 입힌 유리 구슬과 장소를 포함하는 나사 상판 2 개 ML의 microfuge 튜브를 준비합니다. supernatants을 취소하고 500-800 μl 심심풀이 CRB 각 펠릿을 resuspend 과 단백 분해 효소 억제제. 구슬을 포함 microfuge 튜브로 현탁액을 전송 얼음 계속. </li><li> 노골적인 협상 기간 사이에 얼음 쉬고 30 초 10 시간 동안 흔들어 / 각 microfuge 튜브를 vortexing하여 세포를 Lyse. beadbeater가 대안으로 고용 수 있고, 3 분 동안 운항 BioSpec 미니 beadbeater을 예. </li><li> 5 분 3,500 XG, 4 ° C에서 benchtop microfuge 및 원심 분리기로 튜브를 놓습니다. 얼음 microfuge 튜브와 장소를 청소하기 위해 원유 멤브레인 인구를 포함 supernatants을 전송합니다. 500 μl 신선한 아이스 공동 추가신분증 CRB 각 튜브에 테아제 저해제와의 세포막을 축적하는 과정을 반복합니다. </li><li> 2 시간 benchtop microfuge에서 최대 속도, 4 ° C에서 회전하여 원유 세포막을 수집합니다. 뜨는을 취소하고 50 μl 얼음 추위 CFTR 버퍼에있는 각 펠렛을 resuspend. </li><li> 깨끗한 microfuge 튜브에서 아래로 pipetting과이 15 μl 2X로드 염료 각 정지 15 μl를 섞는다. 10 분 동안 상온에서 품어. 이것은 SDS-불용성 집계를 형성하고 또한 GFP 태그를 변성하는 CFTR 및 기타 멤브레인 단백질의 원인이되므로, 샘플을 끓여야하지 마십시오. </li><li> 4-20% 트리스 / 글리신 구배 겔 (NuSep)쪽으로 PageRuler 플러스 prestained 단백질 기준 (Fermentas)와 함께 샘플을 로드할 40 분 150 V 혹은 때까지 염료 전면 겔의 하단에 있습니다 실행합니다. </li><li> 인 겔 형광에 의해 가장 높은 표현하는 세포를 식별합니다. 이러한 태풍 스캐너와 같은 형광 이미징 시스템에 장소. 젤 u를 스캔488 NM의 여기 파장의 청색 레이저와 526 nm의의 방출 파장을 노래. CFTR-GFP 융합은 약 220 kDa에서 볼 수 있어야합니다. 또한, 아마 본질적인 효모 유행 함유 멤브레인 단백질 11,12 (예 : 호박산 탈수소 효소의 subunit 등)은 약 70 kDa에서 보이는 약한 형광 밴드가 될 것입니다. </li><li> 편리한 이미지보기 소프트웨어 패키지를 사용하여 형광 검사에 대한 비교를위한 젤 destain 및 스캔, Coomassie로 젤 청바지. Coomassie 묻은 겔은 겔의 각 트랙에 싣게되는 총 단백질의 양에 대한 정상화 후 다른 clonal 라인에서 CFTR-GFP 표현 수준의 상대적인 평가를하실 수 있습니다. </li><li> 신선한 YNBA 진입은 글리세롤 주식 (2.2)에서 가장 높은 표현 세포주 밖으로 행진 2-3 일동안은 30 ° C에서 플레이트와 부화. 이 플레이트는 다음 4 ° C.에서 2 주간에 저장될 수 있습니다 </li></ol> 3. 대형 발효기 컬트우레 <ol><li> 발효기에 대한 사전 문화를 준비합니다. YNBA에서 세포 1cm 두 영역을 다쳤어요 플레이트 (2.13)은 살균 루프를 사용하고, 45 ML YNB 5 ML 20 % 포도당 매체로 OD 600 약 0.1이라는 등의 추가합니다. OD 600 1 도달할 때까지 궤도 떨고 배양기에서 250 rpm을, 30 ° C ~ 250 ML Erlenmeyer 당황하고 flasks 성장. </li><li> 실패하는이 2리터 Erlenmeyer 사이의 문화를 분할은 각 포함 450 ML YNB 25 ML 20 % 포도당 매체를 flasks. 250 RPM, 궤도 떨고 배양기에서 30 ° C에서 OD 600 1.2에 도달할 때까지에서 이걸 성장. </li><li> 이러한 사전 문화가 성장하고 수시로 찾아내는 &#39;발효기를 설정합니다. 같은 1.1에서 설명한 YNB의 11.2l 만들기 있지만, 추가로 8.28 g YNB과 유도에서 글리세롤의 추가 보상하기위한 보충 밖으로 0.95 g ​​강하를 해산. 무균 멸균 20리터 발효기 용기에 11.2 리터 YNB 75 ML 20 % 포도당 매체를 추가하고 실행 온도를 조절30 ° C. </li><li> 무균 발효기에 precultures를 추가하고 저어 속도를 설정 약 800 RPM으로 30에서 온도를 유지 ° C. 압축 공기는 약 15 DM 3 분 -1에서 흘러한다. 발효기 문화는 1.2 OD 600에 도달할 유발 무균 1.5 리터 YNB 20 %의 갈락토 오스 솔루션과 1.2 리터의 글리세롤을 추가하여. 25 ° C로 온도를 감소 및 16 시간 동안 문화를 성장. </li><li> 연동 펌프를 사용하여 얼음에 냉장 1리터 원심의 냄비에 발효기 내용을 전송합니다. 대용량 로터 (예 : 6리터)에서 30 분간 3,500 XG, 4 ° C에서 원심 분리하여 세포를 수확. 테아제 억제제 150 ML 얼음 추위 CRB에서 셀을 Resuspend. 여기서부터 모든 작업은 4 ° C.에 실시하여야한다 </li><li> 각각의 경우에 얼음 lysate를 수집, 25, 30, 32 35 kPa 4 패스의 지속적인 시스템 셀 계 장애 통과하여 세포를 Lyse. 또는 구슬 비테를 사용하여산성 입힌 0.5 밀리미터 유리 구슬의 동일한 볼륨 R (Biospec)와 전체 전원 3 분 동안 선동. 3500 XG, benchtop의 원심 분리기에서 15 분 동안 4 ° C에서 원심 분리하여 50ml 팔콘 튜브 및 펠렛 세포 파편에 lysate를 전송합니다. </li><li> 냉장 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. mitochondria 제거하는 원심 분리기에서 30 분 동안 14,000 XG, 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 냉장 ultracentrifuge 튜브에 뜨는 전송합니다. microsomes를 수집 ultracentrifuge 90 분 동안 200,000 XG, 4 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 가만히 따르다와 뜨는을 버리고 각각의 튜브로 프로 테아제 억제제와 1mM DTT와 2ml 얼음 추위 CFTR 버퍼를 추가합니다. 부드럽게 와동 믹서를 사용하여 CFTR 버퍼와 혼합 사용하여 각 튜브를 지상에서 페인트 브러시를 사용하여 알약을 resuspend. </li><li> ultracentrifuge 60 분 200,000 XG, 4 ° C에서 현탁액을 원심 분리기, 2 ML 얼음 추위 CFTR 버퍼 w에서 뜨는 및 resuspend 알약을 버리고ith 테아제 억제제 페인트 브러시를 사용하여 (아무 DTT). </li><li> 풀 resuspended microsomes, CFTR 버퍼 함께 50 ML에 최종 볼륨을 조절하고 잘 섞는다. 예약과 같은 2.9에서 설명한 SDS-PAGE 젤 분석을위한 1 ML의 나누어지는 - 2.11. microsomes 이제 플래시는 액체 질소에 냉동 있어야하고 필요한 ° C까지 -80에 저장하실 수 있습니다. </li><li> 리튬 perfluorooctonoate 산성 (LiPFO), tetradecanoly-리소 - phosphatidylglycerol (LPG14), N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) : CFTR은 다음 세제 중 하나를 사용 microsomes에서 추출 할 수 있습니다. CFTR 버퍼, 테아제 저해제와 5 %의 세제 (W / W)로 microsomes를 섞습니다. DDM을 사용하는 경우에도 버퍼에 NaCl 300 밀리미터를 추가합니다. 튜브 회전에서 15 분 동안 4 ° C에서 선동. </li><li> ultracentrifuge 1 시간 동안 100,000 XG, 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. 뜨는을 유지하고 SDS-PAGE 젤 분석을위한 작은 나누어지는 가져가라. CFTR 이제 고정화 금속으로 solublised 자료에서 정화 수 있습니다친화성 크로마 토그래피는 크기 배제 크로마 토그래피에 의해 따라갔다. </li></ol> 4. 대표 결과 CFTR 함유 플라스미드와 효모의 변환은 100 % 효율적이지 않습니다. 변환 실험에서 선택된 식민지에서 CFTR의 표현의 대표적인 소규모 스크린 단백질을 표현 4 식민지에서 이런것에 대해서를 얻을 것입니다. 접시에서 고른 다섯 식민지의 화면에서 전형 결과는 그림의 패널에 표시됩니다. 3. 식민지 중 하나는 일반적으로 그림과 같이, 250 kDa 및 130 kDa 마커 사이에 실행 CFTR-GFP 융합 단백질의 표현의 강한 수준을 보여줍니다. CFTR-GFP 형광 수준은 그림의 식민지 4, 실험 사이에 상당히 다릅니다. 약 70kDa의 본질적인 형광 밴드보다 3​​ 상영은 적어도 10 배 더 큰 형광. CFTR-GFP의 발현 수준은 70 kDa 밴드 미만 형광 줄 것으로 보인다면, 아마 다시 변화하고 식민지를 선택 가치CFTR-GFP의 표현의 높은 수준. 다른 이름으로 그림. 3A, 이건 CFTR-GFP 밴드는 Coomassie 염색법에 의한 세포 추출물에서 뚜렷한 것임에도 CFTR-GFP의 높은 발현 수준과 함께하지 않을 수 있습니다. 그림과 같이 일단 선택한 식민지, microsomes 이내 CFTR-GFP의 존재가 평가해야합니다, 고립 microsomes 큰 규모의 실험 재배하고있다. 3B. 본 실험의 결과는 microsomes가 신중하게 준비하고 있으며 그 proteolysis가 최소화되었는지 확인하는 것이 중요뿐만 아니라, 표현의 유도의 효율성을 평가하기 위해, 또한 있습니다. 결과는 그림. 3B는이 실험에서 CFTR-GFP 발현은 그러나 이번 인상이의 형광 검출기의 노출 과도에 의해 편향된되는 패널 A에서 표시된 소규모 실험에 비해 (같은 본질적인 70kDa 밴드에 대해 상대적 판단) 다소 낮은 것을 의미하지 측정. 실험자들이 checki 있었기 때문이였다CFTR이 구조의 proteolytic 조각의 존재에 대한 NG. 가 130 kDa과 100 kDa 마커 사이 형광 proteolytic 조각이 실험의 일부 증거이지만, 이들은 전체 길이 CFTR-GFP 대역에 비해 매우 약하다. 단백 분해 효소 억제제는 여기에 언급된, 우리는 세포 파손 후 CFTR의 proteolytic 저하에 대한 약간의 증거를 찾으십시오. 상당한 proteolysis가 관찰되는 경우, 우리는 신선한 테아제 억제제 주식 솔루션을 만드는 것이 좋습니다. 우리는 또한 상업 테아제 억제제 칵테일 알약이 체제에 효과적이지 않을 것으로 나타났습니다. 그림 4와 같이 16 넘어서 세포의 성장은 시간 (사후 유도)은 감소 CFTR 표현을 야기할 것입니다. 이것은 아마도 아마도 단백질의 매출, 효모 단백질 품질 관리 기계 6-9,13의 upregulation에 의한 때문입니다. 가능하면 최적의 시간이 세포에게 교장 기증이되어서, 갈락토 오스와 유도 후 CFTR 표현 수준을 모니터링하는 것이 바람직하다y를 한 연구실에서 다른 다릅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" /> 1 그림. 플라스미드 CFTR 구조 함유 효모. CFTR-GFP-8His 융합은 갈락토 오스 (GAL1) 발기인의 통제하에, 2μ p424GAL1 발현 벡터에 삽입됩니다. 벡터는 또한 uracil 선택 마커 (우라)와 암피실린 저항 유전자 (앰프)가 포함되어 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" /> 그림 2. 시각화된 프로토콜을 요약 흐름도. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" /> 그림 3. CFTR 표현과 정화의 대표 SDS-PAGE의 젤. 패널은 다섯 무작위 CFTR 표현을 위해 상영되었다 transformant의 식민지를 (차선 1-5) 포착 보여줍니다. 패널 B는 15리터 잠겼어으로부터 격리되었다 microsomes을 보여줍니다문화를 입력하십시오. 패널 C는 크기 배제 크로마 토그래피 다음 친화성 크로마 토그래피를 사용하여 2 단계 정화 후 얻은 murine CFTR 투석을 보여줍니다. 모든 젤류는 GFP 도메인 (왼쪽)에서와 Coomassie 후 흥미로운 형광이 (오른쪽) 얼룩 조명 조건에서 표시됩니다. 분자량 표준의 상대적인 위치는 왼쪽 (kDa)에 나열됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" /> 4 그림. 효모에서 CFTR의 표현을위한 대표적인 데이터입니다. 패널은 갈락토 오스와 유도 후 CFTR의 표현의 시간 과정을 보여줍니다. 세포 추출물을 SDS-PAGE로 분석되었으며, CFTR-GFP 단백질 밴드 GFP의 형광이 통합되었습니다. 패널 B는 세포를 16 시간 게시물 유도를 GFP-표현의 형광 현미경을위한 전형 결과를 보여줍니다. 일반적으로 세포의 일부만 높은 수준에서 CFTR을 표현.

<ol><li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR%29.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li>
<li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li>
<li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li>
<li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li>
<li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li>
<li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+complexes+%28ERACs%29+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+are+degraded+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+and+CFTR+folding+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li>
<li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li>
<li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li>
<li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on%5BTitle%5D)+AND+%22the+lectins+Htm1p%2FEDEM+and+the+Cdc48+protein+complex+in%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li>
<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

본 논문은 낭성 섬유증에 대한 연구를 촉진해야 효모 세포의 murine CFTR 단백질의 표현 방법을 제공합니다. 목적은 낭성 섬유증 재단 (을 통해 사용할 수 murine CFTR 유전자 구조의 릴리스로이 논문을 연결하는 것입니다 <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). 기타 orthologs 나중에 사용할 수있게됩니다. CFTR 함유 벡터와 효모 세포의 변환은 간단하지만, CFTR 높은 수준을 표현 식민지를위한 화면으로 중요합니다. 가변 표현 수준은 여러 가지 요인에서 발생할 수 있지만, 플라스미드 당 세포의 매수는 아마도 변화의 상당 정도를 차지하고 있습니다. 여기에 설명된 중요한 단계는 CFTR-표현 효모 세포와 microsomal 세포막을 CFTR 함유의 생산을 허용해야합니다. 일단 변형, 성장, 수확 및 효모 세포의 용해는 purif는 마스터했습니다단백질의 ication이 가능해야하고, 그림 3에서 우리는 유용한 벤치 마크로서이 경우에 달성해야 순수의 예제를 받고 있습니다. 그것은 단백질의 정제에 대한 자세한 방법론을 제공하기 위해 본 논문에서 우리 의도는 아닙니다. 그러나, 거기에 이러한 세포 용해 및 microsome 정화 등 S.cerevisae 표현 시스템에만 해당하는 몇 가지 중요한 다운 스트림 정화 단계이며, 이들은이 논문에서 자세히 포함되었습니다. 그것은 언급해야하지만, 따로 우리가 사용한 두 가지 방법에서 대체 효모 세포 파괴 방법은 같은 프랑스 압력 세포의 사용으로, 고용 수있다. 재조합 단백질은 단백질 (그림 4) 유도 후 추적할 수 있도록 TEV-cleavable의 C-말단 GFP 도메인을 가지고 있습니다. 효모 같은 조건 11이 이하 fluoresces는 유용한 상호를 제공할 수있는 고유 70kDa 단백질 (아마도 탈수소 12 호박산)가전체 세포 추출물이나 microsomes에서 CFTR의 상대 발현 레벨 nal 교정 표준 (그림 3). 그것은 갈락토 오스와 유도 후 세포 수확의시기가 중요한 것이 그림 4에 표시된 데이터에서 분명하다. CFTR 드롭의 수확량이 급격히 유도의 16에 대한 시간 후, 효모 세포에 감지 CFTR는 유도 24 시간 후에 거의가되도록. 단백질 정제의 수율은 15리터 발효기 배양 당 1-2mg CFTR 단백질에 관한 것입니다. 복구는 microsome 무대로 총 CFTR-GFP 단백질 최대의 70 % 정도로 추산하고, 단백질을 정제의 약 25 %의 복구를 할 수 있습니다. S.의 Characterisation cerevisiae - 표현 CFTR가 아직 진행 중입니다. 다른 이름으로 그림에서 본. 4 세포에서 단백질의 위치는 형광 현미경으로 모니터링할 수 있습니다. 형광의 정도가 예상되는 10 셀 주변으로 발견되지만 단백질 중 일부는 작은 반점이있는 로컬 라이제이션을 표시에서하거나, 또는단지 늦게 잠돌군 Zz / endosomal 통로 14 아마 응급실 4 교통 vesicles의 신진의 구획 스트림을 통해 재활용 CFTR 때문에 될 수 플라즈마 막 내부. PNGaseF, 단백질 deglycosylates 효소와 치료가 unglycosylated되는 뜻인, SDS-PAGE에서 CFTR 단백질 밴드의 마이 그 레이션에 최소한의 변화를 보여주거나 최소한의 글리코 실화 15있다. 단백질의 인산화 상태에 대한 실험이 진행되고 있습니다. 지금까지 테스트한 세제의 일부에 정화 단백질은 이전에 2,15을 발표 이들과 유사한 속도로 (그것은 CFTR 특정 억제제를 16에 의해 저해되는) ATPase의 활동을 표시합니다. CFTR 채널 활동의 측정은 비교적 높은 임계 마이셀 농도 (CMC) 17이 세제의 마지막 정화 단계를 의미하는 것이 정화 단백질의 reconstitution 필요합니다. 효모는 containin을 microsomesg CFTR 같은 일반적으로 &#39;약한&#39;것으로 간주되어 dodecyl maltoside 2 등 세제를 포함한 여러 일반적으로 고용 세제 18로 solublised 수 있습니다. 그러나 가장 높은 CMC 세제는 이러한 세제로 그 교류는 어떠한 정화 체계의 늦은 단계에서 고려되어야 제안, 지금까지 solubilsation 대​​한 비효율적일 수있다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 없음 </td></tr><tr><td> pep4 삭제 10과 FGY217 S.cerevisiae 변형, </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아미노산없이 효모 질소 기지 </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> uracil없이 보충 혼합물을 완료 </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> 세균 한천 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-갈락토 오스 </td><td> 어부 </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 어부 </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> 류펩틴 </td><td> 머크 </td><td> 108,975 </td></tr><tr><td> Chymostatin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl-leucylamido-부탄 (E-64) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Aminoethylbenzenesulfonyl 플루오르 (AEBSF) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Benzamidine 하이드로 클로라이드 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 434,760 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> dithiothreitol (DTT) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 43,815 </td></tr><tr><td> ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 어부 </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> 트리스-HCL </td><td> 어부 </td><td> P631 </td></TR&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> 065,017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> N-dodecyl-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 114,391 </td></tr><tr><td> PageRuler 플러스 prestained 단백질 기준 </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep 트리스-gly 4-20%의 기울기 젤 </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> 인스턴트 블루 Coomassie은 얼룩이 </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> 유리 구슬은 산성 세차 </td><td> 시그마 </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml 무균 팔콘 튜브 </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2ml멸균 나사 상단 튜브 </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ml 무균 Erlenmeyer 당황하고 flasks </td><td> BD Biosciences </td><td> 355,119 </td></tr><tr><td> 2리터 무균 Erlenmeyer는 flasks을 당황하고 </td><td> BD Biosciences </td><td> 355,131 </td></tr><tr><td> 2ml microfuge 튜브 </td><td> Sarstedt </td><td> 72.695 </td></tr><tr><td> 0.2μM 주사기 필터 </td><td> Sartorius </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> ultracentrifuge 튜브 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 355,618 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 튜브 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 357,000 </td></tr><tr><td> 1리터 원심의 화분 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 969,329 </td></tr><tr><td> orbital은 온도 제어 배양기를 흔들어 </td><td> 뉴 브 런 즈윅 과학 </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT 복원 현미경 </td><td> 응용 비전 </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop의 원심 분리기 </td><td> HERMLE </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Benchtop microfuge </td><td> 어부 </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> 와동 믹서 </td><td> 스타 실험실 </td><td></td></tr><tr><td> 태풍 트리오 스캐너 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 이미징 시스템 </td><td> 후지 </td><td></td></tr><tr><td> 20리터 발효기 용기 및 제어 장치 </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> 상수 시스템 셀 계 장애 </td><td> 상수 시스템 </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater 세포 장애 </td><td> BioSpec </td><td> 1,107,900 </td></tr><tr><td> 미니 beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 로토R </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 369,691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 Ultracentrifuge </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 392,050 </td></tr><tr><td> 50.2Ti 로터 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337,901</a> </td></tr></tbody></table>

의 낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)가 변이된 때, 따라서이 단백질에 상당한 관심이있다 humans.There의 낭성 섬유증을 야기할 수있는 염화물 채널이지만, 그 구조 및 활동을 연구하기위한 노력이 어려움에 의해 방해되었다 1-3 단백질의 충분한 양을 표현과 정화의. 많은 &#39;어려운&#39;진핵세포 멤브레인 단백질과 마찬가지로 빠르게 성장하는 유기체의 표현이 바람직하지만, 도전이며, 효모 S.의 cerevisiae는 지금까지 낮은 금액이 취득되었으며 재조합 단백질의 급격한 저하는 4-9을 관찰했다. 효모에서 재조합 CFTR의 처리에 관련된 단백질은 6-9를 설명하고있다.이 보고서에 따르면 우리는 상당한 금액의 효모와 정화의 CFTR의 표현을위한 방법론을 설명합니다. 프로토콜은 이전 proteolysis 문제를 극복할 수있는 방법을 설명하는 방법과 표현 수준CFTR은 크게 세포 수확 이전 특정 기간 동안, 세포 성장 조건을 수정하여하고 유도 조건을 제어함으로써 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜 (murine CFTR은 - 표현 효모 세포 또는 효모 plasmids)이 연구를 후원했다 미국 낭성 섬유증 재단을 통해 배포됩니다 연관된 reagants. CFTR의 디자인과 합성이 보고서에 사용된 개념 설명 문서 (.; Thibodeau, P. 외, 게시되지 않은 Urbatsch, 전) 별도로 게시됩니다. 플라스미드 포함 효모 (그림 1) -이 문서에서 우리는 CFTR은 구조와 효모 세포의 변화와 우리의 방법으로 시작을 설명합니다. 구조는 10의 C-말단에서 CFTR하는 융합 녹색 형광 단백질 (GFP) 시퀀스를 가지고 있으며, 드류 외 개발한 시스템을 따르고 있습니다. (2008). GFP는 CFTR의 표현과 정화가 비교적 쉽게 따라 할 수 있습니다. 주피터 시각 protoc효모 세포로부터 microsomes의 준비 후 똑똑한 마감재, 우리 microsomes에서 단백질의 정화를위한 몇 가지 제안을 포함 있지만. 독자들은 단백질과 그들에게 제공 로컬 장비로 실시되는 최종 실험에 의존 microsome 정화 절차로 자신의 수정 사항을 추가하실 수 있습니다. 효모-표현 CFTR 단백질이 부분적으로 내장 polyhistidine 정화 태그를 사용하여 금속 이온 친화도 크로마 토그래피를 사용하여 투석을 할 수 있습니다. 후속 크기 배제 크로마 토그래피는 SDS-PAGE와 젤의 Coomassie-염색법에 의해 판단,&gt; 90% 순수한 것 같습니다 단백질을 듭니다.

에 낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)를 표현하는 시도<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; 지금까지, 단백질의 상대적으로 낮은 금액을 굴복했습니다. 낭성 섬유증 재단을 통해 배포되는이 프로토콜과 관련 시약이 &#39;어려운&#39;진핵세포 막 단백질의 밀리그램 양의 준비를 허용해야합니다.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

낭성 섬유증 막관통 전도 조절기(CFTR)는 염화 이온 통로로, 돌연변이가 발생할 경우 ...에서 낭성 섬유증을 유발할 수 있습니다.

본 절차의 전반적인 목적은 Charmy Visier에서 밀리그램 양의 CFTR 단백질을 발현시키는 것입니다. 이는 먼저 50 밀리리터 세포 배양액에서 성장 및 발현 시험을 위해 TRANSFORMANT 콜로니를 선택함으로써 수행됩니다. 다음으로, 세포 용해물을 통해 CFTR을 발현하는 콜로니를 확인합니다.그 후 CFTR 발현 수준이 가장 높은 콜로니를 15 liter 배양기에서 배양합니다. 마지막으로, 세포를 용해하여 CFTR을 포함하는 마이크로솜을 준비합니다. 최종적으로 Ingel 형광 분석 및 형광 현미경을 통해 GFP 융합 CFTR의 발현과 추출 결과를 확인합니다.CFTR 발현을 위한 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 비용이 저렴하고 성장 속도가 빠르며 배양이 용이한 단순한 진핵생물 숙주를 사용한다는 점입니다. 또한, 녹색 형광 단백질 태그가 있어 발현 수준을 신속하게 모니터링할 수 있습니다. 마지막으로, 이 절차에서는 분자생물학적 단계가 최소화되었습니다.이 방법은 CFTR 단백질의 생물물리학적 특성과 같이 낭성 섬유증 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 정제된 단백질을 기반으로 한 새로운 약물 스크리닝으로 이어질 수 있기 때문에 낭성 섬유증 치료까지 확장됩니다. 단백질과 직접 상호작용하는 이러한 약물을 통해 새로운 범주의 약물이 개발될 수 있습니다.낭성 섬유증의 주요 결함은 더 구체적이어야 하며, 잠재적으로 다면적 효과가 더 적어야 합니다. 또한, CFTR의 고해상도 구조를 얻기 위해서는 다량의 단백질을 정제하는 것이 중요합니다. 단백질 구조 기반의 약물 설계는 기존 약물을 개선하고 잠재적으로 새로운 약물의 발견으로 이어질 것입니다.본 논문과 동반 영상의 출판은 Cystic Fibrosis Foundation을 통한 DNA 또는 형질전환 세포의 제공과 연계되어 있습니다. 해당 재료를 얻고자 하시는 경우, Cystic Fibrosis Foundation의 Elizabeth Joof에게 연락하시기 바랍니다. 재료 이전 합의서(materials transfer agreement)를 작성하셔야 합니다.이 방법은 Imperial College London의 David Drew와 그의 동료들이 소개한 막 단백질 발현을 위한 A GFP 태그의 활용에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 형질전환 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 형질전환 효율이 낮을 수 있으며, 양호한 발현 수준을 얻기 위해서는 세포 회수 시간이 매우 중요합니다.우리는 처음에 David Drew와 그의 연구팀이 우리 실험실을 방문했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 그들은 이 시스템을 사용하여 효모에서 발현 및 정제한 막 단백질의 구조 연구를 수행하고 있었습니다. 세포 형질전환, 유도 후 세포 성장 및 마이크로솜 분리가 까다롭기 때문에, 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요하며 이는 시약의 배포와 관련된 출판물과 연결되어 있습니다.또한 이 영상은 서로 다른 연구실에서 결과 값을 비교할 수 있도록 프로토콜을 표준화하는 데 도움을 줄 것입니다. 이 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Tracy Remington과 Natasha Kant가 진행하겠습니다. 논문의 공동 저자인 Liam o Ryan은 현재 뉴질랜드에 체류 중이며 이번 시연에 참여하지 못했습니다. C-F-T-R-G-F-P eight hiss 유전자를 인코딩하는 효모 플라스미드로 s visi 균주 FGY 2 1 7을 형질전환시킨 후, 형질전환 플레이트에서 서로 충분히 떨어진 콜로니 5~10개를 선택하십시오.각 콜로니를 9 mL의 효모 질소 기질 또는 YNB 배지와 1 mL의 포도당이 들어 있는 별도의 멸균된 50 mL Falcon 튜브로 옮깁니다. 스크리닝된 각 콜로니의 글리세롤 스톡을 만들기 위해 궤도 진탕 배양기에서 250 RPM, 30 °C로 16시간 동안 하룻밤 배양합니다. 라벨이 부착된 스크류 캡 바이알에 멸균된 글리세롤 0.2 mL를 넣고, 하룻밤 배양한 배양액 0.8 mL를 무균적으로 추가합니다.잠시 볼텍싱한 후 -80 °C에서 보관하십시오. 남은 overnight 배양액을 250 µL의 글루코스 배지가 포함된 YMB에서 최종 부피 50 mL가 되도록 희석하십시오. 라벨이 부착된 250 mL 배플 삼각 플라스크에 배양액을 넣고, 오비탈 쉐이킹 인큐베이터에서 250 RPM, 30 °C 조건으로 OD 600이 0.7에서 0.8이 될 때까지 배양하십시오. 각 플라스크에 5 mL의 갈락토스 배지를 첨가하여 배양액을 유도하십시오. 인큐베이터의 온도를 25 °C로 낮추고 16시간 동안 overnight 배양하십시오.배양물을 50 milliliter Falcon 튜브로 옮깁니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 3,500 ×g로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 산 세척된 유리 비즈 약 300 µL가 들어 있는 2 milliliter 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브를 준비하여 얼음 위에 둡니다.상청액을 버리고 각 펠렛을 프로테아제 억제제가 포함된 800 µL의 차가운 세포 재부유 완충액(CRB)에 다시 부유시킵니다. 부유액을 마이크로 튜브로 옮겨 얼음 위에 보관하십시오. 세포를 미니 비드 비터에 넣고 3분 동안 작동시킵니다.튜브를 벤치탑 마이크로 원심분리기에 넣고 4°C에서 3,500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 막이 포함된 상층액을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 얼음에 둡니다. 벤치탑 마이크로 원심분리기를 사용하여 4°C에서 최대 속도로 2시간 동안 원심분리하여 조막(crude membranes)을 수집합니다.상층액을 제거하고, 각 펠릿을 깨끗한 마이크로 원심분리관에 담긴 50 µL의 차가운 CFTR 버퍼로 재현탁합니다. 각 현탁액 15 µL를 2배 농도 로딩 다이 15 µL와 파이펫팅하여 혼합합니다.샘플을 끓이지 마십시오. 이는 CFTR 및 기타 막 단백질이 SDS 불용성 응집체를 형성하게 하고 GFP 태그를 변성시키기 때문입니다. 샘플과 미리 염색된 단백질 표준물을 4-20% glycine gradient gel에 로딩하고, 150V에서 40분 동안 전기영동을 수행하십시오. 겔 내 형광 분석(ingel fluorescence)을 통해 발현율이 가장 높은 세포를 식별하고 코마시 염색(kumasi staining)으로 발현을 확인한 후, 발현율이 가장 높은 세포주를 글리세롤 스톡에서 신선한 YNBA 플레이트에 스트리킹하고 30°C에서 2~3일 동안 배양하십시오.발효조용 전배양물을 준비하기 위해 플레이트를 4 °C에서 최대 2주 동안 보관하십시오. 멸균 루프를 사용하여 A-Y-N-B-A 플레이트에서 1 cm² 면적의 세포를 긁어내어 45 mL의 YMB와 5 mL의 포도당 배지에 첨가하여 OD 600을 약 0.1로 맞춥니다. OD 600이 1에 도달할 때까지 오비탈 쉐이킹 인큐베이터에서 250 RPM, 30 °C로 배양하십시오.배양액을 각각 450 mL의 YMB 배지와 25 mL의 포도당이 들어 있는 2 L 용량의 두 개의 배플 에를렌마이어 플라스크에 나누어 담습니다. OD 600이 1.2에 도달할 때까지 30 °C의 궤도 진탕 배양기에서 250 RPM으로 하룻밤 동안 배양합니다. 발효조를 준비하기 위해 11.2 L의 YNB를 조제하고, 유도 시 글리세롤 첨가분을 보충하기 위해 YNB 8.28 g과 드롭아웃 보충제 0.95 g을 추가로 넣습니다.다음으로 무균적으로 11.2 liters의 YNB와 75 milliliters의 포도당 배지를 멸균된 20 liter 발효조 용기에 넣고 작동 온도를 30 °C로 조절합니다. 그런 다음 무균적으로 전배양액을 발효조에 첨가합니다. 교반 속도를 약 800 RPM으로 설정하고 압축 공기 유량을 분당 약 15 dm³로 조절합니다.배양액의 OD 600이 1.2에 도달하면, 1.5 L의 갈락토스 배지와 1.2 L의 글리세롤을 무균적으로 첨가하여 유도합니다. 온도를 25 °C로 낮추고, 연동 펌프를 사용하여 배양액을 16시간 동안 성장시킵니다. 배양액을 얼음 위에 놓인 냉각된 1 L 원심분리 튜브로 옮깁니다.4°C에서 3,500 ×g로 30분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 프로테아제 억제제와 1 mM DTT가 포함된 150 mL의 차가운 micro zone Resus suspension buffer 또는 MRB에 세포를 다시 현탁합니다. 이 단계부터 모든 작업은 4°C에서 수행합니다. 세포 파쇄기를 사용하여 세포를 용해합니다.그런 다음 용해물을 50 milliliter falcon tube로 옮기고 3, 500 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심분리하여 세포 파편을 침전시킵니다. 미토콘드리아를 제거하기 위해 상층액을 냉각된 원심분리관으로 옮기고 14, 000 ×g, 4 °C에서 30분 동안 회전시킵니다. 다음으로 마이크로솜을 수집하기 위해 상층액을 냉각된 초원심분리관으로 옮겨 200, 000 ×g, 4 °C에서 90분 동안 원심분리합니다.상청액을 조심스럽게 따라내어 버리고, 각 튜브에 프로테아제 억제제와 1 mM DTT가 포함된 얼음처럼 차가운 CFTR 완충액 2 mL를 첨가합니다. 붓을 사용하여 펠렛을 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 각 튜브의 나머지 부분을 CFTR 완충액으로 채우고 볼텍싱합니다. 현탁액을 4 °C에서 100,000 ×g로 60분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고, 프로테아제 억제제와 1 mM DTT가 포함된 얼음처럼 차가운 CFTR 버퍼 2 mL를 사용하여 붓으로 재현탁 과정을 반복합니다. 재현탁된 마이크로솜을 회수한 후, CFTR 버퍼를 사용하여 최종 부피를 50 mL로 맞추고 잘 섞어줍니다. SDS page용으로 1 mL의 분취량을 따로 보관하고, 마이크로솜에서 CFTR을 추출할 때까지 마이크로솜을 -80 °C에 보관합니다.서면 프로토콜을 참조하십시오. CFTR 함유 플라스미드를 이용한 효모 형질전환 효율은 100%가 아닙니다. 형질전환 실험에서 선택된 콜로니를 대상으로 CFTR 발현 여부를 소규모로 스크리닝한 대표적인 결과에 따르면, 약 4개 중 1개의 콜로니에서 해당 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있습니다.플레이트에서 선택한 5개 콜로니의 스크리닝 결과입니다. 한 콜로니에서 C-F-T-R-G-F-P 융합 단백질의 강한 발현 수준이 나타납니다. C-F-T-R-G-F-P 형광 수준은 실험마다 상당히 다를 수 있으며, 4번 콜로니는 약 70 kilodaltons 부근의 내인성 형광 밴드보다 최소 10배 더 높은 형광을 보입니다.왼쪽에 표시된 것과 같이 C-F-T-R-G-F-P의 발현 수준이 높더라도, 오른쪽에 보이는 것처럼 쿠마시 염색을 통한 세포 추출물 내의 C-F-T-R-G-F-P 밴드는 식별되기 어려울 가능성이 큽니다. 이 그림은 마이크로솜 내에 C-F-T-R-G-F-P가 존재함을 보여줍니다. 이 실험 결과는 발현 유도 효율을 평가하는 것뿐만 아니라, 마이크로솜이 정밀하게 준비되었으며 단백질 분해가 최소화되었음을 확인하는 데 중요합니다.여기에 표시된 바와 같습니다. 세포를 16시간 이상 배양하면 CFTR 발현이 감소합니다. 이는 단백질 회전율(turnover) 때문일 가능성이 높으며, 아마도 효모의 단백질 품질 관리 기전이 상향 조절되었기 때문일 것입니다.따라서 유도 후, 겔 형광 및 형광 이미징을 사용하여 CFTR 발현 수준을 모니터링하는 것이 권장됩니다. 이 절차를 수행하는 동안, OD 600 측정값을 통해 세포 성장을 모니터링하는 것이 중요합니다. 규모를 확대하기 전에 먼저 소규모로 모든 과정을 시도하고, 시간에 따른 단백질 발현을 확인하십시오. 실험실마다 세포를 수확하는 최적의 시간이 다를 수 있으므로 유도 후 이를 확인해야 합니다.이 영상을 시청한 후, 효모 Scro Visier에서 밀리그램 단위의 CFTR 단백질을 발현시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 따르면, 추가적인 생화학적 및 생물물리학적 특성 분석을 위해 효모 마이크로솜에서 CFTR 단백질을 정제할 수 있습니다. David Drew와 그의 동료들에 의해 개발된 이 기술은 진핵생물 막 단백질의 발현 효율을 높이는 길을 열어주었습니다.우리는 전 세계의 연구실에서 저렴하고 간편한 발현 시스템을 사용하여 CFTR을 생산할 수 있게 함으로써, 이 연구가 낭성 섬유증 연구에 기여하기를 바랍니다. 본 연구는 낭성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation)과 CFTR 3차원 구조 컨소시엄(CFTR three dimensional Structure Consortium) 동료들의 지원이 없었다면 불가능했을 것입니다. 모든 재조합 생물체를 이용한 작업은 엄격하게 규제되므로, 모든 작업 시작 전에 취급 및 폐기 절차가 해당 규제 기관의 승인을 받아야 함을 잊지 마십시오.

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR), 상피 염화물 채널, 각종 단백질과 상호 작용하고 중요한 세포 과정을 조절하는 것으로보고되었습니다; 그들 가운데 CFTR PDZ 모티프-매개 상호 작용이 잘 문서화되었습니다. 이 프로토콜은 우리가 복잡한 신호 PDZ-의존 CFTR의 macromolecular를 조립하기 위해 개발된 방법을...

PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

이종 발현 및 낭포 성 섬유증 막 관통 전도 조정기 (CFTR)의 정제는 중요한 과제이며, 낭성 섬유증을위한 약물 요법의 개발에 제한 요소. 이 프로토콜은 구조와 기능 연구에 적합 CFTR의 밀리그램 수량의 분리를위한 두 가지 방법을 설명합니다.

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

단백질 상호 작용은 세포의 기능의 핵심이다. 열량 및 분광 기술은 일반적으로 그 특성을하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 Shwachman - 다이아몬드 증후군 (SBDS)에 돌연변이 단백질과 신장 인자 같은 1는 GTPase (EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성을 설명합니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

본 문서는 S. 세레비시아 및 HEK293T 세포 모두에서 단백질 자가 조립을 정량화하는 FRET 기반 유동 세포 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

유세포분석으로 생체내 단백질 자가 조립 검출 및 특성화

사전 형성된 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하면 세제와의 접촉 없이 정의된 지질 환경에서 무세포 합성된 막 단백질을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필수 시스템 구성 요소의 준비와 발현 효율성 및 샘플 품질을 개선하기 위한 중요한 파라미터를 설명합니다.

막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 CFTR 단백질을 발현하고 정제하는 방법을 GFP 태그를 활용하여 고효율로 대량 생산하는 기술입니다. 이 프로토콜은 낭성 섬유증 연구와 신약 개발에 중요한 기초를 제공합니다.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

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