내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

이 절차의 전반적인 목표는 인간 제대혈에서 내피 집락 형성 세포 또는 e CFC를 유도하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 제대혈에서 단핵 세포를 도금한 다음 E CFC의 집락 파생물을 복제하고 확장함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 클론 증식 가능성에 대한 새로운 단일 세포 분석 기술을 사용하여 in vitro에서 세포를 특성화하는 것입니다.

마지막으로, 세포는 nod skid 마우스에서 E CFC를 포함하는 젤의 생산 및 이식을 통해 in vivo vessel forming assay에서 특성화됩니다. 궁극적으로, de novo 숙주 혈액으로 채워진 혈관의 생체 내 형성은 세포 임플란트를 포함하는 ECFC의 h 및 e 염색으로 평가할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이러한 기술의 주요 장점은 이러한 방법을 통해 단일 세포 수준에서 내피 세포의 증식 가능성을 검사할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 함의는 야생 동맥 질환 또는 PAD와 같은 질병에 대한 진단 및 치료 도구를 찾는 것으로 확장될 수 있는데, 이 기술을 통해 환자의 내피 세포의 증식 잠재력과 생성 능력을 조사할 수 있기 때문입니다. 절차를 시작하기 전에 1ml의 쥐꼬리 콜라겐을 추가하고 6개의 우물 조직 배양 플레이트의 각 웰에 하나씩 입력한 다음 시술 당일 밤새 플레이트를 배양하고 15ml 단위의 제대혈을 50ml 원추형 원심분리 튜브로 분취합니다. 그런 다음 각 튜브에 PBS 20ml를 추가하고 혼합물을 위아래로 여러 번 피펫팅합니다.

다음으로, 15ml의 fial PA를 피펫에 넣고 피펫 끝을 희석된 혈액 튜브 바닥에 놓고 감속 브레이크 설정 없이 실온에서 30시간 G에서 740분 동안 튜브를 원심분리기 알파크 원심분리기 아래에 조심스럽게 놓습니다. 세포 분리 후, 전사 피펫을 사용하여 fial 피크와 희석된 플라즈마 사이의 계면에 위치한 저밀도 단핵 세포의 흐릿한 층을 제거합니다. 수집된 세포를 10mL의 E GM 2개 배지가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 분배하고 고감속 브레이크 설정으로 실온에서 515배 G에서 10분 동안 단핵 세포를 펠릿화하고 조심스럽게 흡인하고 상등액을 버립니다.

그런 다음 EGM 2 두 번 resus로 펠릿 세포를 세척 한 후, EGM 2에서 1.25 곱하기 10 밀리리터 당 일곱 번째 세포에 단핵 세포를 현탁시킵니다. 이제 4ml의 단핵 세포 현탁액을 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 피펫으로 넣고 첫날에 집락이 형성될 때까지 세포를 배양합니다. 배양 후, 느슨하게 부착된 세포를 방해하지 않고 피펫으로 웰에서 사용한 배지를 천천히 제거합니다.

그런 다음 4 밀리리터의 E GM 2를 웰에 조심스럽게 넣고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 군집은 일반적으로 시술 전날 5일에서 14일 사이에 나타납니다. 50 마이크로 리터의 쥐 꼬리 콜라겐.

이전과 같이 96웰 플레이트의 각 웰에 하나씩 입력하고 시술 당일 밤새 플레이트를 배양합니다. PBS로 두세 번 두 번만 계대배양한 세포를 세척하는 것으로 시작하십시오. PBS의 최종 세척을 흡인한 후 각 콜로니 주위에 멸균 젤 코팅된 클로닝 실린더를 놓고 멸균 겸자를 사용하여 각 실린더를 플레이트에 단단히 누릅니다.

각 클로닝 실린더에 따뜻한 triple E express 2-3방울을 넣고 세포가 분리되기 시작할 때까지 3-5분 동안 실린더를 배양합니다. 세포가 약 250마이크로리터의 EGM에서 분리되기 시작한 후 두 개의 매체를 실린더 중앙과 피펫 위아래로 하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 이제 각 클로닝 실린더의 단일 세포 현탁액을 개별 마이크로 원심분리기 튜브로 개별적으로 옮깁니다.

렌티바이러스를 발현하는 EGFP로 6웰 플레이트의 세포를 감염시키고 형광 세포분석으로 EGFP를 발현하는 세포를 수집합니다. 그런 다음 EEG FP 양성 세포와 EGM 2를 콜라겐 코팅 플레이트에서 배양합니다. E CFC가 준비되면, 방금 시연된 대로 트립 E 익스프레스를 사용하여 세포와 e GM 2 배지를 약 10 내지 밀리리터당 6번째 세포의 최종 농도로 현탁시킵니다.

그런 다음 초당 20개의 세포의 낮은 유속을 가진 유속 분류기를 사용하여 웰당 하나의 단일 EGP 양성 ECFC를 이전에 준비된 콜라겐 코팅된 96웰 플레이트에 분류하고 EGM으로 각 웰의 최종 부피를 2개에서 웰당 약 200마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 도립 형광 현미경을 사용하여 각 웰에 하나의 세포만 포함되어 있는지 확인합니다. 배양 14일째에 두 번의 배지 변경으로 2주 동안 플레이트를 배양합니다.

100 마이크로 리터의 4 % 파라 폼 알데히드로 30 분 동안 세포를 고정하기 전에 100 마이크로 리터의 PBS로 각 웰을 세척하십시오. EGFP를 발현하지 않는 e CFC의 경우, 파라 포름알데히드 고정 후 녹색 형광 핵 염료인 cyt 시약을 첨가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 형광 현미경을 사용하여 확장된 내피 세포의 수를 시각적으로 정량화하십시오.여기에서 입증된 바와 같이, 내피 세포 수가 2에서 50인 웰은 내피 세포 클러스터로 간주됩니다.

51 - 2000개의 세포가 있는 웰은 낮은 증식 전위 e CFCs이고 2001 이상의 웰은 높은 증식 전위 e CFCs로 간주됩니다. 이전과 같이 triple E express로 세포를 분리한 후 hemo, cytometer 및 trian blue로 세포 배양의 생존 가능한 세포 수를 얻습니다. 240만 개의 생존 가능한 세포를 50ml 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 세포가 스핀다운되는 동안 원심분리로 세포를 펠릿

겔 매트릭스의 구성 요소를 철저히 혼합한 다음 용액을 얼음 위에 유지하면서 수산화나트륨으로 pH를 7.4로 조정합니다. 상등액을 버린 후 펠릿을 360마이크로리터의 따뜻한 e GM 2에 재현탁합니다. 그런 다음 840 마이크로 리터의 겔 매트릭스 용액을 세포에 첨가하고 세포가 겔에 완전히 현탁 될 때까지 용액을 조심스럽게 혼합합니다.이 1 밀리리터의 셀룰룰라 화 겔 현탁액을 12 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰로 옮기고 겔이 중합 될 때까지 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 밤새 배양하기 전에 다음날과 이식 직전에 2ml의 따뜻한 EGM 2로 젤을 부드럽게 덮습니다. 홍채 가위를 사용하여 젤을 두 개의 동일한 조각으로 해부하고 젤 조각을 e GM 두 개의 배지를 포함하는 동일한 배양 웰로 되돌립니다. 발가락 꼬집으로 진정제를 확인한 후 마취된 5-6주 된 아기의 하복부를 면도하고 마우스를 미끄러지게 한 다음 알코올과 베타딘 패드를 회전시켜 수술 부위를 철저히 청소합니다.

다음으로, 멸균 날카로운 홍채 가위를 사용하여 복부 아래쪽 사분면을 약 5mm 절개하여 피부와 복부 근육 사이의 피하 공간을 노출시킵니다. 무딘. 복부의 두 다른 영역에서 복부 근육의 진피층을 절개하여 15-20mm 너비의 주머니를 만들며, 하나는 상복부 사분면으로 이어지고 다른 하나는 복부의 다른 영역으로 이어집니다. 그런 다음 진피층을 들어 올려 절개 부위에

젤 절반 조각을 한쪽 복부 주머니에 삽입하고 다른 절반 조각의 젤을 다른 복부 주머니에 삽입합니다. 젤을 삽입한 후 절단 바늘에 5개의 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 2-3바늘로 절개 부위를 닫습니다. 케이지 카드에 라벨을 붙이고 기관 및 프로토콜 요구 사항에 따라 수술 후 모니터링 및 진통제를 수행합니다.

이식 14일째에 동물을 희생시킨 후 알코올 패드로 쥐의 복부를 면봉으로 닦고 원래 절개 라인까지 피부를 자릅니다. 그런 다음 피부의 절제 플랩이 젤의 가능한 위치에 끼어 들었습니다. 젤 주위를 둘레로 잘라 각 보형물을 제거한 다음 절제된 보형물을 아연 고정제에 넣습니다.

이 ECFC 유도 기법을 사용하여 우리는 빠르면 5일째부터 1차 군체 형성의 성장을 관찰했습니다. 화살촉으로 표시된 것처럼 오늘날 5 가지 ECFC 문화의 조약돌 형태에 주목하십시오. 확장된 군체는 내피 항원을 발현하지만 조혈 항원은 발현하지 않습니다.

내피 세포와 조혈 세포의 대표적인 체외 표현형 평가에서 나타난 바와 같이, 면역표현형분석은 e CFCs가 CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL 1, flick one, flip four, NRP 2와 같은 내피 항원을 발현하지만, 조혈 항원, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR 4 또는 CD 1 33은 발현하지 않음을 밝혔습니다. 중요한 것은, 이 막대 그래프에서 볼 수 있듯이, 확장된 콜로니는 단일 세포 수준에서 2개에서 50개의 세포로 구성된 클러스터에서부터 2001 이상의 콜로니에 이르기까지 클론 증식 전위의 완전한 계층을 나타낸다는 것입니다. 녹색 형광 핵 염료인 cyt로 염색된 집락의 이러한 현미경 사진은 제대혈에서 유래한 E CFC를 14일 동안 단일 세포 수준에서 배양한 후 얻었습니다.

더욱이, e CFC는 면역 결핍 마우스에 이식될 때 숙주 적혈구가 관류되는 인간화 혈관을 형성합니다. CELLULARIZE 젤 임플란트를 함유한 제대혈 유래 ECFC의 이러한 h 및 e 염색에서, 이식 14일 후 콜라겐 피브로넥틴 겔에 형성된 숙주 적혈구로 채워진 미세혈관을 관찰할 수 있습니다. 여기서, 갈색으로 염색된 anti-human CD 31은 이러한 혈관의 인간 기원을 더욱 확인시켜줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 제대혈에서 e CFC를 추출하는 방법과 ECFC 집락이 발달한 후 기능을 복제, 확장 및 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 혈관 내피 연구자들이 여러 출처에서 얻은 내피 세포의 내피 클론 증식 잠재력 및 유전 능력을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.