내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

본 절차의 전반적인 목적은 인간 제대혈로부터 내피 콜로니 형성 세포(endothelial colony forming cells, eCFCs)를 유도하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 제대혈에서 단핵구를 플레이팅한 후, eCFCs의 콜로니 성장물을 클로닝 및 확장함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 클론 증식 잠재력을 평가하기 위한 새로운 단일 세포 분석 기술을 사용하여 세포를 in vitro에서 특성화하는 것입니다.

마지막으로, nud/nud 마우스에 ECFC가 포함된 겔을 제작하여 이식함으로써 in vivo 혈관 형성 분석을 통해 세포의 특성을 분석합니다. 최종적으로, ECFC가 포함된 세포 이식물의 H&E 염색을 통해 숙주의 혈액으로 채워진 새로운 혈관의 in vivo 형성을 평가할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 수준에서 혈관 내피 세포의 증식 능력을 조사할 수 있다는 점입니다.

이 기술은 환자의 혈관 내피세포의 증식 잠재력과 유전적 능력을 조사할 수 있게 해주므로, 말초 동맥 질환(PAD)과 같은 질병의 진단 및 치료 도구를 찾는 데 응용될 수 있습니다. 실험을 시작하기 전, 6-well 조직 배양 플레이트의 각 웰에 1 mL의 쥐 꼬리 콜라겐 type 1을 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 실험 당일에 제대혈을 15 mL씩 50 mL 원추형 원심 분리 튜브에 분주합니다. 그런 다음 각 튜브에 20 mL의 PBS를 추가하고 혼합물을 여러 번 파이펫팅합니다.

다음으로, 피펫을 사용하여 Ficoll-Paque 15 mL를 취한 후, 희석된 혈액 튜브 바닥에 피펫 팁을 배치하고 조심스럽게 층을 쌓습니다. 감속 브레이크 설정을 해제한 상태에서, 상온의 740 ×g에서 30분 동안 튜브를 원심분리합니다. 세포 분리가 완료되면, 전이 피펫을 사용하여 Ficoll-Paque 층과 희석된 혈장 사이의 계면에 위치한 저밀도 단핵구의 뿌연 층을 제거합니다. 수집된 세포를 EGM-2 배지 10 mL가 들어 있는 50 mL 원심분리 튜브에 넣고, 높은 감속 브레이크 설정으로 상온의 515 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 단핵구를 펠렛화한 후, 상층액을 조심스럽게 흡입하여 버립니다.

그 후 EGM two로 펠렛화된 세포를 두 번 세척하고 재현탁한 다음, 단핵 세포를 1.25 × 10⁷ cells/mL 농도의 EGM two에 현탁합니다. 이제 단핵 세포 현탁액 4 mL를 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 피펫으로 분주하고, 첫째 날에 콜로니가 형성될 때까지 세포를 배양합니다. 배양 후, 느슨하게 부착된 세포가 떨어지지 않도록 주의하며 피펫을 사용하여 웰에서 소모된 배지를 천천히 제거합니다.

그런 다음 각 웰에 4 mL의 E GM two를 조심스럽게 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 콜로니는 보통 실험 전날인 5일에서 14일 사이에 나타납니다. 50 µL의 쥐 꼬리 콜라겐을 준비합니다.

이전과 동일하게 96웰 플레이트의 각 웰에 1을 분주하고, 실험 당일 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 2~3회만 계대 배양한 세포를 PBS로 두 번 세척하는 것으로 시작합니다. 마지막 PBS 세척액을 흡입하여 제거한 후, 멸균된 겔 코팅 클로닝 실린더를 각 콜로니 주변에 배치하고, 멸균 핀셋을 사용하여 각 실린더를 플레이트에 단단히 밀착시킵니다.

각 클로닝 실린더에 따뜻한 triple E express를 2~3방울씩 넣고, 세포가 떨어지기 시작할 때까지 3~5분 동안 실린더를 배양합니다. 세포가 떨어지기 시작하면 EGM two 배지 약 250 µL를 실린더 중앙에 넣고, 피펫으로 위아래로 섞어 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 이제 각 클로닝 실린더의 단일 세포 현탁액을 개별 마이크로 원심분리 튜브로 각각 옮깁니다.

6-웰 플레이트의 세포에 EGFP 발현 렌티바이러스를 감염시키고, 유세포 분석법을 통해 EGFP를 발현하는 세포를 수집합니다. 그런 다음 EGFP 양성 세포를 콜라겐 코팅 플레이트에서 EGM-2 배지로 배양합니다. E CFC가 준비되면, 방금 시연한 것과 같이 TrypLE Express를 사용하여 수집하고, 세포를 EGM-2 배지로 재현탁하여 최종 농도가 약 10⁶ cells/mL가 되도록 합니다.

그런 다음, 초당 20개의 세포라는 낮은 유속의 유세포 분석기를 사용하여 EGP 양성 ECFC를 이전에 준비한 콜라겐 코팅 96웰 플레이트의 각 웰에 단일 세포로 분리합니다. 각 웰의 최종 부피가 약 200 µL가 되도록 EGM two로 조절하십시오. 이후 도립 형광 현미경을 사용하여 각 웰에 단 하나의 세포만 포함되어 있는지 확인합니다. 배양 14일째에 두 번의 배지 교체를 수행하며 2주 동안 플레이트를 배양합니다.

각 웰을 100 µL의 PBS로 세척한 후, 100 µL의 4% paraformaldehyde로 30분 동안 세포를 고정합니다. EGFP를 발현하지 않는 CFCs의 경우, paraformaldehyde 고정 후 cyt reagent(녹색 형광 핵 염색약)를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 형광 현미경을 사용하여 확장된 혈관 내피 세포의 수를 시각적으로 정량화하며, 여기에서와 같이 혈관 내피 세포 수가 2~50개인 웰을 혈관 내피 세포 클러스터로 간주합니다.

51~2000개의 세포가 있는 웰은 저증식능 e CFC로, 2001개 이상의 세포가 있는 웰은 고증식능 e CFC로 간주합니다. 이전과 동일하게 triple E express로 세포를 탈착시킨 후, 헤모사이토미터와 트립판 블루를 사용하여 세포 배양액의 생존 세포 수를 측정하십시오. 240만 개의 생존 세포를 50 mL 코니컬 튜브에 옮긴 다음, 원심분리를 통해 세포를 펠릿화하십시오.

겔 매트릭스 성분들을 충분히 혼합한 다음, 용액을 얼음에 둔 상태에서 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 상층액을 제거한 후 펠릿을 360 µL의 따뜻한 e GM two에 재현탁합니다. 그다음 840 µL의 겔 매트릭스 용액을 세포에 첨가하고, 세포가 겔 내에 완전히 현탁될 때까지 용액을 조심스럽게 혼합합니다. 이 1 mL의 세포 함유 겔 현탁액을 12-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰로 옮기고 겔이 중합될 때까지 플레이트를 배양합니다.

그 후 하룻밤 동안 배양하기 전, 2mL의 따뜻한 EGM2로 겔을 부드럽게 덮어준 뒤 다음 날 이식 직전에 처리합니다. 아이리스 가위를 사용하여 겔을 동일한 크기의 두 조각으로 절단하고, 겔 조각들을 EGM2 배지가 들어 있는 동일한 배양 웰로 옮깁니다. 발가락 꼬집기(toe pinch)로 진정 상태를 확인한 후, 마취된 5~6주령의 nude(scid) 마우스의 하복부를 제모하고 알코올과 베타딘 패드로 수술 부위를 회전시키며 철저히 세척합니다.

다음으로, 멸균된 정밀 홍채 가위(iris scissors)를 사용하여 복부 하단 사분면에 약 5mm 정도의 절개를 가해 피부와 복근 사이의 피하 공간을 노출시킵니다. 복부의 서로 다른 두 영역에서 진피층을 복근으로부터 둔성 박리하여 15~20mm 너비의 포켓을 만드는데, 하나는 상복부 사분면 방향으로, 다른 하나는 복부의 다른 영역으로 이어지도록 합니다. 그런 다음 절개 부위에 인접한 진피층을 들어 올립니다.

젤 조각 절반 하나를 한쪽 복강 포켓에 넣고, 나머지 절반 조각을 다른 쪽 복강 포켓에 넣습니다. 젤을 삽입한 후, 커팅 니들이 달린 5-0 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 각 절개 부위를 2~3바늘로 봉합합니다. 케이지 카드에 라벨을 부착하고, 기관 및 프로토콜 요구 사항에 따라 수술 후 모니터링과 진통 처치를 수행합니다.

이식 14일째에 동물을 희생시킨 후, 알코올 솜으로 마우스의 복부를 닦아내고 원래의 절개선을 따라 피부를 절개합니다. 그런 다음 겔이 있을 것으로 예상되는 위치를 따라 피부 플랩을 절제합니다. 겔 주변을 원형으로 절개하여 각 임플란트를 제거하고, 절제된 임플란트를 아연 고정액에 넣습니다.

이 ECFC 유도 기술을 사용하여, 우리는 이르면 5일 차에 일차 콜로니 형성의 성장을 관찰하였습니다. 화살표로 표시된 5일 차 ECFC 배양물의 cobblestone 형태에 주목하십시오. 확장된 콜로니는 내피 항원을 발현하지만, 조혈 항원은 발현하지 않습니다.

혈관 내피 세포 및 조혈 세포의 대표적인 인 비트로(in vitro) 표현형 평가에서 알 수 있듯이, 면역표현형 분석 결과 e CFC는 CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four 및 NRP two와 같은 내피 항원을 발현하였으나, 조혈 항원인 CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit, CXCR four 또는 CD 1 33은 발현하지 않았습니다. 중요한 점은, 이 막대그래프에 나타난 바와 같이 확장된 콜로니가 2~50개 세포의 클러스터부터 200개 이상의 세포로 구성된 콜로니에 이르기까지, 단일 세포 수준에서 클론 증식 잠재력의 완전한 계층 구조를 보여준다는 것입니다. 녹색 형광 핵 염색약인 cyt로 염색된 콜로니의 이 현미경 사진들은 제대혈 유래 E CFC를 단일 세포 수준에서 14일 동안 배양한 후 얻은 것입니다.

또한, ECFC는 면역결핍 마우스에 이식되었을 때 숙주의 적혈구가 관류되는 인간화 혈관을 형성합니다. 제대혈 유래 ECFC가 포함된 CELLULARIZE 겔 이식물의 H&E 염색 이미지에서, 이식 14일 후 콜라겐 피브로넥틴 겔 내에 형성되어 숙주의 적혈구로 채워진 미세혈관들을 관찰할 수 있습니다. 여기서 갈색으로 나타난 anti-human CD 31 염색은 이 혈관들이 인간 유래임을 추가로 확인해 줍니다.

이 영상을 시청한 후, 인간 탯줄 혈액에서 ECFC를 유도하는 방법과 ECFC 콜로니 형성 후 이를 클로닝, 증식시키고 그 기능을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 혈관 내피 연구자들이 다양한 소스에서 얻은 내피 세포의 내피 클론 증식 잠재력과 유전적 능력을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.