이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

Isotachophoresis (ITP)는 독소 검출에서 샘플 준비에 이르기까지 다양한 애플 리케이션과 강력한 계면 분리 및 preconcentration 기술입니다. 분리와 작은 분자 및 세포 배양 lysate로부터 핵산 정화의 검출 : 우리는 ITP의 물리적 원리와 두 구체적인 예를 들어 응용 프로그램에이 기법을 적용하는 방법론을 검토합니다.

이 비디오의 전반적인 목표는 ITP로 약칭되는 Isot 성분채집술이라고 하는 전기 운동 기술과 이온의 민감한 검출 및 분리를 위한 미세유체 응용 분야를 제시하는 것입니다. 먼저, ITP의 기본 물리적 원리에 대해 논의하고 두 가지 표준 작동 모드, 즉 피크 모드와 고원 모드 외에도 ITP 온칩 ITP를 시연한 다음 샘플 사전 농축을 위한 간단한 프로토콜로 시작하여 Fluor four를 날카로운 피크에 집중시켜 검출하는 세 가지 실험을 통해 시연합니다. 둘째, 온칩 시료 준비에 사용되는 ITP 분석은 박테리아 세포 용해물에서 DNA와 RNA를 선택적으로 추출하는 곳입니다.

마지막으로, label-free 검출 분석은 plateau mode ITP를 사용하여 아미노산을 정제하고 정량화하는 데 사용됩니다. 궁극적으로 ITP를 통해 아미노산 정제, 분석물 사전 농축 및 핵산의 선택적 추출을 달성할 수 있습니다. 오늘 우리는 Isot Apheresis라고 하는 다재다능한 전기 운동 기술의 기본 물리학과 방법론을 소개할 것입니다.

우리 그룹은 label-free 검출, 시료 전처리 및 신속한 혼성화 분석을 위한 ITP 방법을 개척해 왔습니다. 분석물, 추출물, 용해산을 사전 농축하고 아미노산을 정제 및 검출하는 ITP의 능력을 입증하는 세 가지 대표적인 분석을 공유하겠습니다. 이러한 분석은 ITP의 다양성을 강조하고 반복 가능한 실험을 보장하는 데 필요한 간단한 단계를 보여줍니다.

실험실에서. ITP에서 시료 이온은 선행 전해질과 후행 전해질(각각 LE 및 TE로 약칭) 사이의 계면에 선택적으로 초점을 맞춥니다. 샘플 이온은 선행 이온의 속도에 의해 결정되는 일정한 속도로 마이크로 채널을 통해 이동합니다.

시료 이온은 효과적인 전기영동 이동도가 LE 및 TE 이온의 이동도에 의해 대괄호로 묶일 때 초점을 맞추며, 여기서 이동도는 국소 전기장에 대한 이온 드리프트 속도의 비율로 정의됩니다.TE에 혼합된 샘플 이온은 주변 TE 이온보다 빠르게 이동하므로 LETE 계면에 축적됩니다. 또한 ITP 인터페이스는 자체 샤프닝 LE 이온으로, TE 영역으로 확산되어 강력한 복원 플럭스를 경험하고 선행 영역으로 돌아갈 수 있습니다. LE 영역의 TE 이온에 대해서도 마찬가지입니다.

I two P의 자체 선명화 및 초점 특성은 이 기술의 견고성에 기여하고 압력 구동 흐름과 같은 계면의 방해에 둔감하게 만듭니다. 피크 모드에서 시료 이온 농도는 LE 및 TE 이온의 농도보다 현저히 낮습니다. 따라서 샘플 이온은 이러한 조건에서 국소 전도도에 무시할 수 있는 수준으로 기여합니다.

ITP 계면 영역 내에서 여러 분석물이 집중되는 것은 대부분 겹치는 피크입니다. 결국, 샘플 이온은 고원 모드에서 분리하고 초점을 맞출 수 있을 만큼 충분히 높은 농도에 도달할 수 있습니다. 고원 모드에서 시료 이온은 전기영동 이동도에 따라 결정된 순서로 국부적으로 균일하고 일정한 농도의 영역으로 분리 및 정제됩니다.

고원 모드의 이온은 국소 전도도를 결정합니다. 매우 희석된 이온은 여전히 고원 영역 사이의 피크 모드에서 집중될 수 있습니다. 이 프로토콜에 제시된 분석의 경우, 교차 채널 설계의 등방성 습식 에칭 유리 미세유체 칩이 사용됩니다.

그러나 ITP는 교차점이나 접합부가 없는 단순한 직선 채널 또는 모세관에서도 수행할 수 있습니다. 전기 삼투압 흐름을 억제하는 데 사용되는 동적 코팅의 성공적인 적용과 실행 간 반복성을 보장하기 위해 실험 전에 다음 세척 절차를 수행해야 합니다. 수로의 오염을 제거하려면 북쪽, 동쪽 및 남쪽 저수지를 10-20 마이크로 리터의 10 % 표백제 용액으로 채우십시오.

표준 캘리퍼 칩 캐디를 사용하는 경우 200마이크로리터 피펫 팁의 넓은 끝을 칩의 서쪽 저장소에 부착하고 진공 라인을 2mm 내경 튜브에 연결합니다. 2분 동안 진공 청소기를 적용한 다음 저장통에 탈이온수를 채우고 진공 라인으로 비워 저장소를 완전히 비웁니다. DI 세척을 여러 번 수행합니다.

1몰 수산화나트륨으로 이 과정을 반복합니다. 채널 표면은 부드럽게 에칭되어 깨끗한 붕 실리케이트 표면을 생성하여 균일한 표면 특성을 확립하는 데 도움이 됩니다. DI로 저장소를 청소한 다음 le로 채널을 헹굽니다.

이 기간 동안 표면 특성과 동적 코팅은 채널 내에서 평형을 이룹니다. 실험을 시작하려면 1ml의 선행 전해질과 1ml의 후행 전해질을 준비합니다. 그런 다음 90마이크로리터의 TE와 10마이크로리터의 1마이크로몰을 결합합니다.

알렉사 플루어 4 88. 로 헹군 후 LE 서쪽 물통을 비우고 물통을 디 워터로 여러 번 헹구어 저수지에 남아 있는 LE를 강하게 희석합니다. 마지막으로, 이 저장소를 20마이크로리터의 TE 함유 염료로 채웁니다.

동쪽 저장소에 양극을 놓고 서쪽 저장소에 접지 또는 음극을 놓고 2마이크로암페어의 정전류를 적용합니다. 샘플 피크는 일정한 속도로 이동하고 저전도도 TE가 채워짐에 따라 저장소 사이의 전압이 증가합니다. 처리되지 않은 세포 용해물의 채널 핵산은 표적 핵산보다 낮지만 onic PCR 억제제보다 높은 전기영동 이동도 크기를 가진 후행 음이온을 선택하여 ITP를 사용하여 정제할 수 있습니다.

Onic PCR 억제제는 반대 방향으로 이동하므로 뒤에 남습니다. 재현탁을 시작하기 위해, 80 마이크로 리터의 RNA 자유 수에서 10 내지 8 번째 집락 형성 단위와 경합하는 대장균 세포 펠렛과 10 마이크로 리터의 용해제 혼합물을 부드럽게 첨가하고 배양 후 실온에서 5 분 동안 배양하고, 1 마이크로 리터의 1 모어 수산화 나트륨을 첨가하여 용해물의 pH를 약 12.5로 올린다. 용액이 투명해질 때까지 피펫을 위아래로 부드럽게 작동시키면 용해가 완료됩니다.

다음으로, 90마이크로리터의 50 밀리몰 라신과 100 밀리몰 비스트리스에 10 마이크로리터의 용해물을 첨가합니다. 이 솔루션은 이제 서면 프로토콜에 설명된 대로 사이버 그린 염료를 포함하는 LE 1ml를 준비하고 앞에서 설명한 대로 LE를 사용하여 미세유체 칩을 채우는 데 사용할 수 있습니다. 헹군 후 동쪽 저장소의 내용물을 PCR 호환 가능한 것으로 교체하십시오.

LE 서쪽 저장소를 DI로 헹구고 20 마이크로 리터의 te를 채 웁니다. 동쪽과 서쪽 저장소 사이에 1000볼트를 적용하여 실험을 시작합니다. 이러한 저장소 사이의 전류는 실험이 끝날 때 감소합니다.

샘플은 이 용액과 동시에 LA 저장소로 빠져나갑니다. 시스템의 현재 대 시간은 일반적으로 고원 값에 도달합니다. 피펫을 위아래로 몇 번 움직여 저장 용기 내용물을 부드럽게 혼합합니다.

그런 다음 정량적 분석을 위해 5 마이크로 리터 부피를 추출하십시오. R-T-P-C-R-I-T-P는 또한 작은 이온을 분리하고 집중시켜 TE와 LE 사이의 인접하고 검출 가능한 고원으로 만들 수 있으며, 이를 통해 입증된 물리화학적 특성을 기반으로 검출할 수 있습니다. 다음은 형광 onic species가 le에 첨가되는 non focusing tracer assay입니다.

형광등은 초점을 맞추지 않지만 그 농도는 국소 전기장에 적응하여 정제된 고원 영역을 시각화할 수 있습니다. 먼저 양이온성 Fluor 4개의 막대, Domine 6개의 G 및 1ml의 후행 전해질을 포함하는 1ml의 선행 전해질을 준비합니다. 그런 다음 90마이크로리터의 TE와 10마이크로리터, 각각 50밀리몰의 아르기닌과 50밀리몰의 라이신을 결합하여 유한 주입을 위해 샘플을 로드합니다.

서쪽 및 북쪽 저장소에서 20마이크로리터의 Ellie를 분배하고 동쪽 저장소에서 아미노산 샘플을 분배합니다. 다음으로, 남쪽 저장소에서 1분 동안 진공 청소기를 적용합니다. 동쪽 저수지를 DI 물로 헹군 후 내용물을 te로 교체하십시오.

마지막 단계로, 형광 리포터 Alexa Fluor 4 88을 사용하여 피크 모드 실험에서 동쪽과 서쪽 저수지 사이에 500볼트를 적용합니다. 전체 형광 강도를 통합하고 보정 곡선과 비교하여 정량적 농도를 얻을 수 있습니다. 여기에 표시된 정보는 해당 샘플을 드러내는 다양한 적용된 전류에 대한 실험입니다.

피크 너비는 전류에 반비례합니다. 이는 피크 모드 ITP를 사용하여 전체 세포 용해물에서 핵산을 추출하는 예입니다. 총 핵산 ITP 피크는 종종 이상적이지 않은 모양을 취합니다.

핵산 추출 실험에서 시료를 LE Reservoir로 용출시키고 피펫으로 추출하여 정량적 역전사의 정량적 R-T-P-C-R 결과에 의한 분석을 수행합니다. PCR은 16s 리보솜, RNA 및 16s 리보솜, 16s 리보솜, 16s 리보솜에 대한 박테리아 배양 음성 대조군 임계값 주기의 DNA의 성공적인 정제를 확인하며, DNA는 각각 예상대로 30 주기 이상이었습니다. 플라토 모드 ITP는 RUMINE six G를 언더 스피드 형광 추적자로 사용하는 NFT 분석을 사용하여 아르기닌과 라이신의 두 가지 아미노산에 대해 수행되었습니다.

여기서 LE 또는 TE 구역 강도에 대한 상대적인 형광 강도는 구역 식별에 사용할 수 있으며 구역 너비는 정량화를 가능하게 합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 ITP와 세 가지 ITP 기반 분석의 방법론에 대해 물리적으로 잘 이해하게 될 것입니다. 특히, ITP를 사용하여 아미노산을 puring하고, 분석물을 사전 농축하고, 핵산을 선택적으로 추출하는 방법을 보여주었습니다.

고전압으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 전류를 제한하는 장비를 사용하고 침식물로부터 충분한 거리를 유지하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.