Name: 의 성적 개발 및 Ascospore 방전 Fusarium graminearum /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 배우세요 Fusarium graminearum에서 성적 발달을 유도하고 포자 방출을 분석하는 방법을. 이 기술은 유전자 재조합 및 돌연변이체 선별 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (FT에 MCB-0923794)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. Perithecia 생산 <ol><li> F.의 비옥한 변형율과 6.0 cm의 diam 배양 접시에있는 센터 접종 당근 한천 10 graminearum은 (PH-1을 추천). </li><li> 장소는 실내 온도 (18-24 ° C)에서 밝은 형광등 아래에서 요리를 주사하고 균사체가 배양 접시 (3-5일)의 바깥쪽 가장자리에 도달하기 전까지는 성장할 수 있습니다. 상업용 가정용 형광등은 fruiting 기관 형성 및 방전을 자극 맞게 설정되어 작동합니다. </li><li> 부드럽게 멸균 이쑤시개로 공중 mycelia를 제거합니다. </li><li> 멸균 유리 hockeystick 또는 멸균 유리 막대에 둥근 엔드와 표면에 1.0 ML 2.5 % 십대 초반 60 AQ를 배포합니다. </li><li> 불빛에 번호판을 반환합니다. 접시에 Parafilm를 추가하지 마십시오. </li><li> 24 시간 후, 접시의 표면이 반짝 이는 모습이 있어야합니다. 만약 mycelia 다시 나타납니다, 자국 표면과 다시 신청 십대 초반-60 솔루션입니다. </li><li> 다음 주 동안 perithecia 개발을 관찰. 의 중간 단계perithecium 개발은 부드럽게 RNA 추출 (그림 1)에 대한 냉동 한천과 플래시의 표면은 부서에서 수확한 수 있습니다. </li><li> 성숙한 포자는 7 일 의한 접시의 뚜껑에 축적됩니다. 처음에는 이러한 것들이 단지 해부 현미경으로 볼 수 있지만, 눈에도 보일 할만큼 일 9 그들은 충분한 농도로 축적됩니다. </li></ol> 2. Ascospore 방전 분석 <ol><li> 일 6 십대 초반 솔루션의 응용 프로그램이 후 나무 보어와 한천의 1cm의 diam 원 그만. 또는 메스는 유사한 크기의 세그먼트를 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 동그라미는 반으​​로 썰어 각각의 절반이 유리 현미경 슬라이드에 둘 수 있습니다. </li><li> 동양이 조각 fruiting 기관을 포함하는 표면이 슬라이드의 표면에 직각 수 있도록하고, 포자는 슬라이드의 길이를 아래로 해고되었습니다. </li><li> 조명 아래에서 하룻밤 습도 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 포자는 계속 축적됩니다슬라이드와 육안 다음날 아침 (그림 2) 볼 수 있습니다. </li><li> 축적된 포자는 물로 씻어 슬라이드 및 원하는 경우 계량 수 있습니다. </li><li> 잠재 ascospore 방전 억제제는 분석의 조립시 한천 블록의 뒷면에 추가하여 assayed 수 있습니다. 배출을 줄이고 일부는 이온 채널 억제제는 이전에이 기술을 15 assayed되었습니다. </li></ol> 3. 재조합 자손의 세대 <ol><li> F.의 두 ​​변종과 당근 한천을 inoculating하여 십자가를 개시 graminearum (한 알 + 한 알 -), 배양 접시의 반대편에 접종 포인트를 배치. </li><li> 일단 균사가 표면을 가득했습니다 공중 부분을 긁어서하고 위에서 설명한 십대 초반-60 솔루션을 적용합니다. 균사 만나는 배양 접시의 측면에 유의하도록 마커를 사용합니다. </li><li> 불빛에 문화를 반환하고 perithecia가 개발한 때까지 알을 품다, 그리고 cirrhi 수있다총이 두 문화 사이의 교차로를 따라 perithecia에서 형성합니다. </li><li> 두 문화의 교차로 따라 perithecia을 볼로 해부 현미경에서 가져. 곤충 핀을 이용하여 소독 및 멸균 물에 담근, 핀의 끝부분에 살짝이 테두리를 따라 cirrhus 만지지. 핀에 수분이 cirrhus이 핀에 집착해서는 안된다. </li><li> 포자 씻어하기 Eppendorf 튜브에 200 μl 멸균 물 위에 cirrhus로 핀의 팁을 씻어. </li><li> 화염 핀, 다시 그것을 축축하게하다 다른 cirrhus를 선택하십시오. 10-15 cirrhi를 선택하고, 물을 별도의 튜브에 각각 배치합니다. </li><li> 간단히 와동 튜브는 cirrhi를 일시 중지 포함하는. </li><li> 9cm 페트리 접시에 MMTS 매체 1 피펫과 장소와 포자 현탁액의 60 μl를 제거합니다. 멸균 하키 스틱으로 퍼졌다. 나머지 포자 서스펜션은 최대 일주일 동안 4 ° C에 보관하고 필요한 경우 replated 수 있습니다. </li><li> Incuba3~5일을위한 실내 온도 (필요하지 빛)에서 테는 아주 작은 식민지는 (그림 3) 나타날 때까지. 식민지 간의 phenotypes 두 종류가있을 것이다. 알 - 식민지는 알 +는 식민지보다 sparser의 균사가됩니다. 재조합 perithecia에서 Cirrhi는 대략 동등한 비율의 두 식민지의 ph​​enotypes을 보여줍니다. 그들을 단지 하나의 표현형의 식민지로 번호판을 폐기하십시오. 때로는 두 개 이상의 phenotypes 다른 요인의 분리로 인해 발생합니다. </li><li> V8 또는 저장 당근 한천에 식민지를 이동합니다. 올바른 표현형을 확인하기 위해, Czapek의 Dox 한천 (알 - 변종이 Czapek의 Dox에 성장하지 않습니다)에서와 염소 산염 (알 이상의 변종이 염소 산염과 PDA에 성장하지 않습니다 0.5 M 칼륨 염소 산염)와 PDA에서 테스트 식민지. 원하는 자질에 대해이 식민지를 검사합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 perithecia 생산 목표의 잔디가하는 것입니다어떤 mycelia 또는 명백한 포자없이 perithecia. 문화의 표면은 검은색 벨벳 (그림 1)와 유사한 표시됩니다. 24 시간에서 십대 초반의 적용 후 한천의 표면은 약간의 광휘가 있어야합니다. mycelia 다시 표시면 판은 perithecium 개발을 유도 정도 까진되지 않았을 수 있습니다. Ascospore 방전 항상 야생 형 변형에서 분석 한천의 여러 단위로 제공하고 있습니다. 그 화재하지 않으면, 그때도 당신의 perithecia 너무 어린이나 너무 많은 나이 잖아. 그들은 너무 나이가있다면 여러 균사가 그것을 약간 흰 색조를주는 문화의 표면 위에 나타납니다. 이런 경우가 아닌 경우, 그들은 너무 어려 될 수 있으며, 검정은 24 시간 후에 다시 시도해야합니다. 때때로, 문화가 잘 배출되지 않으며, 실험 반복해야한다. 당신은 적절한 조명 조건 하에서 분석을 수행하십시오. 재조합 자손 <p class="jove_content"&gt; 재조합 perithecia는 두 변종 사이의 교차로를 따라 perithecia의 대부분을 구성해야합니다. 우리는 보통 십자가에서 10 cirrhi을 처리하고 그 중 최소한 4-6은 재조합해야합니다. 아주 가끔씩, 돌연변이 짝짓기의 변형을 방지합니다. 부모 중 하나가 비정상적 성장 표현형를 가지고있다면, 2 개 이상의 phenotypes는 MMTS의 식민지들 사이에서 존재할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> 그림 1. 당근 한천에 perithecium 개발의 단계. 십대 초반의 적용 후 왼쪽, 72 H. 붉은 안료와 표면에 검은 알갱이처럼 보이는 매우 젊은 perithecia를 적어 둡니다. 맞아요, 144 H에서 성숙의 perithecia가 형성되고있다. 두 문화의 천박한 mycelia의 거의 완전한 부재를 적어 둡니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> 그림 2. 방전 분석. 주황색 당근 한천 플러그 지향하므로 THA입니다강제 표면 성숙 perithecia에서 배출 t 포자는 유리 슬라이드의 표면에 축적하실 수 있습니다. 15 시간 축적 시간. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> 그림 3. 알 + 및 선택적 MMTS 매체에서 알 - 식민지 사이에 성장의 차이. 알 - 식민지는 (화살촉) 작은 수 있습니다. 바보 + 식민지는 (화살표) 강력한 성장을 보여줍니다. 사진은 7 일 후에 촬영.

<ol><li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li>
<li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuller%2C+AHR+%22Researches+on+Fungi%22">Researches on Fungi</a>. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).</li>
<li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid1%2C+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel%2C+affects+growth%2C+development%2C+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li>
<li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li>
<li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+%28MAT%29+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li>
<li>Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li>
<li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li>
<li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%2C+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li>
<li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes%3A+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li>
<li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+%28Gibberella+fujikuoi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li>
<li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene%2C+ROA%2C+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li>
<li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li>
<li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+cannons%3A+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li>
<li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perithecial+development+by+Gibberella+zeae%3A+a+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li>
<li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologica%22%5BJournal%5D)">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

F. graminearum은 특히 잘 주석 게놈 (의 가용성으로 인해 fruiting 기관 개발 연구에 적응되어 <a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> 4), 그리고의 가용성 Affymetrix- microarray 6 기반. 이것은 ascospore 방전 7,11,3위한 중요한 유전자를 식별하는 능력을 촉진하고있다. 여기에 제시된 방법은 연구자가 F.의 fruiting 기관의 유전자 분석을 위해 발달 단계와 함수의 이산 집합에 집중할 수있게 graminearum. 메소드는 또한 문화의 열매에 시달릴 수있는 관련 곰팡이에 쉽게 적용할 수 있으며, 다른 곰팡이 fruiting 본문 유형의 다양한 개발을위한 표준으로 사용할 수 있습니다. 포자 발사 표현형을 평가하는 능력은 포자가 볼 작고 어려운 수종 등에 미묘한 수 <eM&gt; F. graminearum. 깨끗한 슬라이드에 포자의 컬렉션은 포자가 슬라이드를 씻어하고 quantitated 수 있으므로, 시각 평가와 양적 평가 모두를 용이하게합니다. 일부 곰팡이 종들은 포자와 포자가 떨어져 씻어서 수 없습니다을 둘러싸고 점액을 생산하지만, 그들이 슬라이드에 남아으로 미세하게 계산되어야합니다. 우리는 Sclerotinia sclerotiorum의 사실이 발견되었습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Fusarium graminearum 변형 PH-1 </td><td> 곰팡이 유전학 증권 센터, 캔자스 </td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td> 십대 초반 60 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P1629 </td></tr><tr><td> Czapek의 Dox 한천 </td><td> Difco, Becton 디킨슨 </td><td> 233,810 </td></tr><tr><td> 칼륨 염소 산염 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 255,572 </td></tr></tbody></table>

의 성적 개발 및 ascospore 방전 fusarium graminearum</em

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum은 filamentous 곰팡이의 개발과 pathogenicity에 공부를 모델 시스템이되었습니다. F.는 graminearum 가장 쉽게 당근 한천에 perithecia라는 fruiting기구를 생산하고 있습니다. Perithecia는 perithecium 개발의 특정 단계에서 생산되는 다양한 조직 유형을 포함합니다. 이들은 (외모 순서) perithecium의 이니셜 (ascogenous 균사를 야기할있는), 외벽, paraphyses (asci 개발까지 perithecium의 중심을 차지하고 멸균 mycelia), asci 및 ascospores 형성 포함 asci 14 이내. 이러한 조직 각각의 개발은 약 24 시간으로 구분되며, 성적 발달 12,8 동안 transcriptomic 연구의 기초가되었습니다. 각 단계의 사진을 포함한 개발의 더욱 철저한 설명을 위해 Hallen 외. (2007)을 참조하십시오. 여기서는 동기를 생성하고 수확을위한 방법을 제시단조는 유전자 조절, 개발 및 생리적 과정의 시간적 연구 perithecia의 잔디를 개발. 이러한 방법은 F. 함께 사용될 구체적으로 작성하고 있지만 graminearum, 기법 fruiting는 문화에 시달릴 수 있도록 제공, 다른 곰팡이의 다양한 사용과 개발에 대한 몇 가지 synchrony가 가능합니다. 우리는 최근 F.의 성적 발달을 연구하기 위해이 프로토콜을 적응했습니다 verticillioides. perithecia을 개발 잔디를 유도하지 못했기 때문에 개별 perithecia는,이 수종에 손을 포착해야하지만, 과정 개발 (Sikhakolli 및 트레일, 게시되지 않은)를 공부를 위해 일했습니다. 곰팡이 fruiting 기관의 가장 중요한 기능은 포자의 분산이다. Ascomycota (자낭은 곰팡이를 생산)의 종의 다양한에서 포자가 통해 (그리고 epiplasmic 유체) 포자의 방출을 유도, 자낭 내에 turgor 압력의 생성으로 인해, 자낭에서 촬영자낭 팁 2,7에서 기공. 강제 ascospore 방전 우리의 연구는 우리가 그 과정에서 변이를 위해 구분할 때 사용하는 &quot;포자 방출 분석&quot;의 개발 결과로했습니다. 여기에서 우리는이 분석의 세부 사항을 제시. F. graminearum는 homothallic이며, 따라서 호환 파트너의 부재에 fruiting기구를 형성할 수 있습니다. homothallism의 장점은 그 교차로는 고유한 특징이 종 14,7의 성욕 발달의 연구를 촉진하고있다 패싯에 대한 자손의 homozygous를 생성할 필요가 없습니다입니다. 그러나 heterothallic 변종은 5,9를 건너 사용할 수있는 생성되었습니다. 그것은 하나의 변형 1의 몇 가지 유전자에 대한 돌연변이를 얻기 위해 homothallic 변종을 통과하는 것도 가능합니다. 이것은 2 계통 하나의 페트리 접시를 coinoculating 통해 이루어집니다. 미팅 포인트 더불어, perithecia의 대다수는 (부모 변종 중 하나에 돌연변이를 억제 제공하지 않습니다 재조합 될 것입니다) outcrossing. perithecia 시대로서, 그들은 강제로 그들을 배출하는 대신 ascospores 실내 masse을 스며 나오게하다. 결과 포자의 exudate은 (cirrhus 함) perithecium의 일각에 앉아 쉽게 개별적인 포자의 복구를 위해 제거할 수 있습니다. 여기 재조합 perithecia 및 재조합 자손의 회복의 식별을 용이하게하기위한 프로토콜을 제시한다.

성 십자가와 재조합 자손의 고립은 사상균에 대한 중요한 연구 도구입니다<em&gt; Fusarium graminearum</em&gt;, 필요한 기술이 성공적으로 이러한 프로세스에 나타난 수행.

의 성적 개발 및 Ascospore 방전 Fusarium graminearum</em

Fusarium graminearum은 사상균의 발달 및 병원성 연구를 위한 모델 시스템이 되었습니다. F. graminearum은 가장 용이하게 ...를 생성합니다.

본 절차의 전반적인 목표는 배양 환경에서 parathesia 발달을 유도 및 조절하고 APO 방출을 유도하는 방법을 익히는 것입니다. 이는 먼저 배양물을 유도하고 활발히 성장시켜 성적 발달을 시작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로는 활성 포자 방출을 분석한 후, 재조합 parathesia를 생성합니다.마지막 단계는 재조합이 일어났는지 여부를 나타내는 표현형에 대해 자손을 평가하는 것입니다. 궁극적으로, 이 결과는 성적 발달의 돌연변이를 스크리닝하거나 하나의 균주 내에 다중 돌연변이를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법의 단계들은 설명하기 어렵기 때문에 시각적인 시연이 매우 중요하며, 과정은 간단하지만 최적의 포자 방출과 일관된 parathesia 생산을 얻기 위해서는 정밀하게 수행되어야 합니다.6cm 페트리 접시 중앙에 당근 코어(carrot auger)를 접종하고, 비옥한 f gramine 균주를 접종하는 것으로 시작합니다. 접종된 접시를 표준 상용 밝은 형광등 조명 하에 실온에서 배양하십시오.균사가 배양 접시의 가장자리에 도달할 때까지 3~5일 동안 진균을 배양합니다. 클린벤치 내에서 멸균된 이쑤시개를 사용하여 배양 표면을 부드럽게 긁어내어 공중 균사를 제거합니다.그런 다음 1 mL의 계면활성제를 오거(auger)에 도포하고, 멸균된 유리 막대의 굽은 끝부분이나 구형 끝부분을 사용하여 표면에 문지릅니다. perfil을 도포하지 마십시오. 플레이트를 다시 조명 아래에 둡니다.24시간 후, 플레이트 표면은 광택이 나는 모습이어야 합니다. 만약 균사가 다시 나타나면 표면을 긁어내고 tween 60 용액을 다시 도포한 후 24시간 동안 추가로 빛을 쬐어 줍니다. 이제 일주일 동안 parathesia의 발달 과정을 관찰하십시오.어린 parathesia는 오거 표면에 검은 알갱이 형태로 보입니다. 성숙한 parathesia와 비교했을 때, 표면 균사는 거의 없어야 합니다.7일째가 되면 성숙한 포자가 플레이트 뚜껑에 축적되며, 9일째에는 포자가 매우 조밀해져 확대경 없이도 육안으로 확인할 수 있습니다. 중간 단계의 parathesia를 수확하려면, 메스로 auger의 표면을 부드럽게 긁어 parathesia를 크라이오 튜브(cryo tube)로 옮깁니다. 그 후, 계면활성제를 처리한 지 6일 후에 RNA 추출을 위해 튜브를 급속 냉동할 수 있습니다.나무 드릴, 보어 또는 메스를 사용하여 오거에서 직경 1cm의 원형 조각을 잘라냅니다. 해당 원형 조각을 반으로 자른 뒤 유리 현미경 슬라이드 위에 고정합니다. 이때 자실체가 포함된 표면이 슬라이드 표면에 수직이 되고, 포자가 슬라이드의 길이 방향으로 발사되도록 조각들을 배치합니다. 만약 포자 발사 억제제가 필요하다면, 이때 오거 블록의 뒷면에 도포합니다.이 기술은 방출 억제제 화학 물질을 스크리닝하거나 포자 방출 능력을 상실한 유전적 돌연변이체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며, 당사는 두 가지 모두를 성공적으로 수행하였습니다. 이제 슬라이드를 단순 조명이 설치된 상온 가습 챔버에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 자실체가 분출됨에 따라 포자가 슬라이드 위에 축적되어 다음 날 아침에 확인할 수 있습니다.축적된 포자를 이제 슬라이드에서 씻어내어 깨끗한 접시에 수집하고 정량화할 수 있습니다. 먼저 두 종류의 f gramine arum 균주를 당근 오거(carrot auger) 페트리 접시의 반대편에 각각 접종하여 유전적 교배를 설정하십시오. 이전에 설명한 바와 같이, 균사가 표면을 가득 채울 때까지 곰팡이를 배양합니다.공중 부분을 긁어내고 T 60 용액을 도포합니다. 이 단계에서 균사가 만나는 플레이트 지점을 표시합니다. 배양물을 다시 빛이 있는 곳으로 옮겨 약 7일 동안 배양하면, 파라테시아(parathesia)가 발달하고 배양물 사이의 접점 면을 따라 파라테시아로부터 Siri가 형성되기 시작합니다.이 기술은 여러 돌연변이를 하나의 균주로 결합하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 knit plus와 knit minus 모두 선택이 가능하여 매우 유용한 선택 마커가 된다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 실체 현미경 아래에서 두 배양액의 교차 지점을 따라 형성된 parathesia를 시야에 넣으십시오.그런 다음 sear eye를 찾습니다. 이제 멸균된 곤충 핀을 멸균수에 담근 후, 배양물 사이의 경계에 형성된 serous에 핀을 접촉시킵니다. SRI가 핀의 수분에 부착되어야 합니다.그런 다음 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 담긴 200 µL의 멸균수로 핀 끝을 헹굽니다. 핀을 화염 멸균하고 다시 적신 후, 다른 sru를 채취합니다. 3~5개의 Siri를 채취하여 각각 별도의 튜브로 옮깁니다.이제 짧게 볼텍싱합니다. 각 튜브에 현탁된 Siri를 담습니다. 60 µL의 포자 현탁액을 9 mm 페트리 접시에 도말합니다.MMTS 배지를 사용하여 플레이트를 상온에서 빛이 있는 상태 또는 없는 상태로 배양하고, 남은 포자 현탁액은 4 °C에서 최대 일주일 동안 보관하십시오. 3~5일 후, 플레이트에 매우 작은 콜로니가 나타납니다. 현미경으로 한 가지 표현형을 판독할 수 있습니다.Knit 음성 콜로니는 Knit 양성 콜로니보다 균사가 더 희소하게 나타납니다. 한 가지 표현형만 나타나는 플레이트는 폐기하십시오. 재조합 parathesia 유래 Siri는 두 가지 콜로니 표현형이 거의 동일한 비율로 나타납니다.이 플레이트들을 보관하십시오. 때로는 다른 인자들의 분리로 인해 다른 표현형이 나타날 수 있습니다. 보관 목적으로 knit 양성과 knit 음성의 중간 형태를 띠는 콜로니들의 경우, 재조합 플레이트에서 V8 또는 당근 agar 플레이트로 콜로니를 옮겨 다른 표현형을 조사함으로써 연구를 계속하십시오. 콜로니를 Chap X dock's agar 및 chlorate가 포함된 PDA 플레이트에 도말하십시오. Parathesia는 균사나 포자 없이 검은색 벨벳 같은 론(lawn) 형태로 성장했습니다.tween 도포 24시간 후, 오거(auger) 표면에 약간의 광택이 나타났다. 균사체가 다시 나타났다면, 파라테시아(parathesia) 발달을 유도할 만큼 플레이트를 충분히 긁어내지 않았을 가능성이 있다. 야생형 균주의 자실체를 가진 오거 블록 여러 개를 준비하여, 포자가 유리 슬라이드에 분사되는 것을 관찰하였다.적절한 조명을 위한 준비를 마쳤습니다. 너무 어린 또는 너무 오래된 Parathesia는 종종 발아하지 않았습니다. 너무 오래된 경우에는 배양 표면에 수많은 균사가 나타나 희끄무레한 색조를 띠었습니다.자실체가 너무 어렸을 때는 발화되지 않았으며, 이에 따라 실험을 반복하였습니다. 24시간 후 교배를 통해 10개의 Siri를 수집했을 때, knit 음성 및 knit 양성 표현형의 혼합으로 판정한 결과 일반적으로 최소 6개가 재조합체였습니다. 매우 드물게 돌연변이로 인해 균주의 교배가 이루어지지 않은 경우가 있었습니다.부모 중 한 쪽이 명백한 성장 표현형을 보였다면, MMTS 상의 콜로니들 사이에서 세 가지 이상의 표현형이 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때, 장기간 연속적으로 계대 배양하지 않고 잘 유지된 배양물로 시작하는 것이 중요합니다. 항상 안정적인 냉동 보관주로부터 배양한 배양물로 시작하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

무균 조건 하에서 Gibberella zeae, 수집을위한 절차에 ascospores의 발달 과정을 공부를하는 것은 프로토콜에 대한 정보의 최고 수준을 생성하기 위해 촬영입니다. 이것은 실험, 전체 게놈 표현 프로필 테스트 구현하는 중요한 부분의 재현성을 촉진한다.

Microarray 실험에 대한 Gibberella zeae Ascospore 생산 및 수집.

종자 - 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.

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