마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 뇌에 이식된 줄기세포의 생체 내 행동에 대한 표준화된 추적 관찰을 달성하는 것입니다. 이는 먼저 EGFP와 루시페라아제를 형광 미크론 크기의 산화철 입자와 함께 발현된 골수 유래 기질 세포를 라벨링하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 MPIO 라벨링된 BMC를 마우스 뇌 조직에 적절하게 주입

다음으로, 세포 이식편의 생존 및 국소화는 생물 발광 이미징 및 자기 공명 이미징을 사용하여 비침습적으로 수행됩니다. 마지막 단계는 사후 조직학적 분석을 사용하여 in vivo 이미징 결과를 검증하는 것입니다. 이 방법은 쥐의 뇌에 이식한 후 줄기세포의 거동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 모델 유기체 및 질병 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

정맥 주사 및 뇌내 주사는 수행하기 어렵고 동물 생존에 대한 특정 위험을 억제하기 때문에 동물 취급 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 6개의 빙하 청색 미크론 크기의 산화철 입자에 75 곱하기 10을 sub confluent growing cell culture에 추가합니다. 세포내이입(endocytosis)을 통해 입자가 흡수될 수 있도록 16시간 동안 더 배양한 다음 나머지 입자를 씻어냅니다.

세포가 추가로 24시간 동안 성장하여 세포 공동 유창성과 G-B-M-P-I-O의 균일한 분포를 얻을 수 있도록 합니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 EGFP 양성 세포의 총량에 대한 EGFP 양성 및 G-B-M-P-I-O 양성 세포의 비율을 계산하여 입자 흡수를 육안으로 검증합니다. 다음으로, 표지된 BMSC 루시페라제 EGFP 세포를 10ml로 두 번 세척합니다.

PBS는 트리핀 EDTA로 세포를 처리하고 나중에 수확합니다. 보상은 그 때 세포를 세척하고 PBS에 있는 밀리리터 당 6번째 세포에 133 곱하기 10의 마지막 농도에 그(것)들을 다시 현탁시킨다. 마지막으로, 이식할 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.

이 절차에서는 킬로그램당 80mg의 케타민과 킬로그램당 16mg의 자일라진 혼합물을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 마우스가 잠들 때까지 5분 동안 기다린 다음 머리를 면도하여 멸균 조작을 허용합니다. 다음으로 마우스를 정위 프레임에 놓고 알코올로 피부를 소독하십시오.

그 후, 탈수를 예방하기 위해 눈에 연고를 바르십시오. 해마를 표적으로 삼기 위해 두개골이 노출되도록 정중선 두피 절개를 만듭니다. 치과용 드릴 버를 사용하여 뒤쪽으로 2mm, 옆으로 2mm로 두개골에 구멍을 뚫습니다.

이 시점에서 세포 현탁액을 잠시 와류로 회전시킨 다음 주사기에서 세포 현탁액을 흡인합니다. 그런 다음 바늘 주사기를 경막 아래 2.5mm 깊이로 내리고 1분 동안 압력 평형을 유지합니다. 1분 후 바늘을 경막 아래 2mm 위치로 집어넣습니다.

그런 다음 자동 마이크로 주입 펌프를 사용하여 분당 0.70마이크로리터의 속도로 3마이크로리터의 세포 현탁액을 주입합니다. 주입 후 주입된 세포 현탁액의 역류를 방지하기 위해 추가로 5분 동안 기다립니다. 그런 다음 바늘을 천천히 집어넣습니다.

그 후, 피부 주변을 소독한 다음 피부를 봉합합니다. 탈수를 방지하기 위해 300마이크로리터의 0.9% 염화나트륨 용액을 피하주사합니다. 마지막에는 마우스를 가열 램프 아래에 놓아 마취에서 회복하여 생물 발광 이미징을 수행할 수 있도록 합니다.

3%iso, 불소 및 산소의 혼합물로 마우스를 마취합니다. 그런 다음 마우스를 광자 이미저에 놓습니다. 불소를 1.5%로 조정하여 마취 수준을 낮추십시오.다음으로, 체중 1kg당 150mg으로 루시퍼를 정맥 주사합니다.

포토 비전 소프트웨어를 사용하여 5분 동안의 이미지를 획득합니다. 그런 다음 M three vision 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리를 수행하고 고정된 관심 영역을 사용하여 관찰된 신호를 정량화합니다. 자기공명영상(MRI)을 수행하려면 산소와 산화질소의 혼합물에 3%ISO 불소를 주입하여 마우스를 마취합니다.

그런 다음 수평 9.4 Tesla MR 시스템의 고정 장치에 마우스를 놓습니다. 불소의 is를 1%로 조정하여 마취 수준을 낮추십시오.다음으로 탈수를 방지하기 위해 마우스의 눈에 연고를 바르십시오. 그런 다음 직장 프로브를 사용하여 체온을 모니터링하십시오.

그런 다음 마우스의 배 아래에 센서를 배치하여 호흡 속도를 모니터링합니다. 호흡 속도를 분당 110회 이상 또는 마이너스 10회로 유지하고 체온을 섭씨 37도 ± 0.5도의 좁은 범위 내에서 일정하게 유지하십시오. 그런 다음 표면 RF 코일을 마우스 헤드 위에 놓습니다.

마우스를 자석 중앙에 놓습니다. 다음으로 ParaVision 5.1을 열고 동봉된 원고에 따라 시퀀스 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 특정 해부학적 정보를 얻기 위해 10개의 코로나 T 2개의 가중 스핀 에코 이미지 세트를 획득합니다.

70마이크로미터 제곱의 일반 해상도로 줄기세포 이동을 연구하기 위한 NT 2성 가중 그래디언트 에코 이미지. 이 단계에서는 마우스를 희생하고 뇌를 제거합니다. PBS의 4%파라알데히드로 실온에서 2시간 동안 뇌 조직을 고정합니다.

두 시간 후. 뇌 조직을 섭씨 4도의 다양한 자당 구배에 배치하여 탈수시킵니다. 다음 날에는 액체 질소를 사용하여 뇌 조직을 동결하고 준비가 되면 절편화할 때까지 조직을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

저온 유지 장치를 사용하여 뇌 조직을 10마이크로미터 두께의 절편으로 절단합니다. 그 후, 형광 현미경을 통해 염색되지 않은 극저온 절편에서 G-B-M-P-I-O 입자의 청색 형광과 EGFP 발현 세포의 녹색 형광을 스크리닝합니다. 그런 다음 염색되지 않은 극저온 절편에서 염증 세포의 녹색, 적색 배경 형광을 스크리닝합니다.

설명된 빙하 청색 MPIO 라벨링 절차는 BMSC, 루시페라제 EGFP 세포의 매우 효율적인 라벨링을 가능하게 하며, 이는 형광 현미경 검사로 쉽게 검증할 수 있습니다. 다음으로, 마우스의 CNS에 G-B-M-P-I-O, 표지된 BMSC, 루시페라제 EGFP 세포를 이식할 때, 루시페라제 활성을 기반으로 한 생체 내 생물 발광 이미징으로 세포 이식편의 생존을 모니터링할 수 있습니다. 또한, 이식된 세포의 정확한 국소화는 빙하 블루 MPIO의 철 함량을 기반으로 한 생체 내 자기 공명 영상으로 모니터링할 수 있습니다.

마지막으로, 조직학적 분석은 생물 발광 이미징 및 자기 공명 이미징으로 얻은 결과의 검증을 보여줍니다. 발달 후 시간적으로 안정된 EGFP 발현에 의해 안정된 생존을 확인하였다. 이 기술은 분자 이미징 분야의 연구자들이 신경퇴행성 질환에 대한 다양한 동물 모델에서 줄기세포 이식 후 세포 및 분자 이벤트를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 분자 이미징을 수행하고, 생물 발광 및 자기 공명 이미징을 적용하고, 사후 조직학적 평가를 사용하여 생체 내 결과를 적절하게 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.