Name: 마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 줄기세포 이식 후 생존과 위치를 비침습적으로 추적하는 다중영상 기법을. 생체광영상과 자기공명영상을 활용하여 이식 세포의 행동을 정밀 분석하고 조직학적으로 검증하는 방법입니다.

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<p class="jove_content"&gt; 작가의 작품 연구에 연구를 부여 G.0136.11 및 G.0130.11 의한 앤트워프 대학의 부여 ID-BOF 2006 (PPO와 AVdL 부여), (AVdL, ZB와 PPO 부여) 및 1.5.021.09에 의해 지원되었다. 과학 기술에 대한 플랑드르 연구소 BRAINSTIM (ZB와 AVDL 부여)보기 : 학술 연구 - 플랑드르 SBO 연구 기금 IWT-60838에 의한 (FWO-Vlaanderen, 벨기에)에 대한 기금의 N.00 (PPO에 부여) EC-FP6-가지고와 DiMI (LSHB-CT-2005-512146)에 의해 부분 플레미쉬 정부에서 Methusalem 연구 기금 (ZB 부여), EC-FP6-가지고와 에밀 (LSHC-CT-2004-503569)에 의한 부분 그리고 남북 대학 매력 폴란드에 의한 IUAP-NIMI-P6/38 (AVDL 부여). 나탈리 드 Vocht는 FWO-Vlaanderen에서 박사 학위 - 학생이기을 보유하고 있습니다. 피터 Ponsaerts는 FWO-Vlaanderen의 포스트 박사 동료입니다.</p

1. 셀 준비 <ol><li> 실험은 유전자 루시페라제 및 eGFP 기자 단백질을 표현하는 설계 전직 생체내 교양 줄기 세포 인구를 사용하여 시작되어야합니다. 여기는 이전 Bergwerf 외. 2, 5에 기술된 / 루시페라제 eGFP - 표현 murine 골수 파생 stromal 세포 (BMSC-Luc/eGFP)을 사용합니다. </li><li> 1 μg / ML의 Puromycine로 보충 15 ML 전체 확장 매체 (CEM)에 T75 문화 플라스크 당 8 × 10 5 세포의 밀도의 전지 라벨, 플레이트 BMSC-Luc/eGFP 세포 이틀전 일. </li><li> 세포가 37에서 48 시간 동안 성장할 수 있도록 허용 ° C에서 5 % CO 2. </li><li> 5 추가 X 10 6 빙하 블루 마이크론 크기의 철 산화물 입자 (GB MPIO) 성장 세포 배양에 당 ML 배지 (총 : 75 × 10 T75 문화 플라스크에서 15 ML 문화 매체 당 6 입자). </li><li> endocytosis를 통해 입자 이해 가능하도록 16 시간 동안 알을 품다. </li><li> 남은 입자를 멀리 씻으그리고 세포에 GB MPIO의 세포 confluency 및 균질 분포를 얻기 위해 추가로 24 시간 동안 성장할 수 있습니다. </li><li> eGFP + 세포의 총 금액 eGFP + 및 GB MPIO + 세포의 비율을 계산하여 형광 현미경을 사용하여 시각적으로 입자 이해를 확인합니다. </li><li> 워시 기가바이트 MPIO-라벨 BMSC-Luc/eGFP 전지 두번 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 치료 (5 분 T75 문화 플라스크 당 5 ML)에 따라 10 ML PBS 및 수확 세포와. </li><li> 133 X 10 6 세포 / PBS에서 ML의 최종 농도에서 수확한 세포 resuspend 씻으십시오. </li><li> 이식까지 얼음 세포를 유지. </li></ol> 2. 마우스의 CNS의 세포 주입 <ol><li> 300ml의 intraperitoneal 주사 (80 밀리그램 / ㎏) + xylazine (16 밀리그램 / ㎏) 혼합하여 쥐를 마취시키다. </li><li> 쥐가 잠들 수 있도록 5 분 동안 기다리십시오. </li><li> 멸균 조작을 할 수 있도록 마우스 머리를 면도. </li><li> stereotactic 프레임에 마우스를 놓습니다. </li><li> 를 Desinfect피부와 생쥐의 눈이 탈수를 방지하기 젖었어. </li><li> 두개골을 노출하는 중간선 두피 절개를 만들고, 주어진 좌표에 치과 드릴 버를 사용하여 두개골에 구멍을 뚫을 : 후부 2mm와 Bregma 옆으로 2mm합니다. </li><li> 간단히 와동 세포 현탁액을하고 주사기의 세포 현탁액을 기음. </li><li> 경질 아래에 2.5 mm의 깊이에서 주사기 바늘을 넣고 1 분 압력 평형을 허용합니다. </li><li> 자동화된 마이크로 주입 펌프를 사용하여 경질하에 2mm의 깊이에서와 0.70 μl / 분 속도로 3 μl 세포 현탁액 (4 × 10 5 세포)를 주사. </li><li> 주입된 세포 현탁액의 역류를 방지하기 위해 추가로 5 분 기다리십시오. </li><li> 천천히 바늘을 철회하고 피부를 suturing 전에 피부 테두리를 소독. </li><li> 탈수를 방지하기 위해 subcutaneously 300 μl 0.9 % NaCl 용액을 주사하고, 마취로부터 회복하기 위해 히팅 램프 아래에 마우스를 놓습니다. P를 관리제도적 기준에 따라 OST-요원은 진통. </li></ol> 3. 생체내 Bioluminescence에서 <ol><li> isoflurane과 산소 3%의 혼합물에 의해 생쥐를 마취시키다. </li><li> 광자 영상기에서 쥐를 넣은 isoflurane과 산소 1.5 %로 마취 수준을 줄일 수 있습니다. </li><li> 정맥 kg의 체중 당 150 MG D-luciferin을 주사. </li><li> 사진 비전 소프트웨어를 사용하여 5 분 영상을 취득. </li><li> M3vision 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리를 수행합니다. 관심 고정 영역을 사용하여 관찰된 신호를 계량. </li></ol> 4. 생체내 자기 공명 영상에서 <ol><li> N 2 O (3시 7분) : O 2 혼합물의 isoflurane 3퍼센트로 쥐를 마취시키다. </li><li> 수평 9.4T MR 시스템의 restrainer에 생쥐를 삽입하고 마취 수준 O 2 혼합물의 isoflurane 1 % 감소 : N 2 O (3시 7분을). </li><li> dehydra을 방지하기 위해 생쥐의 눈을 물에 적셔기는 마우스 배꼽 아래에 센서를 배치하여 체온을 모니터하고 호흡 속도를 모니터링하는 직장​​ 프로브를 연결합니다. </li><li> 110 ± 분당 10 심호흡으로 호흡 율을 유지하고 ± 0.5가 ° C. 37 좁은 범위 내에서 체온이 일정하게 유지 </li><li> 마우스 머리와 자석의 중간 위치에 마우스를 위에 표면의 RF 코​​일을 배치합니다. </li><li> 70 μm의 2 인 - 비행기 해상도로 줄기 세포 이주를 공부하기 위해 구체적인 해부 학적 정보 및 T2 *-가중 기울기 에코 (GE) 이미지를 취득하는 10 코로나 T2-가중 스핀 에코 (SE) 이미지 세트를 취득. 반복 시간 (TR)를 : 다음과 같이 순서대로 매개 변수를 설정 500 MS, 에코 시간 (TE) : 8 MS (GE 순서) 및 반복 시간 (TR) : 4,200 MS, 에코 시간 (TE) : 12.16 MS (SE 순서); 18x18 mm 2, 매트릭스 : 256x256, 1 밀리미터 슬라이스 두께 1mm 슬라이스 분리 (Paravision 5.1 소프트웨어) 뷰 (FOV)의 필드. </li><li> 데이터 처리를 수행Amira 4.0 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol> 5. 해부 조직학 <ol><li> isofluorane (4 %), 산소 (0.5 L / 분)과 질소 (1 L / 분) 2 분 동안 혼합물을 흡입하여 매우 깊이 쥐를 마취시키다. 경추 탈구로 쥐를 희생. </li><li> 두개골에서 마우스 두뇌를 제거하고 2 시간 PBS에서 4 % paraformaldehyde에서 뇌 조직을 흥분시키는. </li><li> PBS의 20 % 자당의 하룻밤 PBS에서 10 %의 자당에 PBS, 2 시간의 5 % 자당에 2 시간 : 자당의 다양한 그라디언트 년 이후 두뇌를 배치하여 뇌 조직을 탈수. </li><li> 액체 질소를 사용하여 뇌 조직을 고정시키고 sectioning 때까지 -80 ° C에서 조직을 저장합니다. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 10 μm의 두께는 섹션의 섹션 뇌 조직. </li><li> 화면에 GB MPIO 입자와 형광 현미경을 사용하여 eGFP 표현 세포에서 녹색 형광의 청색 형광을 위해 cryosections를 흠없는. </li><li> 화면에 대한 cryosections를 흠없는염증성 세포에서 적색 / 녹색 배경 형광. </li><li> 세포 이식은 상호 작용 내생 세포 인구를 (예 : microglia, astrocytes, T 세포, ...)를 식별하는 데 더욱 immunohistochemical 및 immunofluorescent stainings를 수행합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 우리는 여기서 시각 생쥐의 CNS에서 루시페라제 / eGFP-표현 (줄기) 세포 집단의 성공 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 표현했습니다. 처음에는 쉽게 확인할 수 있습니다 BMSC-Luc/eGFP 세포의 효율 라벨에 설명된 기가바이트 MPIO의 라벨링 절차 결과는 형광 현미경 (그림 2A)를 사용. 다음으로, 기가바이트 엠피오의 접목에 따라 생쥐의 CNS에서 BMSC-Luc/eGFP이라는, 세포 이식의 생존은 루시페라제 활동 (그림 2B)을 기반으로 생체내 BLI에 의해 모니터할 수 있습니다. 또한, 이식할 세포의 정확한 지방화는 생체내에 의해 모니터할 수 있습니다 </em&gt;를 기가바이트 MPIO (그림 2C)의 철분 함유량을 기준으로 MRI. 마지막으로, histological 분석 BLI와 MRI로 확인한 결과의 검증을 허용합니다. 안정적인 생존은 시간에 안정 eGFP 표현 (그림 2D)에 의해 확인되었다. 본 내용의 colocalization eGFP은 - 표현 청색 형광 엠피오와 세포 것은 현지화 및 이식할 세포의 생존의 정확한 결정을 허용합니다. 또한, 줄기 세포의 이중 형광 라벨은 염증 세포가 5로 만든 배경 형광을 기반으로 거짓 긍정적인 결과를 관찰할 수있는 가능성을 줄여줍니다. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> 그림 1. 처리 순서의 개요 <ol class="lroman"><li> 휴대폰 라벨 : BMSC-Luc/eGFP은 ML 문화 매체 당 5 × 10 6기가바이트 MPIO 입자로 분류된다. 16 부화의 시간과 24 시간의 다음과 같은 휴식 기간이 지난 후에 세포를 위해 수확하고했습니다만 주입. </li><li> 세포 이식 : bregma -2 음, 경질 미만의 중간선과 2mm에서 2 밀리미터 오른쪽 : 기가바이트 엠피오는 BMSC-Luc/eGFP는 다음과 같은 좌표에서 마우스의 뇌에 이식할 있습니다 분류. </li><li> 생체내 BLI 년 : 체중을 D-luciferin/kg 150 밀리그램의 아래에 정맥 주사 관리, 생성된 빛이 광자 영상기를 사용 오분 동안 획득한 것입니다. </li><li> 생체내 MRI 년 : 70 μm의 2 인 - 비행기 해상도를 갖춘 10 개 코로나 T2-가중 스핀 에코 (SE) 영상과 T2 *-가중 기울기 에코 (GE)의 이미지 집합 인수되었다. 반복 시간 (TR)를 : 다음과 같이 시퀀스 매개 변수가 있었 500 MS, 에코 시간 (TE) : 8 MS (GE 순서) 및 반복 시간 (TR) : 4,200 MS, 에코 시간 (TE) : 12.16 MS (SE 순서); 18x18 mm 2, 매트릭스 : 256x256, 1 밀리미터 슬라이스 두께 1mm 슬라이스 분리 뷰 (FOV)의 필드. </li><li> 사후 조직학 : 10μm 두께 cryosection는 표현 eGFP과 청색 fluorescently 분류 BMSC U 동안 상영되었다형광 현미경을 노래. </li></ol><img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> 줄기 세포 이식의 그림 2. Multimodal 이미징 <ol class="ualpha"><li> 빙하 파란 (GB) 엠피오의 직접 immunofluorescence 현미경은 BMSC-Luc/eGFP을 분류. </li><li> 4x10 5 주입된 생쥐의 생체내 BLI에서는 기가바이트 엠피오는 주 1 주입 후 주 2 시에 BMSC-Luc/eGFP 세포를 분류. 주 1, 주 2 사후 이식에서 발견 BLI 신호의 통계적 분석. 데이터가 5 분 기간 동안의 cm2 당 steradian 당 초 당 광자의 평균 개수 (산도 / S / SR / cm 2)로 표현됩니다 + / - 맑은 BLI 신호를 보여주는 생쥐의 관심을 고정 영역에서 계산된 표준 오차 사출 사이트. </li><li> 그리고 레이블이 지정되지 않은 BMSC-L : 기가바이트 MPIO의 코로나 2 차원 MRI는 BMSC-Luc/eGFP를 ((I) T2-가중 스핀 에코 이미지 그리고 (ii) T2 *-가중 기울기 에코 영상 왼쪽 패널)로 분류UC / eGFP (오른쪽 패널 : (3) T2-가중 스핀 에코 영상과 (VI) T2 *-가중 기울기 에코 이미지) 마우스 뇌에 이식. </li><li> 기가바이트 MPIO의 Histological 분석은 주 2 사후 주입에 BMSC-Luc/eGFP 이식이라는. eGFP - 표현 및 GB MPIO 분류 BMSC-Luc/eGFP 이식술의 지방화를위한은 (i) 직접 immunofluorescence 분석. 의 (2) 높은 배율 세부 사항은 (i). 기가바이트 MPIO의 주변에서 astrocytic 반흔 조직의 발전을 나타내는 GFAP 항원에 대한 (3) Immunofluorescent 염색법은 BMSC-Luc/eGFP 라벨. Iba-1 항원에 대한 (VI) Immunofluorescent 염색법, 침략을 나타내는 및 GB MPIO의 주변은 microglia 의해 BMSC-Luc/eGFP이라는. </li></ol>

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</ol>

저자는 이익 갈등을 선언 없습니다.

이 보고서에서는 면역 관할 생쥐의 CNS의 세포 이식의 세부 특성화 세 보완 이미징 modalities의 조합 (BLI, MRI 및 조직학)에 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 리포터 유전자 반딧불 루시페라제 및 eGFP, 및 GB 엠피오와 직접적인 셀 라벨과 유전자 조작을 바탕으로 세포의 리포터 유전자 라벨,의 조합이 생체내에서 줄기 세포 이식의 정확한 평가로 안내합니다. BMSC의 입자 라벨은 음이온 표면 (카르 복실 대체)와 함께 기가바이트 MPIO 입자 크기 (1.63μm)이 아닌 phagocytic 세포 16-18하여 이러한 입자 endocytotic 이해를 촉진하기 위해 제안합니다. 그러나, 높은 상표 효율을 얻을 배양 시간이 셀 타입에 의존 것을 언급해야합니다. 예를 들어, phagocytic 세포 (macrophages 및 돌기 세포 등)보다 신속하게 이러한 입자를 internalize 수 있습니다 (0.5의 배양 시간 - 1 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Lonza </td><td> BE12-722F </td><td> 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td><td> 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 </td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 1605-122 </td><td> 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td> 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td> 세포 성장 매체 CEM의 구성 요소 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 14,190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Invivogen </td><td> 개미-PR-1 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 </tD&gt; <td> Gibco </td><td> 25,300 </td><td></td></tr><tr><td> 기가바이트 MPIO </td><td> 앞머리 연구소 </td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferin </td><td> Promega </td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td> 케타민을 (Ketalar) </td><td> 화이자 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (Rompun) </td><td> 바이엘 헬스케어 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> Isoflo </td><td> 05260-05 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9 % NaCl 용액 </td><td> 벡스터 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyde </td><td> 머크 </td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td> 미세 분사 펌프 </td><td> KD 과학 </td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td> 광자 영상기 </td><td> Biospace 연구소 </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9.4T MR 스캐너 </td><td> Bruker Biospin </td><td> Biospec 20분의 94 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom HM 그라 이오 스탯 </td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> 해밀턴 </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> 30 게이지 바늘 </td><td> 해밀턴 </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> 포토 비전 소프트웨어 </td><td> Biospace 연구소 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3vision 소프트웨어 </td><td> Biospace 연구소 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paravision 5.1 소프트웨어 </td><td> Bruker Biospin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amira 4.0 소프트웨어 </td><td> 얼굴 이미징 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 multimodal 이미징

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

지난 10 년 동안 줄기 세포 이식은 잠복기 및 임상 연구에서 두 질환의 다양한 주 또는 보조 치료 양상 등의 증가하고 관심을 받고있다. 그러나, 기능적 결과 및 / 또는 조직 재생 다음과 줄기 세포 이식에 관한 결과가 매우 다양 날짜입니다. 일반적으로 임상 혜택은 기본 메커니즘 (들) 1의 깊은 이해없이도 관찰된다. 따라서 여러 노력은 정확하게 생존, 운명 및 이식할 줄기 세포 및 / 또는 그들의 마이크로 환경의 생리를 평가하는 데 궁극적인 목표로 이식 줄기 세포를 모니터링하는 다른 분자 이미징 modalities의 발전에 주도했습니다. 분자 이미징에 의해 결정 하나 이상의 매개 변수에서 관찰 변경 관찰된 임상 효과에 관한 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리의 연구는 bioluminescence 이미징의 통합 이용 (BLI), 자기 공명 영상 (MRI) 및 histological analysi에 초점S는 이식 줄기 세포를 평가합니다. BLI는 일반적으로 비 invasively 세포 루시페라제-리포터 유전자를 표현하는 생화 학적 반응을 바탕으로 이식 2-7, 다음 셀 추적을 수행하고 시간에 세포 생존을 모니터링하는 데 사용되는 것은 그것의 기판에 빛을 다음과 같은 상호 작용을 방출 수 있습니다 (예 : D- luciferin) 8, 9. 반면 MRI는 민감도가 높은 MRI 대비 에이전트와 함께 세포 라벨 이후에 생성되는 반면에 달려 있지만, 10 임상 적용하고 정확하게 매우 높은 해상도를 11-15로 세포 이식을 찾습니다하는 데 사용할 수있는 비침습 기술이다 . 마지막으로, 사후 histological 분석은 높은 해상도와 감도있는 비침습 방법으로 얻은 연구 결과를 확인하기 위해 선택한 방법입니다. 또한 엔드 포인트 histological 분석은 우리가 이식할 세포 및 / 또는 주변 조직, 바의 상세한 phenotypic 분석을 수행할 수 있습니다형광 기자 단백질 및 / 또는 특정 항체와 직접 셀 라벨링의 사용에 SED. 요약하면, 우리는 여기에 시각적으로 서로 다른 줄기 세포 및 / 또는 환경 관련 생쥐의 CNS에서 이식 줄기 세포에 따라 특성을 해명하는 BLI, MRI 및 조직학의 complementarities를 보여줍니다. 예를 들어, 뼈가 골수는-파생된 유전자 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)와 반딧불 루시페라제 (fLuc) 및 청색 형광 마이크론 크기의 철 산화물 입자 (MPIOs)로 레이블을 표현할 수 있도록 설계 stromal 세포를,에 이식할 예정 면역 - 관할 마우스 및 결과의 CNS는 BLI, MRI 및 조직학 (그림 1)에 의해 모니터링됩니다.

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

지난 10년 동안 줄기세포 이식은 다양한 질환에 대한 1차 또는 2차 치료법으로서 점점 더 많은 관심을 받아왔으며, ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 마우스 뇌로 이식된 줄기세포의 생체 내(in vivo) 거동에 대한 표준화된 추적 관찰을 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 EGFP와 루시퍼레이스(luciferase)를 공동 발현하는 골수 유래 기질 세포를 형광 마이크론 크기 산화철 입자(MPIO)로 표지합니다. 두 번째 단계는 MPIO로 표지된 BMC를 마우스 뇌 조직에 적절하게 주입하는 것입니다.다음으로, 생물발광 이미징(bioluminescence imaging)과 자기공명영상(magnetic resonance imaging)을 사용하여 세포 이식편의 생존 및 국소화를 비침습적으로 추적합니다. 마지막 단계는 사후 조직학적 분석을 통해 인비보(in vivo) 이미징 결과를 검증하는 것입니다. 이러한 방법들은 마우스 뇌로 이식된 줄기세포의 거동에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 모델 생물이나 질병 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.정맥 및 뇌내 주사는 수행하기 어렵고 동물의 생존에 특정 위험이 따르기 때문에 동물 핸들링 단계를 습득하기 어려우므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차를 시작하려면, sub confluent 상태로 성장 중인 세포 배양액에 75 times 10 to the six glacial blue micron sized iron oxide particles를 첨가하십시오. 엔도사이토시스(endocytosis)를 통한 입자 섭취가 가능하도록 16시간 동안 추가로 배양한 후, 남아 있는 입자들을 세척하여 제거하십시오.세포의 합류도(confluency)를 확보하고 G-B-M-P-I-O의 균질한 분포를 유도하기 위해 세포를 24시간 더 배양합니다. 그 후, EGFP 양성 세포의 총 수 대비 EGFP 양성 및 G-B-M-P-I-O 양성 세포의 비율을 계산하여 형광 현미경으로 입자 섭취 여부를 시각적으로 검증합니다. 다음으로, G-B-M-P-I-O가 표지된 BMSC luciferase EGFP 세포를 10 milliliters로 2회 세척합니다.PBS로 세포를 처리한 후 trypsin EDTA로 처리하고 이후에 세포를 수확합니다. 그런 다음 세포를 세척하고 PBS에서 최종 농도가 133 × 10⁶ cells/mL가 되도록 재부유합니다. 마지막으로, 이식 전까지 세포를 얼음 위에 보관합니다.이 절차에서는 ketamine 80 mg/kg과 xylazine 16 mg/kg의 혼합물을 복강 내 주사하여 마우스를 마취합니다. 마우스가 잠들 때까지 5분 동안 기다린 후, 무균 조작이 가능하도록 머리를 삭모합니다. 다음으로 마우스를 정위 고정 틀(stereotactic frame)에 배치하고 알코올로 피부를 소독합니다.그 후, 탈수를 방지하기 위해 눈에 연고를 도포합니다. 해마를 타겟팅하기 위해 두개골을 노출시키도록 두피 정중앙을 절개합니다. 치과용 드릴 버를 사용하여 두개골의 후방 2mm, 외측 2mm 지점에 구멍을 뚫습니다.이 단계에서 세포 현탁액을 짧게 볼텍싱한 후, 주사기로 세포 현탁액을 흡입합니다. 이어서 주사 바늘을 경막 아래 2.5 mm 깊이까지 내리고 1분 동안 압력이 평형을 이루도록 기다립니다. 1분 후, 바늘을 경막 아래 2 mm 위치까지 후퇴시킵니다.그 다음, 자동 미세 주입 펌프를 사용하여 0.70 µL/min의 속도로 세포 현탁액 3 µL를 주입합니다. 주입 후에는 주입된 세포 현탁액의 역류를 방지하기 위해 5분 동안 더 기다립니다. 이어서 바늘을 천천히 제거합니다.그 후, 피부 경계 부위를 소독하고 피부를 봉합합니다. 탈수를 방지하기 위해 0.9% sodium chloride solution 300 µL를 피하 주사합니다. 마지막으로, 마우스가 마취에서 회복되어 생물 발광 이미징을 수행할 수 있도록 가열 램프 아래에 둡니다.3% iso-fluorine과 산소 혼합물로 마우스를 마취합니다. 그다음 마우스를 광자 이미저(photon imager)에 배치합니다. iso-fluorine 농도를 1.5%로 조절하여 마취 수준을 낮춥니다. 이어서 d-luciferin을 체중 kg당 150 mg의 용량으로 정맥 주사합니다.photo vision 소프트웨어를 사용하여 5분 동안 이미지를 획득합니다. 그 후, M three vision 소프트웨어를 사용하여 이미지 프로세싱을 수행하고, 설정된 관심 영역(ROI)을 통해 관찰된 신호를 정량화합니다. 자기공명영상을 촬영하기 위해, 산소와 일산화질소 혼합물에 3% ISO fluorine을 첨가하여 마우스를 마취시킵니다.그런 다음 마우스를 수평형 9.4 Tesla MR 시스템의 구속 장치에 넣습니다. 이소플루란 농도를 1%로 조정하여 마취 수준을 낮춥니다. 다음으로, 탈수를 방지하기 위해 마우스의 눈에 연고를 바릅니다. 그 후, 직장 프로브를 사용하여 체온을 모니터링합니다.그다음 마우스 복부 아래에 센서를 배치하여 호흡수를 모니터링합니다. 호흡수는 분당 110 ± 10회로 유지하고, 체온은 37 ± 0.5 °C의 좁은 범위 내에서 일정하게 유지합니다. 이후 마우스 머리 위에 표면 RF 코일을 배치합니다.마우스를 자석의 중앙에 위치시킵니다. 다음으로 ParaVision 5.1을 실행합니다. 함께 제공된 원고에 따라 시퀀스 매개변수를 설정하십시오. 그런 다음 구체적인 해부학적 정보를 얻기 위해 10장의 관상면 T2 가중 스핀 에코 이미지를 획득합니다.평면 해상도 70 µm²로 줄기세포 이동을 연구하기 위해 NT two star 가중 그라디언트 에코 영상을 획득합니다. 이 단계에서는 마우스를 희생시켜 뇌를 적출합니다. PBS 내 4% 파라포름알데히드 용액을 사용하여 실온에서 2시간 동안 뇌 조직을 고정합니다.2시간 후, 4°C에서 다양한 농도의 sucrose 구배에 뇌 조직을 넣어 탈수시킵니다. 다음 날, 액체 질소를 사용하여 뇌 조직을 급속 냉동하고, 절편 제작 전까지 -80°C에서 조직을 보관합니다.크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 뇌 조직을 10 µm 두께로 절편화합니다. 그 후, 형광 현미경 하에서 염색되지 않은 동결 절편을 스크리닝하여 G-B-M-P-I-O 입자의 청색 형광과 EGFP 발현 세포의 녹색 형광을 확인합니다. 이어서, 염색되지 않은 동결 절편을 스크리닝하여 염증 세포로부터 발생하는 녹색 및 적색 배경 형광을 확인합니다.설명된 glacial blue MPIO 표지 절차는 BMSC, luciferase EGFP 세포를 매우 효율적으로 표지하며, 이는 형광 현미경으로 쉽게 검증할 수 있습니다. 다음으로, G-B-M-P-I-O로 표지된 BMSC, luciferase EGFP 세포를 마우스의 중추신경계(CNS)에 이식하면, luciferase 활성에 기반한 인비보(in vivo) 생물 발광 이미징을 통해 세포 이식물의 생존 여부를 모니터링할 수 있습니다. 또한, glacial blue MPIO의 철 함량에 기반한 인비보(in vivo) 자기공명영상을 통해 이식된 세포의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.마지막으로, 조직학적 분석을 통해 생체 발광 이미징 및 자기공명 이미징으로 얻은 결과가 검증되었습니다. 이식 후 시간이 경과함에 따라 EGFP 발현이 안정적으로 유지됨으로써 안정적인 생존이 확인되었습니다. 이 기술은 분자 이미징 분야의 연구자들이 다양한 신경퇴행성 질환 동물 모델에서 줄기세포 이식 후의 세포 및 분자적 사건을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 생체 발광 및 자기공명영상을 이용한 분자 이미징 수행 방법과 사후 조직학적 평가를 통해 인비보(in vivo) 결과를 적절히 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Daynac, M., et. al입니다. 성체 쥐 심실하 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 분류 및 세포 주기 역학의 라이브 이미징. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 형질전환 마우스 뇌에서 신경 줄기 세포(NSC)의 타임 랩스 이미징을 보여줍니다. NSC는 G1 단계에서 적색 형광을 발하고 다른 세포 주기 단계에서는 형광을 발하지 않습니다. 부착된 NSC 배양물을 이미징 챔버에 배치하고, 이미징 파라미터를 설정하고, 원하는 기간 동안 일정한 간격으로 이미지를 캡처합니다.

컨포칼 현미경을 사용한 마우스 신경 줄기 세포 분열의 타임 랩스 이미징

Two-photon intravital imaging은 등쪽 기둥 외상성 척수 파쇄 손상이 있는 골수 키메라 동물의 원래 조직 환경에서 척수의 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

자가 및 동종 골 이식의 주입은 주요 두개 안면 뼈 손실을 치료하는 방법을 받아 구성한다. 그러나 혈관 신생, 세포 분화 및 골 형성 간의 상호 작용에 그래프트 조성물의 효과는 불분명하다. 우리는 이식 근접에서 혈관 신생 골 형성의 상호 의존성을 규명하는 것을 목표로 멀티 모달 이미징 프로토콜을 제시한다.

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

이 프로토콜은 두개골 외상성 뇌 손상의 마우스 모델과 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 세포의 이식에 대한 방법론을 상해 부위내로 시연한다. 이 절차에서 결과의 행동 그리고 조직학 시험은 또한 간략하게 기술됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

신경 줄기 세포를 전달하는 방법, 용액 또는 현탁액을 주입하기 위한 적응성, 일반적인 경동맥을 통해 (마우스) 또는 외부 경동맥 (쥐) 허혈성 뇌졸중 후보고된다. 주입된 세포는 뇌 의 자당종 전체에 광범위하게 분포되며 전달 후 최대 30d까지 검출될 수 있다.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

우리는 마우스 뇌에서 루시페라아제-녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 이중 리포터 벡터로 형질도입된 인간 신경 전구 세포의 사다리꼴 이식을 기술한다. 이식 후, 루시퍼라아제 신호는 형광 현미경을 사용하여 뇌 절편에서 확인된 생체 내 생체 발광 및 GFP 발현 이식된 세포를 사용하여 반복적으로 측정된다.

Intracerebral 이식 및 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 생체 내 생체 발광 추적

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

Intravital microscopy 결과의 번역은 조직에 대한 얕은 깊이 침투로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 직접적인 공간 상관 관계를 위해 생체 내 현미경 검사와 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식(예: CT, MRI)을 함께 정합할 수 있는 등쪽 창 챔버 마우스 모델에 대해 설명하며, 이를 통해 생체 내 현미경 검사 결과의 임상 번역을 간소화할 수 있습니다.

중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델

배우세요 마우스 뇌 줄기세포 이식 후 생존과 위치를 비침습적으로 추적하는 다중영상 기법을. 생체광영상과 자기공명영상을 활용하여 이식 세포의 행동을 정밀 분석하고 조직학적으로 검증하는 방법입니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

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