Name: 연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경 Aplysia (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 배우세요 Aplysia 신경절에서 칼슘 이미징과 세포내 전기생리 기록을 결합하여 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능을 동시에 모니터링하는 방법. 이 기술은 시냅스 가소성 연구에 활용됩니다.

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PHS 기금 (MH51393)는이 일을 지원합니다. 우리가 사용하는 Aplysia의 일부는 연구 자료, NIH의 국립 센터에서 부여 RR10294 아래의 마이애미 대학의 Aplysia을위한 국가 자원에 의해 제공됩니다.

1. 준비하기 <ol><li> 75-100 ML 등장 염화 마그네슘 용액을 주입하여 동물을 마취. 우리는 이미지에 사용 Aplysia은 일반적으로 150-200그램하고 Marinus 과학에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 왁스 대상 접시에 anesthetized 동물을 핀. 주사기 바늘은이 목적을 위해 잘 작동, 멸균 기술은 필요하지 않습니다. 총 포셉 및 표준 가위를 사용하면 동물의 발에 절개를하고 구강 질량을 쉽게받을 수 있습니다. 구강 신경을 찾습니다. 모든 구강 신경을 절단하여 신경을주의 깊게 무료, 스프링 가위와 고급 포셉을 사용합니다. </li><li> 신경을 제거하고 인공 해수를 포함하는 Sylgard 코팅 접시에 배치합니다. 신경을 안정 구강 신경을 통해 몇 곤충 핀을 배치합니다. Desheath 세포 녹화 뉴런을 노출 초 미립 포셉, 봄의 가위, 수 있도록 사용하여 구강 신경절. 그런 다음 15 고급 벌레를 (사용하여 신경을 다시 핀 분utien) 핀. 모든 운동은 영상 중에 문제가 될 것 같은 신경이 곳에서 단단히 개최해야합니다. </li></ol> 2. 전극을 준비 <ol><li> 필라멘트와 유리 모세관 튜브를 사용하여 전극 (예 : WPI TW100F-4)와 풀러를 당겨. 설정은 개별적으로 필요한 저항의 전극을 만드는 데 결정해야합니다. 전극 beveled 할, 또는 5 MOhms에 대해 beveling 단계가 생략 된 경우 경우 3 M KAC로 가득 할 때 (칼륨 아세테이트)의 전극 저항은 10 MOhms에 대한 일반적입니다. </li><li> 주사기와 바늘 microfil를 사용하여 3 M KAc/30 밀리미터 KCl을 포함하는 솔루션 전극의 한 세트를 입력합니다. 이 전극은 전기 생리학을 위해 사용됩니다. </li><li> , 염색의 전극의 뒷면 끝을 찍어하여 칼슘 표시기 염료와 전극의 두 번째 세트를 작성 이전에 약으로 재구성. 500μg 염료 40 μl 증류수. 전극의 끝이 가득했을 때, 다시 4분의 1에 대한 인치 작성좋은 전기적 접촉을 위해 KCl 200 MM와 전극의 끝. </li><li> 이 염료 주입을 용이하게하고 여러 막 침투 의해 수행 피해를 줄여으로는, 베벨 전극을에 유용합니다. 우리는 소금 물 / 알루미나 분말 정지의 스트림을 생성하는 사용자 정의 beveler을 사용합니다. 전극은 홀더에 장착하고 팁은 45 ° 각도에서 스트림을 입력합니다. 저항이 KAC 가득 전극 약 5 MOhm에 도달하면 전극 저항은 지속적으로 모니터링하고 beveling가 종료됩니다. 염료 가득 전극은 시간의 동일한 금액을 beveled 일반적으로 15-20 MOhm의 저항이 있습니다. </li></ol> 3. 칼슘 표시기 염료로드 <ol><li> 전기 생리학의 장비에 대한 준비를 놓고 시각적으로 관심 presynaptic 신경 세포를 찾습니다. 우리 실험의 대부분은 먹이, B21 5, 6시 활용 식별 감각 뉴런으로 이루어집니다. 상대적으로 고정 positioN, 크기 (~ 100 μm)와 B21의 소마의 길쭉한 모양을 찾아 쉽게합니다. </li><li> 칼슘 표시기 염료를 포함하는 전극과 관심의 신경을 찌르. B21의 신원은 이후 시냅스 뉴런 B8를 impaling에 의해 확인 할 수 있습니다. ~ 8 NA 전류와 B21의 탈분극은 스파이크와 B8 7 PSP와을 촉진하는 결과가 게재됩니다. </li><li> 약 30 분 hyperpolarizing 펄스 (일반적으로 -15 없음, 1 Hz에서, 75 % 듀티 사이클)를 전달하여 관심 presynaptic 뉴런에 염료를 주입. 염료 로딩이 성공하면, 신경 세포의 소마는 희미한 핑크 색을 취득합니다. 천천히 뉴런에서 철수하여 염료 함유 전극을 제거합니다. </li><li> 염료가 관심의 뉴런과 시냅스 접촉을 미세 프로세스에 확산 할 수 있도록 약 30 분 동안 준비를 둡니다. </li></ol> 4. 칼슘 이미징 및 Electrophysiological 기록 <ol><li> 이미지 microsc에 준비를 배치ope. 준비 요리는 점토와는 달리, 때 서부 유럽 표준시 끈적 남아 Permagum 씰링 코드 조각과 냉각 플랫폼에 개최됩니다. 고정 무대 현미경은 목표를 이동하여 초점을 맞추고 있습니다. 단계는 자석 마운트 manipulators을 장착 할 수있는 고정 남아 있습니다. 높은 배율이 진동 (특히 측면 운동) 문제를 만들면서, 전체 이미지 설정은 진동 절연 플랫폼에 배치해야합니다. </li><li> 일반 전해질 솔루션을 포함하는 전극과 presynaptic과 postsynaptic 뉴런을 찌르. </li><li> 이미지 칼슘 오렌지에 적합한 필터 블록 (여기 549 나노 미터, 방사 576 nm의) 8을 선택하고 카메라를 조정합니다. 대부분의 과학 CCD 카메라 탐정 아웃 읽는 CCD 셀의 하위 집합을 선택 할 수 있습니다. 또한, 전지 (binned) 결합 될 수있다. 동안 binning 증가 감도, 작은 하위 집합 증가 속도를 선택합니다. 이 두 설정은 함께 노출 시간 결정프레임 속도는 초당 취득 할 수있는 방법을 많은 이미지 즉. 적합 설정됩니다 이미지를 500 X 300 픽셀 (10 배 렌즈와 0.5x 카메라 어댑터를 사용)를 580 X 350 μm 2 영역입니다. 노출 시간 &lt;25 밀리와 올바른 노출을 제공하는 최소한의 금액 조명 강도를 조정 빛 경로에 중립적 인 밀도 필터를 추가합니다. 이러한 설정은 30 Hz의 프레임 속도가 될 - Aplysia에 칼슘 변경을 evoked 이미지 하나의 스파이크에 충분히 빨리이다. 마지막으로, 만 이미징 영역이 밝아 있도록 필드 조리개를 닫습니다. </li><li> 이미징 소프트웨어에서 측정하고자하는 신경 세포의 영역을 표시합니다. 요소 AR 소프트웨어는 이것이 관심 영역 (ROIs)를 배치하여 &quot;시간 측정&quot;절에서 수행됩니다. B21는 양극성 뉴런이며, 이전의 작품은 관심 아홉의의 측면 프로세스 연락처 postsynaptic 신경 증명했다. 우리 일반적으로 이미지 초등, 중등 및 고등 브라뉴런의 각 부분을 통해 투자 수익 (ROI)을 배치하여 측면 과정 nches. 염료 가득 뉴런 옆에 추가 투자 수익 (ROI)은 나중에 다른 모든 데이터 포인트에서 차감되는 배경 값을 제공하는 측정됩니다. </li><li> 카메라의 &quot;프레임 표시 장치&quot;신호가 제공하는 트리거 신호를 기다리 전기 생리학 획득을 (이 실험 스파이크 II)를 지시합니다. 이미지 수집 (요소 AR)을 시작하고, 카메라가 첫 번째 프레임을 데리고 스파이크 II가 자동으로 녹음을 시작합니다. 당신은 또한 간단히 현미경의 카메라 포트에 장착 LED를 켜 1401 전원의 TTL 출력을 사용할 수 있습니다. 이 이후 이미징 및 electrophysiological 데이터를 동기화 할 수있는 신호를 제공합니다. </li><li> 원하는 주파수에서 짧은 depolarizing 현재 펄스의 일련의 주입하여 presynaptic 뉴런을 자극한다. 이 작업 가능성이 successf 여부를 결정하기 위해 (자극 실행 오실로스코프와 함께 예) 각 펄스를 모니터하는 것이 중요합니다ully 생성됩니다. 칼슘 오렌지가 다른 염료에 비해 매우 사진 안정적이지만 발생을 표백 염색 얼마나 확인하는 자극없이 제어 재판을 기록하는 것이 좋습니다. </li><li> 세포 내 칼슘 농도가 조작되는 실험에서, EGTA와 같은 약물은 presynaptic 신경 세포에 도입하고 위에서 설명한 자극 및 데이터 수집 단계는 반복된다. </li></ol> 5. 대표 데이터 분석 <ol><li> 텍스트 파일로 작성하여 이미지 데이터를 (각 투자 수익 (ROI)에 대한 측정 농도 값의 목록) 보냅니다. 스파이크 II의 사용자 정의 스크립트는 텍스트 파일을 가져올 수 있습니다. 이 스크립트는 또한 개별 프로브의 공간이 값을 normalizes 및 배경 프로브의 가치를 차감됩니다. 데이터 포인트는 다음 &quot;가상 RealWave&quot;채널로 전기 생리학 데이터가 함께 꾸몄다 있습니다. 스파이크 II의 &quot;채널 프로세스 / 시간 이동 기능은&quot;정확하게 이미지 데이터 관심 장소를 정렬하는 데 사용됩니다참고로 LED 신호를 사용하여 국세청. </li><li> 퍼센트 변경 등의 값을 구하려면 DF으로 형광의 상대적 변화를 계산하여 영상 데이터를 분석 / F O = (FF O) / F O. F O는 자극시 자극과 F 형광 전에 형광 수준을 나타냅니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 실험의 전체 구조. 실험은 Aplysia의 신경절 준비로 진행됩니다. 세포 내 칼슘의 변화는 iontophoretically presynaptic 신경 세포에 도입되는 형광 염료와 이미징 있습니다. 그 시냅스 전송을 유도하고 모니터링 할 수 있도록 사전 및 postsynaptic 뉴런 그런 다음 날카로운 전극으로 찔려 죽은 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="그림 2" /> <str긴 사연&gt; 그림 2. 칼슘 이미징 및 Aplysia의 구강 신경절에서 확인 뉴런의 세포 내 기록. 신경 B21의 이미징 측면 지점의 (A) 사진입니다. 상자가 관심의 측정 영역을 나타냅니다. B21의 (B1) 세포 자극은 또한 행동 잠재력을 해고 원인 postsynaptic 관심 뉴런 B8 (중간 추적)에서 활동 전위 (하단 추적)과 촉진 postsynaptic 잠재력 (PSP와)를 세상의 시작과 끝. presynaptic 칼슘 형광의 증가는 상단 추적에 표시됩니다. homosynaptic 촉진에 presynaptic EGTA의 (B2) 효과. EGTA는 intracellularly ~ 15분 세포 자극하기 전에 B21에 주입했다. 그것은 EGTA 낮은 농도에서 신경 전달을 억제 할 수있을만큼 빠른 게 느린 행동 칼슘 chelator,라고 생각됩니다. 널리 칼슘 신호와 PSP 진폭의 해당 감소의 감소를 확인합니다. (C) PSP 진폭은 presynaptic calciu 상관 관계m 신호. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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<li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators%3A+Calcium+green%2C+calcium+orange+and+calcium+crimson%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophysical+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li>
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</ol>

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

우리는 동시에 세포 내 칼슘 농도를 모니터링하고 신경 전달의 효능을 평가하는 데 사용할 수있는 기술을 보여줍니다. 이 기술은 단기 소성의 다양한 형태가 중재하는 방법을 결정하는 데 유용합니다. 영상은 형광 현미경과 CCD 카메라로 수행됩니다. 대부분의 기능 이미징 세트 업에 비해이 장비 요구 사항은 상대적으로 겸손입니다. 기술은 간단하고 배우기 쉽다. CCD 카메라와 영상 좋은 시간적 해상도를 가진 넓은 지역의 시각화를 허용하지만, 공간 해상도가 제한됩니다. 따라서 세포 내 칼슘의 상대적으로 광범위한 또는 &#39;배경&#39;증가의 역할에 관한 테스트 가설에 유용한 기술입니다. 쪽의 공간 해상도와 학습 칼슘 역학을 개선하기 위해, 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경, 또는 두 광자 현미경과 칼슘 표시기 칼슘 그린을 그냥 할 수프로토콜 10 만 약간의 수정과 함께 사용할 수.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 칼슘 오렌지 </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘 보정 버퍼 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> 신호의 감도와 동적 범위를 테스트하는 데 유용 </td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 hexahydrate </td><td> 시그마 </td><td> M0250 </td><td> 동물을 마취하는 0.33 M 용액에 사용 </td></tr></tbody></table> 표 1. 시약이 사용됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 장비 명 </td><td> 회사 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> FN-1 똑바로 형광 현미경 </td><td> 니콘 인스트루먼트 </td><td> Narishige과 ITS-FN1 단계 </td></tr><tr><td> NMN-21 manipulators </td><td> Narishige </td><td> 자석으로 무대에 장착 </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 두 CCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> NIS 요소 AR (버전 3.22) </td><td> 니콘 인스트루먼트 </td><td> 이미징 소프트웨어는 형광 데이터를 수집하는 데 사용 </td></tr><tr><td> 10X/0.3w 계획 형석 목표 </td><td> 니콘 인스트루먼트 </td><td> 이 물 침지 렌즈는 3.5 mm의 매우 긴 작동 거리가 </td></tr><tr><td> 120 PC 금속 할로겐화물 램프를 X-인용 </td><td> EXFO </td><td> 형광 이미징에 사용 </td></tr><tr><td> LS-DWL 할로겐 램프 </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> 동부 표준시 - CY3 필터 세트 </td><td> 크로마 기술 </td><td>; </td></tr><tr><td> 전원 1401 A / D 변환기 </td><td> 캠브리지 전자 디자인 </td><td> 샘플링은 3 kHz에서에서 이루어졌다 </td></tr><tr><td> 스파이크 II (버전 7.07) </td><td> 캠브리지 전자 디자인 </td><td> 소프트웨어는 전기 생리학 데이터를 수집하는 데 사용 </td></tr><tr><td> SEC-10 LX 증폭기 </td><td> NPI 전자 </td><td> 10X headstage와 함께 사용 </td></tr><tr><td> 모델 410 증폭기 </td><td> Brownlee 정밀 </td><td> 신호를 증폭하고 필터링하는 데 사용 </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> 마이너스 K 기술 </td><td> 이미지에 대한 진동 절연 </td></tr><tr><td> 냉각 플랫폼 </td><td> 사용자가 만든 </td><td> 황동 플레이트이를 통해 얼음 물 가변 속도 펌프입니다 </td></tr></tbody></table> 표 2. 장비 사용됩니다.

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; aplysia</em

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

그것은 세포 내 칼슘의 변화는 시냅스 소성 (예를 들어, homosynaptic 촉진) 1의 중요한 형태의 수의 유도를 중재하는 것이 좋습니다되었습니다. 이 가설이 동시에 세포 내 칼슘의 변화와 신경 효능에 변경을 모니터링하여 테스트 할 수 있습니다. 우리가이 세포 내 기록 기술을 칼슘 이미징를 조합하여 수행 할 수있는 방법을 보여줍니다. 우리 실험은 연체 동물 Aplysia californica의 구강 신경절로 진행됩니다. 이 준비가 실험적으로 유리한 특징을 가지고 : 신경절 쉽게 Aplysia에서 제거 실험 일반 시냅스 연결을 확인하고 정상 이온 채널 유통이 성인 뉴런을 사용 할 수 있습니다. Aplysia에 대한 자연 동물의 낮은 신진 대사 속도와 상대적으로 낮은 온도 (14-16 ° C)로 인해 준비는 오랜 기간 동안 안정적입니다. 이 긴 파장 형광 염료는 칼슘에 바인딩 할 때 우리가 쉽게 iontophoresis를 통해 신경 세포로 &#39;로드&#39;이다 칼슘 오렌지 2의 셀 impermeant 버전을 사용합니다 세포 무료로 칼슘의 변화를. 감지 할 다닐 &quot;&gt;, 형광 강도가 증가. 칼슘 오렌지가 빠른 운동 특성 3는 ratiometric 염료와는 달리 (예를 들어, Fura 2), 영상에 대한 필터 휠을 필요하지 않습니다. 그것은 안정적이고 다른 염료 (예를 들어, fluo-3) 2,4 이하 phototoxic 상당히 사진입니다. 모든 비 ratiometric처럼 이 로딩 및 확산으로 인한 염료 농도의 변화에​​ 대한 계정 수 없기 때문에 염료는 칼슘 오렌지, 칼슘 농도의 상대적인 변화를 나타냅니다. 그러나, 그것은 절대 칼슘 농도를 제공하기 위해 보정 할 수 없습니다. 수직, 고정 무대, 복합 현미경은 초당 30 프레임 주위에 녹화 할 수있는 CCD 카메라로 이미지 뉴런에 사용되었습니다. Aplysia이 시간적 해상도에서세포 내 칼슘 농도에서도 하나의 스파이크 유도 변경을 감지하기에 충분한 이상이다. 샤프 전극을 동시에 식별 사전 및 postsynaptic 뉴런에서 신경 전달을 유도하고 기록하는 데 사용됩니다. 각 시험의 결론에서, 사용자 정의 스크립트가 전기 생리학 및 이미징 데이터를 결합합니다. 적절한 동기화를 보장하기 위해 우리는 현미경의 카메라 포트에 장착 LED에서 빛 펄스를 사용합니다. presynaptic 칼슘 레벨 (세포 EGTA 주입을 통해 예를 들어)의 조작은 우리가 소성의 다양한 형태의 중재에 세포 내 칼슘의 역할에 관한 구체적인 가설을 테스트 할 수 있습니다.

우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을 보여줍니다<em&gt; Aplysia</em&gt;. 우리는 이미지 세포 내 칼슘을 형광 염료, 칼슘 오렌지, 그리고 날카로운 (세포) 전극과 신경 전달을 유도하고 모니터링을 사용합니다.

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

세포 내 칼슘 변화가 여러 가지 중요한 형태의 시냅스 가소성(예: ...의 유도를 매개한다는 제안이 있어 왔다.

세포 내 칼슘은 시냅스 가소성의 여러 메커니즘에서 중요한 부분인 것으로 시사되어 왔습니다. 이러한 가설들은 칼슘의 변화와 시냅스 효능의 변화를 동시에 모니터링함으로써 검증할 수 있습니다. 본 영상에서는 칼슘 이미징과 세포 내 기록법을 결합하여 이를 수행하는 방법을 설명합니다.본 실험은 연체동물인 Aplysia Cahora의 신경절을 사용하여 수행됩니다. 이 표본은 크고 식별 가능한 뉴런, Aplysia의 천연 상태인 저온 환경, 그리고 이미징을 용이하게 하는 느린 신호 전달 등의 여러 장점이 있으며, 여기서 시연하는 일반적인 기술들은 다른 시스템에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 뉴욕시 마운트 사이나이 의과대학의 피시버그 신경과학과 및 프리드먼 뇌 연구소에 있는 엘리자베스 크로퍼 교수 연구실의 콜린 에반스입니다.오늘 우리는 연체동물인 Aplysia cahora의 구강 신경절에서 세포 내 칼슘 농도 변화와 시냅스 효율의 동시 이미징을 시연하겠습니다. 세포 내 칼슘을 검출하기 위해, 시냅스 전 뉴런에 세포막 투과성 칼슘 지시제 염료인 calcium orange를 주입할 것입니다. 그 후 표본을 현미경 아래로 옮겨 시냅스 전 및 후 뉴런에 날카로운 전극을 삽입합니다.반복적인 시냅스 전 자극은 시냅스 후 전위 또는 PSP 진폭의 증가로 나타나는 시냅스 후 반응의 강화로 이어집니다. 칼슘 지시 염료의 형광 신호를 측정함으로써 시냅스 전 세포 내 칼슘의 동시적 변화를 검출할 수 있습니다. 먼저 약 150 g인 성체 동물의 체중에 맞추어 등장성 염화마그네슘 용액 75 ml를 주입하여 마취시키고, 마취된 동물을 왁스가 칠해진 접시에 고정합니다. 그런 다음 거즈 포셉과 가위를 사용하여 동물의 발 부분에 절개를 가해 구강질(buccal mass)을 노출시킵니다.구강 신경절(buccal ganglion)은 구강 질량(buccal mass)의 복측에 위치하며, 서로 연결된 두 개의 반신경절(hemi ganglia)로 구성되어 있습니다. 여기에는 수백 개의 뉴런이 포함되어 있으며, 이들은 다른 신경절의 뉴런들과 함께 동물의 섭식 행동 생성 및 제어에 기여합니다. 미세 가위로 모든 구강 신경을 절단하여 신경절을 조심스럽게 분리한 후 동물로부터 제거하십시오.그 다음, 분리된 신경절을 인공 해수로 채워진 실 가드(sil guard) 코팅 디쉬 바닥에 핀으로 고정합니다. 신경절은 결합 조직 초(sheath)로 둘러싸여 있으며, 개별 뉴런을 노출시키려면 이 초를 제거해야 합니다. 미세 핀셋과 홍채 가위를 사용하여 매우 주의 깊게 이 초를 잘라냅니다.뉴런의 손상을 방지하기 위해, 영상 촬영 중 움직임이 발생하면 문제가 될 수 있으므로 핀을 사용하여 신경절 초를 약 15분 동안 고정합니다. 세포 내 기록 및 염료 주입을 위한 정밀 전극을 준비하려면, 마이크로 전극 풀러(micro electrode puller)를 사용하여 모세관 튜브를 뽑아냅니다. 외경이 1mm인 박벽 필라멘트 붕규산 유리(borosilicate glass)를 사용합니다.기록 전극은 3 M potassium acetate로 채웠을 때 약 10 MΩ의 저항을 가져야 하므로, 이에 맞게 풀러(puller)를 조정하여 D 전극을 제작합니다. 제작된 전극의 뒷부분을 10 mM calcium orange 염료 용액에 담그면 전극 내부의 유리 필라멘트를 따라 모세관 현상이 일어나 염료가 팁 끝까지 빨려 들어갑니다. 그 다음, 원활한 전기적 접촉을 위해 전극을 200 mM potassium chloride로 다시 채웁니다. 전극 특성을 개선하고 기록 전극의 저항을 약 5 MΩ까지 낮추기 위해 자체 제작한 Bela를 사용합니다.전극을 산화 알루미늄 현탁액 흐름 속에 45도 각도로 유지합니다. 현탁액에 염화 나트륨을 혼합하고 옴미터를 연결하여 전극 저항을 모니터링합니다. 베벨링 공정 중에, 수신된 복절 신경절이 담긴 접시를 전기생리학 장치로 옮기고, 전극으로 뉴런을 찔러 정체를 확인함으로써 관심 뉴런의 위치를 찾습니다.칼슘 이미징을 위해 뉴런을 준비하려면, 먼저 염료가 채워진 전극을 세포체에 삽입하고 30분 동안 15 nano amp의 과분극 전류 펄스를 가해 염료를 전기천공법으로 주입합니다. D calcium orange가 세포 내로 유입됨에 따라, SOR은 옅은 분홍색을 띠게 됩니다. 그런 다음 기록 전극을 조심스럽게 회수하고, 염료가 뉴런의 미세 돌기까지 확산될 수 있도록 준비물을 최소 30분 동안 그대로 둡니다.다음으로, 준비된 샘플이 담긴 디쉬를 형광 현미경으로 옮깁니다. 당사는 렌즈를 이동시켜 초점을 맞추고 스테이지는 고정되는 정립 고정 스테이지 현미경에서 10배 NA 0.3 수침 렌즈를 사용합니다. 이러한 방식은 조작기(manipulator)를 장착하는 것을 더 용이하게 합니다.기록 전극을 위해 적절한 필터 블록을 선택하십시오. SI 3 필터 블록은 calcium orange에 적합한 여기 및 방출 필터를 제공합니다. 중성 밀도 필터와 필드 조리개를 사용하여 카메라 파라미터와 조명 강도를 조정하십시오. 광량이 많을수록 노이즈는 줄어들지만, 시료가 표백될 가능성이 있습니다.Cool snap CCD 카메라는 약 30 fps의 프레임 속도로 500 x 300 픽셀 영역을 캡처할 수 있으며, 우수한 신호 대 잡음비를 제공합니다. 가능한 한 광원 셔터를 닫아 fil 뉴런에 조사되는 빛을 최소화하십시오. 이미징 소프트웨어에서 관심 영역(ROI)을 선택하십시오.이 영역들은 소프트웨어가 강도 측정을 수행할 위치를 정의합니다. 일반적으로 시냅스 전 뉴런의 1차, 2차 및 3차 분지를 이미지화합니다. 배경 값을 얻기 위해 difi 뉴런 옆에 추가 ROI를 배치하며, 이 값은 이후 모든 다른 데이터 포인트에서 차감됩니다.시냅스 전 및 후 뉴런의 세포 내 기록 전극을 사용하여 시냅스 전달을 유도하고 모니터링합니다. 카메라의 프레임 출력 트리거 신호를 사용하여 데이터 획득 소프트웨어를 시작하면 전기생리학 및 이미징 데이터 획득 간의 동기화를 보장할 수 있습니다. 동기화를 보장하는 또 다른 방법은 카메라 포트 내부에 LED를 장착하는 것입니다.이 LED는 기록 세션 시작 시 잠시 켜져 동기화 마커를 제공합니다. 일반적인 실험 과정에서는 짧은 전류 펄스를 주입하여 시냅스 전 뉴런에서 활동 전위를 유발합니다. 본 예시에서는 특정 가설을 검증하기 위해 스파이크 버스트와 그에 따른 칼슘 신호의 증가를 보여줍니다.칼슘 신호를 조절하여 시냅스 전달에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 칼슘 킬레이터인 EGTA와 같은 약물을 시냅스 전단에 주입하거나 관류 시스템을 통해 처리할 수 있습니다. 데이터 분석은 이미징 소프트웨어에서 텍스트 파일로 내보낸 다음, 전기생리학적 데이터를 수집하는 데 사용된 소프트웨어(본 연구의 경우 Cambridge Electronic Design사의 spike two)로 가져와 수행합니다.ROI 강도 값과 그에 따른 막 전위 변화를 플롯하기 위해 맞춤 작성된 스크립트를 사용하며, 배경 ROI에서 얻은 배경 신호를 빼고 제시된 식을 통해 상대적 변화를 계산함으로써 칼슘 신호의 변화를 정량화합니다. F zero는 자극 직전의 형광 값이며, F는 자극 중의 형광 값입니다. 여기서는 식별된 뉴런 B 21에서 칼슘 형광의 변화를 이미징한 실험 결과를 보여줍니다.촬영한 영역은 A에 표시되어 있으며, B 1에서는 B 21에서 스파이크 버스트를 유도하여 B 8에서 postsynaptic potential과 칼슘 신호의 변화를 유도하였습니다. B 2는 칼슘 킬레이터인 EGTA를 주입한 효과를 보여줍니다. B 21에서의 스파이크가 더 이상 광범위한 칼슘 형광 증가를 유도하지 않으며, postsynaptic potential의 진폭이 감소하였습니다.결론적으로, 본 연구에서는 세포 내 칼슘 농도를 동시에 모니터링하고 시냅스 전달의 효율성을 평가하는 데 사용할 수 있는 기술들을 입증하였습니다. 이러한 기술들은 대부분의 기능적 이미징에 비해 비교적 간단한 장비만 필요하며, 습득하기 쉽고 빠릅니다.

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연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경

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