핫 수성 - 페놀 추출에 의한 그람 음성 박테리아에서 정화와 Lipopolysaccharide의 시각화

본 절차의 전체적인 목표는 그람 음성균으로부터 LPS를 추출하는 것입니다. 먼저 적절한 배지에서 5 mL의 박테리아를 하룻밤 동안 배양한 후, 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)를 0.5로 조정하여 이를 수행합니다. 그다음, 미세 원심분리를 통해 박테리아를 펠렛화하고, SDS와 beam 또는 capto 에탄올이 포함된 Tris 완충액에 세포를 재부유시킵니다.

그런 다음 세포 용해물을 가열하고 프로테아제와 뉴클레아제로 처리합니다. 마지막으로, 고온의 수성 페놀과 디에틸 에테르를 사용하여 두 번의 연속 추출을 수행하며, 이때 수성 청색층을 조심스럽게 제거하여 회수합니다. 최종적으로 SDS page 분리와 LPS 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 또는 겔 내 다당류의 직접 염색을 통해, LPS의 존재 여부와 양, 박테리아 균주 및 O 항원 사슬 길이 양상을 나타내는 결과를 얻을 수 있습니다.

Hitchcock과 Brown의 프로테아제 처리 방식과 비교했을 때 이 기술의 장점은, SDS page 및 western blotting을 통해 더 정밀하게 분해될 수 있는 순수한 LPS 샘플을 얻을 수 있다는 점입니다. 이 방법은 E. coli 및 Salmonella를 포함한 거의 모든 그람 음성균뿐만 아니라, 각각 Ella 및 Acetobacter와 같은 생물방어 및 신종 병원체 내의 리포폴리사카라이드 합성과 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 박테리아 배양을 위해, 항생제가 첨가된 5 mL의 LB 배지에서 그람 음성균을 하룻밤 동안 배양하십시오.

필요한 경우, 200 RPM 및 37 °C의 진탕 배양기에서 배양물을 하룻밤 동안 성장시킵니다. LB를 사용하여 배양물을 1:10으로 희석한 후, 그 결과에 따라 600 nm에서 광학 밀도를 측정합니다. 600 nm에서의 최종 광학 밀도가 0.5가 되도록 박테리아 현탁액 1.5 mL를 준비합니다.

마이크로 원심분리기를 사용하여 10,600 ×g에서 10분 동안 박테리아를 원심분리하여 펠릿화합니다. 그런 다음 상층액을 제거하여 버립니다. LPS를 추출하기 위해 다음과 같은 용액들을 준비합니다. 1X SDS 버퍼, 4% beta-mercaptoethanol 또는 BME 4% SDS, 그리고 소량의 bromophenol blue가 포함된 0.1 M Tris-HCl pH 6.8 내의 20% glycerol 용액, 그리고 멸균 증류수에 용해한 10 mg/mL 농도의 DNase I, RNase A 및 proteinase K 용액을 준비하여 재현탁합니다.

200 µL의 1X SDS 버퍼에 담긴 박테리아 펠렛을 피펫팅하여 완전히 재부유시킵니다. 부유시킨 박테리아를 항온수조에서 15분 동안 천천히 가열하여 끓입니다. 그런 다음 15분 동안 실온에서 용액을 식힙니다.

선택 사항으로, DNA 용액과 RNA 용액을 각각 5 µL씩 첨가하고 샘플을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. Proteinase K 용액 10 µL를 첨가하고 샘플을 59 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 각 샘플 옆에 얼음처럼 차가운 tris-포화 페놀 200 µL를 첨가합니다.

캡을 단단히 닫고 각 튜브를 5~10초간 볼텍싱합니다. 시료를 65 °C에서 15분 동안 배양합니다. 가끔 볼텍싱하며 실온으로 냉각합니다.

그런 다음 흄 후드 아래에서 각 시료에 실온의 ethyl ether 1 mL를 첨가하고 5~10초 동안 볼텍싱합니다. 시료를 20,600 ×g에서 10분 동안 원심분리한 후 원심분리기에서 조심스럽게 꺼냅니다. 위쪽의 투명한 층이 섞이지 않도록 주의하며 각 시료의 하단 파란색 층을 추출합니다.

각 튜브에 얼음처럼 차가운 tris와 포화 phenol을 200 µL씩 추가로 넣고 추출 과정을 반복합니다. 2X SDS 버퍼를 200 µL 추가합니다. 각 LPS 샘플 중 5~15 µL를 분리하여 8~15% SDS 폴리아크릴아마이드 겔(poly acrylamide gels)에 로딩합니다.

여기 제시된 것은 낭성 섬유증 환자의 객담 샘플에서 분리된 다양한 균주의 bur cold area de losa로부터 준비된 LPS 샘플의 12% SDS-PAGE 겔입니다. 서로 다른 밴딩 패턴은 코어 올리고당에 부착된 O 항원 반복 단위의 수가 서로 다름을 반영합니다. 샘플 1과 6에서 유사한 수의 반복 단위를 확인할 수 있습니다.

페놀 다이메틸 에테르(phenol dimethyl ether)를 사용하는 것은 위험할 수 있으므로, 실험복, 장갑 및 고글과 같은 개인 보호 장구를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 하며, 본 절차를 수행하는 동안에는 반드시 흄 후드 내에서 실험을 진행해야 함을 유의하십시오. 처리 과정에서 시료를 손실하지 않으려면 추출을 신속하게 수행하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 균주 간의 연관성을 시각화하기 위해 웨스턴 면역 블로팅(Western immuno blotting)이나 실버 염색(silver stain) 또는 기타 방법을 통해 지질다당류(lipopolysaccharide)를 시각화하는 과정이 필요합니다.