May 28th, 2012
우리는 그람 음성 세균의 lipopolysaccharide을 (LPS) 정화를위한 수정된 뜨거운 수성 - 페놀 추출 방법을 설명합니다. 일단 압축을 푼, LPS는 연속적으로 SDS-PAGE에 의해 분석 및 직접 염색법이나 서양 immunoblot에 의해 시각하실 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 그람 음성 박테리아에서 LPS를 추출하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 배지에서 5ml의 박테리아 배양을 하룻밤 사이에 배양하고 배양액을 600나노미터의 0.5의 광학 밀도로 조정하여 수행됩니다. 다음으로, 박테리아는 마이크로 원심분리에 의해 펠릿화되고 세포는 SDS 및 빔 또는 캡토 에탄올을 함유하는 트리스 완충액에 재현탁됩니다.
그런 다음 세포 용해물을 끓여서 프로테아제와 뉴클레아제로 처리합니다. 마지막으로, 뜨거운 수성 페놀과 다일 에테르로 두 번의 순차적 추출을 수행하여 수성 청색 층을 조심스럽게 제거하고 유지합니다. 궁극적으로, LPS 및 박테리아 균주의 유무뿐만 아니라 SDS 페이지에 의한 분리 및 LPS 특이적 항체를 사용한 서양 혈액 분석 또는 겔 내 다당류의 직접 염색을 통한 O 항원 사슬 길이 양식을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
Hitchcock 및 Brown의 프로테아제 처리와 비교한 이 기술의 장점은 이 기술이 SDS 페이지 및 웨스턴 블로팅에 의해 더 잘 분리될 수 있는 순수한 LPS 샘플로 이어진다는 것입니다. 이 방법은 VIR에서 지질다당류를 대장균 및 살모넬라균을 포함한 거의 모든 그람 음성 박테리아에 대한 합성 및 조절뿐만 아니라 생물 방어 및 엘라 및 아세토박터와 같은 신흥 병원체에 대한 통찰력을 제공하여 박테리아를 성장시킬 수 있습니다. LPS 추출의 경우, 항생제를 보충한 5ml의 LB에 그람 음성 박테리아를 하룻밤 동안 배양합니다.
필요한 경우 200RPM 및 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 밤새 배양물을 배양합니다. LB를 사용하여 배양액을 1에서 10으로 희석한 다음 결과를 기반으로 600나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 600 나노미터에서 0.5의 최종 광학 밀도로 박테리아의 1.5 ml 현탁액을 준비합니다.
마이크로 원심 분리기에서 박테리아를 10, 600 회 G로 10 분 동안 펠렛화합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다. LPS를 추출하려면 다음 용액을 준비하십시오.
하나의 XSDS 버퍼의 200 마이크로 리터에있는 펠릿 박테리아는 용액을 위아래로 피펫으로 삽입하여 펠릿이 완전히 재현 탁되도록합니다. 부유 박테리아를 수조에서 15분 동안 천천히 끓입니다. 그런 다음 용액을 실온에서 15분 동안 냉각시킵니다.
선택 단계로, DNA 1 및 RNA 용액 각각을 5마이크로리터씩 첨가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 10마이크로리터의 프로테아제 K 용액을 첨가하고 샘플을 섭씨 59도에서 3시간 동안 배양합니다. 각 샘플 옆에 200마이크로리터의 얼음 콜드 트리스, 포화 페놀이 추가합니다.
캡을 단단히 닫고 각 튜브를 5-10초 동안 소용돌이치게 합니다. 샘플을 섭씨 65도에서 15분 동안 배양합니다. 소용돌이, 때때로 실온으로 냉각하십시오.
그런 다음 흄 후드 아래에서 1ml의 실온, 에틸 에테르를 각 샘플에 넣고 5-10초 동안 와류를 추가합니다. 샘플을 20, 600회 G에서 10분 동안 원심분리하고 원심분리기에서 조심스럽게 제거합니다. 각 샘플에서 아래쪽 파란색 층을 추출하고 위쪽 투명 층을 피합니다.
200마이크로리터의 얼음 콜드 트리스, 포화 페놀을 추가하고 각 튜브에 추출을 반복합니다. 200마이크로리터의 두 XSDS 버퍼를 추가합니다. 8-15%SDS 폴리 아크릴아미드 겔에서 각 LPS 샘플의 5-15마이크로리터를 분리합니다.
여기에 보이는 것은 낭포성 섬유증 환자의 가래 샘플에서 분리된 bur cold area de losa의 다양한 균주에서 준비된 LPS 샘플의 12% SDS 페이지 젤입니다. 서로 다른 밴딩 패턴은 코어 올리고당에 부착된 O 항원의 수가 다르고 반복 단위가 있음을 반영합니다. 비슷한 수의 반복 단위가 샘플 1과 6에서 볼 수 있습니다.
페놀 다틸 에테르를 사용하는 것은 실험실 가운, 장갑 및 고글과 같은 보호 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치에서 위험할 수 있음을 잊지 마십시오., 이 절차를 시도하는 동안 이러한 실험은 흄 후드에서 수행해야 합니다. 처리 중에 샘플이 손실되지 않도록 추출을 신속하게 수행하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따랐기 때문에, 서양 면역 블로팅(western immuno blotting) 또는 은 STR에 의한 lipo polysaccharide를 시각화하는 방법 또는 다른 방법을 취하여 균주 간의 관련성을 시각화해야 합니다.
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이 기사는 그람 음성균에서 리포폴리사카라이드(LPS)를 정제하기 위한 수정된 열수성 페놀 추출 방법을 설명합니다. 추출된 LPS는 SDS-PAGE를 사용하여 분석할 수 있으며, 직접 염색 또는 Western 면역 블롯을 통해 시각화할 수 있습니다.
Reliable extraction and visualization of lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria is critical for target validation and mechanistic de-risking in anti-infective discovery. The hot aqueous-phenol extraction protocol enables high-purity LPS isolation, supporting robust serotyping, strain lineage identification, and functional analysis of bacterial mutants. This capability strengthens predictive confidence in early-stage screening and translational research pipelines.
This extraction and visualization protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and translational research.