카르복시 Fluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE)를 사용 인간 Glioblastoma의 속도가 느린 - 나누면 전지의 식별 및 분리

본 비디오 프로토콜에서는 carboxy fluorescein succinimidyl ester(CFSE)를 사용하여 인간 교모세포종에서 느리게 분열하는 세포를 식별하고 분리하는 방법을 보여줍니다. 먼저 뉴로스피어 분석법(neurosphere assay)을 사용하여 교모세포종 종양 세포를 배양합니다. 그런 다음 생성된 스피어를 단일 세포로 해리시키고 CFSE로 염색합니다.

CFSE가 로딩된 세포를 다시 플레이팅합니다. 신경구(neurosphere) 배양의 경우, 생성된 구체를 단일 세포로 분리하여 유세포 분석기로 분석합니다. 세포 분열에 따른 형광 강도를 기준으로 분열 속도가 느린 세포와 빠른 세포를 식별하고 분류합니다.

빈도 이질성(Frequency Heterogeneity)은 암의 핵심적인 특징입니다. 이러한 이질성은 종양의 강건성을 유지하며, 완전히 효과적인 치료법을 개발하는 데 큰 장애물이 됩니다. 따라서 유전적, 표현형적, 그리고 기능적으로 정의되는 이러한 이질성을 연구하고 이해하기 위한 도구와 분석법을 개발하는 것이 매우 중요합니다.

본 비디오 프로토콜에서는 flues 및 I-C-F-S-C를 이용한 정립 방법을 설명합니다. 이 기술을 통해 서로 다른 기능적 특성을 가진 인간 교모세포종 유래 세포 배양물 내의 개별 하위 집단을 유세포 분석법으로 식별하고 분리할 수 있습니다. 본 연구진은 이 기술을 사용하여 서서히 분열하는 특성을 보이는 종양 세포 집단을 분리하고 특성화하였으며, 이러한 기능적 특성은 암의 종양 개시와 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. Gliomas sphere Culture는 화면의 주소에 있는 별도의 비디오에서 설명하는 neuros sphere assay를 사용하여 구축 및 유지됩니다.

글리오마 구체(glioma spheres)의 직경이 150에서 200 µm에 도달하면, 구체가 포함된 배지를 제거하여 적절한 크기의 멸균 조직 배양 튜브에 넣고 실온에서 800 RPM 또는 110 G로 5분간 원심분리합니다. 그 후 상층액을 버리고 구체 펠렛(pelle)을 미리 가온한 1 mL의 trypsin EDTA에 재현탁하여 37 °C의 항온수조에서 3~5분 동안 배양합니다. 이어서 동일한 부피의 trypsin 억제제를 첨가하고 젠틀하게 피펫팅하여 구체를 해리시킵니다.

세포 현탁액을 다시 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 세포를 1 mL의 신경 줄기세포 기초 배지에 재현탁합니다. 단일 세포 현탁액 10 µL를 90 µL의 트립판 블루와 잘 섞은 후, 염색할 세포 100만 개당 필요한 양을 계산하기 위해 세포 수를 측정합니다.

5 mM CFSE 염료 1 µL를 신경 줄기세포 기초 배지 1 mL에 첨가하여 최종 염색 농도가 5 µM이 되도록 염색 시약 1 mL를 준비합니다. 그 다음, 염색 용액을 적절히 혼합합니다. 필요한 수의 세포를 별도의 튜브로 옮겨 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다.

그다음 CFSE 염색 용액을 펠릿에 첨가하고 균질해질 때까지 부드럽게 혼합한 뒤, 염색 과정을 중단하기 위해 실온에서 10분 동안 배양합니다. CFSE가 로딩된 세포에 얼음처럼 차가운 신경줄기세포 기초 배지를 5~10배 부피로 첨가하고 잘 혼합합니다. 이후 세포 현탁액을 원심 분리하고 상층액은 제거합니다.

이 단계에서 튜브 바닥에 녹색 빛을 띠는 세포 층이 나타나야 하며, 이는 염색이 성공적으로 이루어졌음을 나타냅니다. 과잉의 CFSE 염료를 제거하기 위해 두 번에서 세 번의 세척 과정을 수행합니다. 펠릿을 1 mL의 신경 줄기세포 기본 배지에 다시 현탁하여 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.

세 번째 세척 후, 세포를 1 mL의 신경 줄기세포 기초 배지에 재현탁하고, 이전에 설명한 대로 세포 수를 측정하여 세포를 분주합니다. 완전 신경 줄기세포 배지에는 EGF를 최종 농도 20 ng/mL가 되도록 첨가합니다. 그런 다음 CFSE가 로딩된 그룹과 로딩되지 않은 그룹의 세포를 각각의 튜브에 넣어 최종 농도가 50,000 cells/mL가 되도록 합니다.

그 후 세포 현탁액을 충분히 혼합하여 멸균된 조직 배양 플라스크에 분주합니다. 그다음 플라스크에 라벨을 부착합니다. 형광 현미경으로 CFSE 염색 여부를 확인한 후, 세포를 37 °C, 5% CO2 습윤 배양기에 넣고 5~10일 동안 배양합니다.

유세포 분석기를 사용하여 CFSE 염색을 확인하기 위해, CFSE가 처리된 군과 처리되지 않은 음성 대조군에서 각각 500, 000개의 세포를 별도의 팩스 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석기는 사용자 매뉴얼의 관련 파라미터 지침에 따라 조정합니다. 먼저 처리되지 않은 대조군 세포를 분석하여 전방 및 측방 산란 특성을 기준으로 이벤트를 기록하고, 세포 빈도 대 CFSE 강도를 나타내는 히스토그램 플롯에서 주요 세포 집단을 게이팅하여 CFSE 형광 강도 수준을 확인합니다.

다음으로, 보시다시피 CFSE가 로드된 세포를 대조군 세포와 동일한 파라미터를 사용하여 분석합니다. CFSE 양성 세포는 대조군 세포보다 수십 배 더 높은 형광 강도를 나타냅니다. 신경교종 구체(glioma spheres)의 평균 직경이 약 150에서 200 microns에 도달했을 때 분석을 진행합니다.

구체를 계대 배양하고, 앞서 설명한 바와 같이 CFSE가 로딩된 군과 로딩되지 않은 군 모두에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 그 후, 세포를 적절한 부피의 멸균된 1배 PBS에 재현탁하고 세포 수를 측정하여 죽거나 손상된 세포를 제외합니다. 유세포 분석법으로 분리할 때는, 느리게 분열하는 세포와 빠르게 분열하는 세포를 수집하기 위해 세포 현탁액 1 ml당 1 µL의 농도로 propidium iodide를 첨가합니다.

분류 시, 완전 신경 줄기세포 배지가 1 mL씩 들어 있는 멸균된 15 mL 조직 배양 튜브 2개를 준비합니다. 그 후, 유세포 분석실로 이동하는 동안 세포를 얼음 위에 둡니다. 먼저, 적재되지 않은 세포 군의 세포 현탁액을 유세포 분석기에 통과시켜 분석합니다.

사멸하거나 손상된 세포를 배제하기 위해 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter)을 기준으로 이벤트를 도식화합니다. 세포를 측방 산란광 대 PI 반응성을 기준으로 도식화하고, 단일 생존 세포 집단을 population one으로 게이팅합니다. 그런 다음 전방 및 측방 산란 특성에 따라 population one에서 균질한 세포 집단을 선택하여 population Two로 게이팅합니다. 이후 동일한 파라미터와 게이팅 전략을 사용하여 population two를 로그 스케일로 설정된 세포 빈도 대 CFSE 강도 히스토그램으로 도식화합니다.

CFSE로 표지된 세포를 유세포 분석기로 측정하여 분석합니다. 이후, 하위 85%의 세포를 빠르게 분열하는 세포군으로 게이팅하고, 상위 5%의 세포를 느리게 분열하는 세포군으로 게이팅합니다. 관심 대상인 이러한 서로 다른 세포 집단들을 선택하여, 1 mL의 완전 신경줄기세포 배지가 담긴 각각의 15 mL 멸균 조직 배양 튜브에 분리하여 소팅합니다.

분리 임계 속도는 초당 2,500 events를 초과하지 않도록 조정해야 합니다. 분리를 마친 후, 세포를 원심 분리하여 상층액은 제거하고 펠렛을 적절한 부피의 배지에 재현탁한 뒤 세포 수를 측정합니다. 그런 다음, 서로 다르게 분리된 세포 집단들을 ml당 50,000 cells의 밀도로 플레이팅합니다.

20 ng/mL의 EGF가 첨가된 완전 신경줄기세포 배지에서 세포를 5~10일 동안 배양하여 스피어(sphere)를 형성합니다. 이는 세포의 예시입니다. CFSE 염색약을 처리한 직후, 형광 현미경으로 관찰했을 때 모든 세포에서 강한 녹색 형광이 나타납니다.

이 이미지는 세포 도말 6일 후 A-C-F-S-E가 로딩된 세포에서 유래한 대표적인 신경교종 구체(glioma sphere)의 모습입니다. 일부 세포의 CFSE 염색이 여전히 매우 밝게 나타남을 확인할 수 있습니다. 이는 CFSE 강도가 시간이 지남에 따라 감소함을 보여주는 유세포 분석 히스토그램의 예시입니다.

파란색은 CFSE가 갓 로딩되어 형광 강도를 나타내는 세포를 의미합니다. 이는 빨간색으로 표시된 로딩되지 않은 세포보다 수십 배 더 높습니다. 녹색은 CFSE 로딩 후 6일 동안 세포 분열로 인해 감소한 형광 강도를 나타냅니다.

이들은 빠르게 분열하는 집단과 느리게 분열하는 집단을 분리한 후 7일 동안 배양하여 성장시킨 대표적인 구체(sphere)들입니다. 구체 형성 빈도는 두 그룹 간에 차이가 없으나, CFSC를 유지하는 세포는 CFSC가 희석되는 세포에 비해 성장 속도가 느려 더 작은 구체를 형성합니다. 세포 분열 속도를 기반으로 세포의 하위 집단을 식별하고 분리하기 위해 CFSC를 사용하는 것은 후속 실험 및 추가 특성 분석을 위한 출발점이 됩니다.

본 프로토콜은 인간 신경교종 유래 배양물에서 서서히 분열하는 세포를 식별하는 방법을 예시로 제공하였으나, 이는 다른 종양 세포 유형이나 비암성 시스템에도 적용될 수 있습니다. 시청해주셔서 감사드리며, 본 프로토콜이 귀하의 연구에 도움이 되었기를 바랍니다.