자연 점액 배포를 공부하기 위해 떼어 낸, 냉동 조직을 사용하여

다음 실험의 전반적인 목표는 조직 샘플에서 분비되는 점액의 자연스러운 당화(glycosylation) 분포를 보존하는 것입니다. 이는 먼저 조직을 최적의 절단 온도, 중간 또는 OCT에 삽입하여 조직 처리를 최소화한 다음 글리칸 구조, 뮤신 및 점액을 검출할 수 있도록 함으로써 달성됩니다. 절편은 렉틴, 항체 및 조직화학적 염색으로 배양됩니다.

렉틴 결합은 렉틴 결합 특이성을 확인하기 위해 글라이칸 에피토프의 경쟁적 억제 또는 효소 절단에 의해 추가로 도전할 수 있습니다. 궁극적으로, 점액 및 냉동 조직 샘플의 보존은 신비한 화학 분석에 의한 파라핀 함유 샘플의 점액 보존과 비교할 수 있습니다. 파렌에 조직을 삽입하고 자동차 소음 솔루션으로 eh 고정과 같은 기존 방법에 비해 이 기술을 사용하는 주요 이점은 이 방법이 특수 고정제를 사용할 필요가 없고 실험실에 이미 존재할 수 있는 동결 조직을 활용할 수 있다는 것입니다.

시작하려면 스냅 냉동 조직을 극저온 마이크로톰 챔버에 넣어 섭씨 영하 20도까지 예열합니다. 한편, 얕은 스티로폼 상자에 두 개의 메틸 부탄을 넣은 다음 상자에 드라이 아이스를 추가하여 냉동 욕조를 만듭니다. 다음으로, 필링 오프 동결 곰팡이의 바닥을 덮을 만큼만 OCT를 추가한 다음 티슈를 금형에 넣습니다.

조직이 원하는 방향으로 금형 바닥에 놓여 있는지 확인하십시오. 조직을 OCT로 더 덮은 다음 곰팡이를 냉동 욕조에 넣습니다. 조직이 얼면 OCT 화합물이 하얗게 변합니다.얼면 얼린 블록에서 곰팡이를 떼어내고 블록을 표시된 냉동 백에 넣습니다.

조직을 절단하기 전에 사용할 때까지 얼어붙은 블록을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 얼어붙은 관심 블록을 극저온 마이크로톰 챔버에 약 30분 동안 놓아 섭씨 영하 20도에 도달할 수 있도록 합니다. 따뜻한 블록이 3-5 마이크로 미터 두께의 섹션을 절단 한 다음 섹션 위에 양전하를 띤 유리 슬라이드를 놓습니다.

조직은 30-60분 동안 조직을 공기 건조한 후 슬라이드에 부착됩니다. 실내 온도에 30 분 동안 10%buffered 공식을 가진 활주를 안으로 고치고, 그 후에 aum를 가진 조직을 얼룩지게 하기 위하여 완충기의 250 밀리리터에 있는 10의 빠른 복각에 의하여 PB PBS에서 3 시간 미끄러지를 세척하십시오. 먼저 파란색으로 슬라이드를 물에 헹구고 3분 동안 3%아세트산에서 잠복아를 합니다.

그런 다음 30분 후에 AUM 블루 솔루션으로 조직을 잠복시키세요, 달리기에서 슬라이드를 세척하고 10분 동안 물을 수돗물로 씻은 다음 DI 물로 헹굽니다. 5 분 동안 핵 빠른 빨강으로 핵을 반대 염색하고, 그 후에 DI 물에서 활주를 3 번 세척하십시오. 이제 95% 에탄올에서 1분 동안 배양한 다음 100% 에탄올에서 세 번의 빠른 변화, 그리고 감귤류에서 각각 2분 동안 세 번의 변화를 통해 슬라이드를 탈수하고 청소합니다.

마지막으로, cyto seal 60과 같은 공명 매체로 슬라이드에 커버 슬립을 장착하여 주기적인 산 이동으로 조직을 염색합니다. 먼저 슬라이드를 물로 헹구고 갓 준비한 1% 주기산으로 5분 동안 배양합니다. 이제 슬라이드를 물로 세 번 씻으십시오.

슬라이드를 Milli Q 물에 한 번 담근 다음 시프 시약으로 조직을 염색합니다. 15분 후 슬라이드를 흐르는 상태에서 세척하고 10분 더 수돗물을 넣은 다음 물에 한 번 담그십시오. sgio metin으로 핵을 30초 동안 대조염색한 다음 DI 물로 슬라이드를 세 번 세척합니다.

마지막으로 슬라이드를 30초 동안 배양합니다. Scot의 수돗물에서 청색 시약은 DI 물에서 3 번 더 세척하고, 그 후에 칼슘 파란 염색을 위해 다만 보이는 것과 같이 조직을 탈수한 후에 세척합니다. 렉틴을 사용하여 글라이칸 에피토프의 형광 검출을 위해 커버 슬립으로 슬라이드를 장착합니다.

먼저 PBS에서 BSA로 슬라이드를 10-30분 동안 차단합니다. 그런 다음 아바돈으로 슬라이드를 15분 동안 배양한 다음 PBS 세척, 그리고 또 다른 PBS 세척 후 0.01% 비오틴으로 15분 배양하여 내인성 비오틴을 차단합니다. 슬라이드를 염색 상자에 넣고 각 조직 섹션 위에 새로 준비한 원하는 렉틴 혼합물을 겹겹이 쌓은 다음 렉틴 혼합물을 퍼퓸으로 부드럽게 덮습니다.

이제 1시간 후에 어둠 속에서 슬라이드를 잠복화합니다. 퍼퓸을 부드럽게 제거하고 PBS로 슬라이드를 세 번 씻습니다. 그런 다음 공액 SCI 5에 연쇄상구균 avid가 있는 슬라이드를 겹겹이 쌓고 30분 후에 다시 한 번 어둠 속에서 배양하고 PBS로 슬라이드를 세 번 세척한 다음 dappy로 핵을 counterstaining합니다.

마지막으로, sase 효소 제어를 위한 벡터 마운트 마운팅 미디어와 같은 수성 매체를 사용하여 커버 슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 빈 팁 상자 바닥에 물을 추가하여 습한 챔버를 형성하는 것으로 시작하십시오. 네거티브 컨트롤 슬라이드를 팁 상자의 상단 트레이에 위로 향하게 놓습니다.

조직 섹션에 150-200 마이크로 리터의 미국 용액을 층을 이룬 다음 각 슬라이드를 커버 슬립으로 덮어 기포 형성을 피하십시오. 상자 뚜껑을 닫고 2시간 30분 후에 섭씨 37도에서 상자를 배양합니다. 유리 슬릭 산을 제거하기 위해 실온에서 PBS로 슬라이드를 세 번 세척합니다.

그런 다음 경쟁 억제를 위해 실온에서 한 시간 동안 SNA로 슬라이드를 배양합니다. 200마이크로리터의 렉틴 혼합물을 2개의 einor 바이알로 분취하도록 제어합니다. 그런 다음 Jacqueline 억제제 Meli bios 200밀리몰을 바이알 중 하나에 첨가하고 SWGA 억제제인 키틴 가수분해물을 1-10 희석으로 다른 바이알에 추가합니다.

그런 다음 실온에서 1시간 동안 혼합물을 함유한 억제제로 슬라이드를 배양합니다. 이 첫 번째 그림 조직에서, OCT에서 얼거나 파라핀에 박힌 커민 마우스 또는 닭 결장 표본의 단면은 주기적인 분홍색 산 시프 또는 파란색의 칼슘 블루로 염색되었습니다. 파라핀에 포함된 조직 샘플과 OCT 동결 보호 배지에 포함된 동결 조직을 비교한 결과, 동결 조직에서 뮤신 당단백질의 염색 보존 및 품질에 현저한 차이가 있는 것으로 나타났습니다.

잔상세포의 점액 외에도, 파라핀이 내장된 조직에서 화살표로 표시된 바와 같이 분비된 점액도 볼 수 있었습니다. 점액 염색은 배상 세포에 국한되었습니다. 이 그림에서는 감귤류 분해에서 배양된 뮤신과 조직의 상당한 손실을 관찰할 수 있습니다.

냉동 닭 회장 표본의 연속 절편을 10% 완충된 포르민에 고정하고 수화 상태를 유지하고 70%90% 및 100% 에탄올에서 각각 20분 동안 순차적으로 배양하여 에탄올에서 탈수하거나 에탄올에서 탈수한 다음 1시간 동안 감귤류로 모두 세척했습니다. 에탄올 탈수만으로, 에탄올 탈수와 감귤류를 모두 제거함으로써 조직 형태가 개선되었습니다. 추가 에탄올 탈수만으로는 파란색 염색에 큰 영향을 미치지 않았습니다.

대조적으로, 감귤류의 모든 배양은 이전 그림에서 볼 수 있는 파라핀 내장 조직에서 관찰된 것과 유사한 패턴으로 배상 세포에 대한 파란색 염색을 감소시키고 제한했습니다. 상자는 부추속 파란색 염색 조직 섹션에서 더 높은 배율의 영역을 나타냅니다. 다음 이미지 시리즈에서는 OCT에서 동결되거나 파라핀에 삽입된 다음 파란색의 Jacqueline, 녹색의 SWG, 빨간색의 SNA로 프로브한 닭 회장 표본이 냉동 조직에 표시됩니다.

재클린이 올링크 글라이칸에 결합하자 OCT 동결 조직 단면의 화살표로 표시된 것처럼 배상 세포에서 내강으로 흘러나오는 것처럼 보이는 구조가 드러났습니다. 대조적으로, 파라핀 포매 조직에 대한 Jacqueline 결합은 배상 세포와 이러한 화살표로 표시된 융모 브러시 경계에 국한되었습니다. 베타 원 포 GL의 SWGA 염색은 화살표로 표시된 바와 같이 냉동 및 파라핀 내장 조직 모두에서 Jacqueline lectin의 결합과 부분적으로 공동 국소화합니다.

대조적으로, 화살촉으로 표시된 빨간색의 SNA 렉틴은 세포 내에서 알파 2 6 연결된 시알산에 결합하고 이 그림에서 점선 화살표로 표시된 파란색의 재클린과 공동 국소화하지 않습니다. Slic acid epitopes는 조직 단면을 US로 소화하여 닭 회장 표본에서 절단하거나 여기에서 볼 수 있듯이 배양 및 아세트산 나트륨 완충액에 의해 절단된 상태로 남았습니다. 미국 치료법은 처리되지 않은 조직에서 관찰되는 비오틴화 SNA로 염색을 폐지하여 시알산에 대한 SNA 결합 특이성을 확인했습니다.

렉틴 특이성은 Jacqueline 염색을 위한 mely bios 또는 SWGA 염색을 위한 키틴 가수분해물과 같은 경쟁 억제제를 추가하여 확인할 수 있으며, 다시 한 번 Jacqueline 및 SWGA 혼합물과 함께 배양했습니다. 이번에도 특정 렉틴 억제제의 존재 하에서, 멜리 바이오스 또는 키틴 가수분해물 재클린 염색은 멜리 바이오스에 의해 억제되었지만, 키틴 가수분해물에 의해서는 억제되지 않았다. 반대로, SWGA 염색은 키틴 가수분해물에 의해 억제되었지만 mely bios는 억제되지 않았습니다.

이 마지막 이미지 시리즈는 클리닉과 연구 실험실에서 일상적으로 채취한 스냅 냉동 조직 샘플이 OCT에 추가로 내장되어 뮤신, 당단백질, 당지질 및 글라이칸에 대한 글라이칸을 연구하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 융모암 및 점액암 조직의 이러한 결장직장암 생검을 OCT에 포함된 액체 질소에서 스냅 냉동하고 다양한 표시된 뮤신 및 글라이칸 에피토프에 대해 성공적으로 염색했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 OCT에 조직을 삽입하는 방법과 면역화학적 방법을 사용하여 점액 및 조직 당화(glycosylation)를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.