자연 점액 배포를 공부하기 위해 떼어 낸, 냉동 조직을 사용하여

다음 실험의 전반적인 목표는 조직 시료 내 분비 점액의 당화 분포를 자연 상태 그대로 보존하는 것입니다. 이를 위해 먼저 조직을 최적 절단 온도 매질(optimal cutting temperature medium, OCT)에 임베딩하여 조직 처리 과정을 최소화한 후, 글리칸 구조, 뮤신 및 점액을 검출할 수 있도록 합니다. 이렇게 준비된 절편을 렉틴, 항체 및 조직 화학 염색액과 함께 반응시킵니다.

렉틴 결합 특이성을 확인하기 위해 경쟁적 억제 또는 글리칸 에피토프의 효소적 절단을 통해 렉틴 결합에 추가적인 챌린지를 줄 수 있습니다. 최종적으로, 점막 및 냉동 조직 샘플의 보존 상태를 화학적 분석을 통해 파라핀 매립 샘플의 점막 보존 상태와 비교할 수 있습니다. 조직을 파라핀에 매립하고 카르노 용액으로 고정하는 기존 방법보다 이 기술을 사용할 때의 주요 장점은 특수 고정액을 사용할 필요가 없으며, 실험실에 이미 보관 중일 수 있는 냉동 조직을 활용할 수 있다는 점입니다.

우선, 급속 동결된 조직을 크라이오 마이크로톰 챔버에 넣어 -20°C까지 온도를 높입니다. 그동안 얕은 스티로폼 상자에 2-메틸뷰테인을 붓고 드라이아이스를 추가하여 동결조를 만듭니다. 다음으로, 박리형 동결 몰드 바닥을 덮을 정도의 OCT를 넣은 후, 조직을 몰드에 배치합니다.

조직이 원하는 방향으로 몰드 바닥에 안착되었는지 확인하십시오. 조직 위에 OCT를 더 덮은 다음, 몰드를 급속 냉동조에 넣으십시오. 조직이 얼면서 OCT 화합물이 흰색으로 변합니다. 완전히 얼면 냉동 블록에서 몰드를 떼어내고, 표기된 냉동 보관백에 블록을 넣으십시오.

조직 절편 제작 전까지 동결 블록을 -80 °C에서 보관하십시오. 분석 대상 동결 블록을 크라이오 마이크로톰 챔버에 약 30분 동안 두어 -20 °C에 도달하게 합니다. 블록이 적당히 따뜻해지면 3~5 µm 두께로 절편을 제작하고, 그 위에 양전하 처리된 유리 슬라이드를 배치하십시오.

조직을 30분에서 60분 동안 공기 건조시키면 조직이 슬라이드에 부착됩니다. 실온에서 10% 완충 포르말린으로 30분 동안 슬라이드를 고정시킨 후, 250 mL의 완충액에 10회 빠르게 담그는 방식으로 PBS를 사용하여 슬라이드를 3회 세척합니다. 조직을 aum. Blue로 염색하기 위해 먼저 슬라이드를 물로 헹군 다음 3% 아세트산에 3분 동안 배양합니다.

그 다음 조직을 AUM blue 용액으로 배양합니다. 30분 후, 슬라이드를 흐르는 수돗물에 10분 동안 세척하고 DI water로 헹굽니다. 핵을 nuclear fast red로 5분 동안 대조 염색한 후, 슬라이드를 DI water로 3회 세척합니다. 이제 슬라이드를 95% ethanol에서 1분 동안 배양하고, 이어서 100% ethanol로 3회 빠르게 교체한 뒤, citrus resolve로 각 2분씩 3회 교체하여 탈수 및 투명화 과정을 진행합니다.

마지막으로 Cyto Seal 60과 같은 봉입제를 사용하여 슬라이드 위에 커버글라스를 덮고, 주기산-실버(periodic acid-silver)법으로 조직을 염색합니다. 먼저 슬라이드를 물로 헹군 다음, 갓 조제한 1% 주기산 용액에서 5분 동안 배양합니다. 이제 슬라이드를 증류수로 3회 세척합니다.

슬라이드를 Milli Q수에 한 번 담갔다가 shiff 시약으로 조직을 염색합니다. 15분 후, 흐르는 수돗물에 슬라이드를 10분 동안 더 세척한 다음 증류수에 한 번 담급니다. sgio metin으로 핵을 30초 동안 대조 염색한 후, 증류수로 슬라이드를 세 번 세척합니다.

마지막으로 슬라이드를 30초 동안 배양합니다. Scot's tap water bluing reagent로 처리한 후 DI water로 3회 더 세척하고, 앞서 calcium blue 염색에서 보여준 것과 같이 조직을 탈수시킵니다. 렉틴을 이용한 글리칸 에피토프의 형광 검출을 위해 커버 슬립으로 슬라이드를 마운팅합니다.

먼저, PBS에 희석한 BSA로 슬라이드를 10분에서 30분 동안 블로킹합니다. 그다음, 슬라이드를 avadon과 함께 15분 동안 배양하여 내인성 비오틴을 블로킹하고, PBS로 세척한 후, 다시 PBS로 세척하고 0.01% biotin과 함께 15분 동안 배양합니다. 슬라이드를 염색 상자에 넣고 각 조직 절편 위에 새로 준비한 원하는 렉틴 혼합물을 층을 이루도록 도포한 다음, 렉틴 혼합물을 parfum으로 부드럽게 덮어줍니다.

이제 슬라이드를 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 퍼퓨엄(parfum)을 조심스럽게 제거하고 PBS로 슬라이드를 3회 세척합니다. 그다음 conjugate SCI 5에 포함된 strep avid를 슬라이드에 도포하고 다시 암소에서 30분 동안 배양한 후, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고 dappy로 핵을 대조 염색합니다.

마지막으로, sase 효소 대조군을 위해 vector mount 마운팅 매질과 같은 수성 매질을 사용하여 커버 슬립으로 슬라이드를 마운트합니다. 우선 빈 팁 박스 바닥에 물을 부어 습윤 챔버를 만듭니다. 음성 대조군 슬라이드를 팁 박스의 상단 트레이 위에 앞면이 위로 향하게 놓습니다.

150~200 µL의 US 용액을 조직 절편 위에 층을 이루게 도포한 다음, 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 슬라이드에 커버슬립을 덮습니다. 박스 뚜껑을 닫고 37 °C에서 2시간 30분 동안 배양합니다. 실온의 PBS로 슬라이드를 3회 세척하여 유리 슬라이드에 남아 있는 유리산을 제거합니다.

그 다음, 경쟁적 억제를 위해 슬라이드를 SNA와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 대조군으로 렉틴 혼합물 200 µL를 두 개의 einor 바이알에 나눕니다. 그 후, 한 바이알에는 200 mM의 Jacqueline 억제제 Meli bios를 첨가하고, 다른 바이알에는 1:10 희석한 SWGA 억제제 chitin hydrolysate를 첨가합니다.

그 후 슬라이드를 억제제 포함 혼합물과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이 첫 번째 조직 사진에서, OCT로 동결하거나 파라핀에 매립한 생쥐 또는 닭의 결장 표본 절편을 Periodic Acid Schiff로 분홍색으로 또는 Calcium Blue로 파란색으로 염색하였습니다. 파라핀에 매립된 조직 샘플과 OCT 냉동 보호제 매질에 매립된 동결 조직을 비교한 결과, 동결 조직의 뮤신 당단백질 보존 상태와 염색 품질에서 현저한 차이가 나타났습니다.

파라핀 포매 조직에서 화살표로 표시된 바와 같이, 술잔세포 내의 뮤신 외에도 분비된 점액이 관찰되었습니다. 점액 염색은 술잔세포에 국한되었습니다. 이 그림에서는 시트러스 리졸브(citrus resolve)로 배양한 조직에서 뮤신의 상당한 손실이 관찰되는 것을 확인할 수 있습니다.

냉동된 닭 회장 표본의 연속 절편을 10% 완충 포르말린으로 고정하여 수화 상태를 유지하였으며, 70%, 90%, 100% 에탄올에 각각 20분씩 순차적으로 배양하여 에탄올로 탈수하거나, 에탄올로 탈수 후 citrus all로 한 시간 동안 투명화 처리하였습니다. 에탄올 단독 탈수 및 에탄올 탈수 후 citrus all 투명화 처리가 조직 형태학적 분석 결과를 개선하였습니다. 추가적인 에탄올 단독 탈수는 청색 염색에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다.

이와 대조적으로, 감귤류(citrus)의 모든 배양 조건에서는 청색 염색이 감소하였으며, 이전 그림의 파라핀 임베딩 조직에서 관찰된 것과 유사한 패턴으로 술잔세포(goblet cells)에 국한되어 나타났습니다. 상자는 allium blue 염색 조직 절편에서 고배율로 관찰한 영역을 나타냅니다. 다음 이미지 시리즈에서는 OCT로 동결하거나 파라핀에 임베딩한 후 Jacqueline(청색), SWG(녹색), SNA(적색)로 프로브 분석한 닭의 회장 표본을 동결 조직 상태로 보여줍니다.

OCT 동결 조직 절편의 화살표로 표시된 바와 같이, Jacqueline이 olink 글리칸에 결합한 결과 goblet 세포에서 루멘으로 흘러나오는 듯한 구조가 확인되었습니다. 이와 대조적으로, 파라핀 포매 조직에서의 Jacqueline 결합은 화살표로 표시된 goblet 세포와 융모 브러시 경계(brush border)에 국한되었습니다. 화살표로 표시된 바와 같이, beta one four GL의 SWGA 염색은 동결 조직과 파라핀 포매 조직 모두에서 Jacqueline 렉틴의 결합과 부분적으로 공국소화(co-localize)됩니다.

이와 대조적으로, 화살표 머리로 표시된 빨간색의 SNA 렉틴은 세포 내의 alpha two six 연결 시알산(sialic acids)에 결합하며, 이 그림에서 점선 화살표로 표시된 파란색의 Jacqueline과는 공국소화(co localize)되지 않습니다. 시알산 에피토프는 조직 절편을 neuraminidase로 소화시켜 닭 회장 표본에서 제거하거나, 여기에서 보는 것처럼 sodium acetate 완충액으로 배양하여 제거되지 않은 상태로 두었습니다. neuraminidase 처리는 처리되지 않은 조직에서 관찰되는 biotinylated SNA 염색을 없앰으로써, 시알산에 대한 SNA의 결합 특이성을 확인시켜 주었습니다.

렉틴 특이성은 Jacalin 염색을 위한 melibiose 또는 SWGA 염색을 위한 chitin hydrolysate와 같은 경쟁적 억제제를 추가하여 확인할 수 있습니다. 닭의 회장 표본을 다시 한번 Jacalin과 SWGA 혼합액과 함께 배양하였습니다. 이번에는 특정 렉틴 억제제인 melibiose 또는 chitin hydrolysate를 함께 처리하였습니다. Jacalin 염색은 melibiose에 의해 억제되었으나, chitin hydrolysate에 의해서는 억제되지 않았습니다. 반대로, SWGA 염색은 chitin hydrolysate에 의해 억제되었으나, melibiose에 의해서는 억제되지 않았습니다.

이 마지막 이미지 시리즈는 임상 및 연구 실험실에서 일상적으로 얻는 급속 냉동 조직 샘플을 OCT에 추가로 매립하여 뮤신, 당단백질, 당지질 및 당쇄의 글리칸을 연구하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 융모 암종 및 점액 암종 조직에서 얻은 이 대장암 생검 샘플들은 액체 질소로 급속 냉동 후 OCT에 매립되었으며, 지시된 다양한 뮤신 및 글리칸 에피토프에 대해 성공적으로 염색되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조직을 OCT에 매립하는 방법과 면역화학적 방법을 사용하여 점액 및 조직의 당화 상태를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.