Name: 자연 점액 배포를 공부하기 위해 떼어 낸, 냉동 조직을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 OCT 매립을 이용한 냉동 조직에서 점액과 당화 패턴을 보존하는 방법을. 레틴과 조직화학 염색을 통해 당질 구조를 정확히 분석하고 기존 냉동 샘플을 활용할 수 있습니다.

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저자는 닭 조직을 수확에서의 도움 니콜 M. 네 메스 (조지아 대학)와 쟌느 M. 페어 (LANL)를 감사하고, 촬영하는 동안 그의 도움 스티븐 A. 스프링 것입니다. 본 연구의 모든 조류의 보호는 로스 알 라모스 국립 보안, LLC, 로스 알 라모스의 운영자에있는 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 실험실 동물과 모든 프로토콜의 인도적인 사용을위한 건강 지침 국립 연구소 준수에 있었던 계약에 따라 국립 연구소 에너지 미국학과와 번호 DE-AC52-06NA25396. 본 연구의 생쥐의 보호는 UCSD 동물 승인 프로토콜을 준수하고 있습니다. 인간 조직은 UCSD 승인의 IRB 프로토콜의 일환으로 획득했다. 이 작품은 캘리포니아 랩 요금 회장 프로그램의 대학 (PG)와 보조금 NS047101 신경 질환 국립 연구소에서와 뇌졸중 (신경 과학의 현미경 공유 시설, UC 샌디에고)에서 보조금 118,645에 의해 지원되었다.

1. 10월의 조직 퍼가기 <ol><li> 얕은 스티로폼 상자에 2 메틸 부탄에 드라이 아이스를 추가하여 냉동 욕조를 준비합니다. </li><li> 조직을 수확하고, 부드럽게 초과 액체를 건조하기 위해 조직 종이에 습기. 스냅 - 냉동 조직을 (액화 질소에 냉동 된 조직)을 사용하면, 조직은 cryo-마이크로톰 챔버에 배치하여 -20 ° C까지 따뜻하게 할 수 있습니다. </li><li> 충분히 금형의 하단을 충당하기 위해, 필-A-웨이 냉동 금형에 10월의 작은 금액을 추가합니다. </li><li> 금형의 조직을 놓고, 조직이 원하는 방향에있는 금형의 하단에 안식되어 있는지 확인하십시오. 일단 냉동 조직 블록은 바닥에서 또는 측면에서 중 sectioned 될 것입니다. </li><li> 10월과 조직을 커버하고, 냉동 목욕탕에 금형을 배치합니다. 조직은 냉동으로 10월 화합물은 흰색으로 바뀝니다. </li><li> 일단 표시된 냉동 가방에 냉동 블록과 장소에서 금형 껍질을 벗기면 냉동. </li><li> 냉동 블록이 유지 될 수-80 ° C에서 사용까지. </li></ol> 2. Sectioning 조직 <ol><li> 장소 조직 cryo-마이크로톰 챔버에 블록, 그들을 -20 ° C를 (약 30 분)에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 3-5 μm 두께의 섹션을 잘라 내고 섹션의 상단에 긍정적 요금이 부과 유리 슬라이드를 놓습니다. 조직 슬라이드를 준수합니다. </li><li> 항공은 30-60 분의 조직을 건조. </li><li> 슬라이드는이 단계에서 사용할 수 있습니다, 또는 그들은 -80 ° C에서 나중에 사용하기 위해 보관 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 조직 염색법 <ol><li> -80에 저장된 슬라이드 ° C : 슬라이드가 30 분 동안 실온에서 건조 해동과 공기 할 수 있습니다. </li><li> 10 % 상온에서 30 분에 포르말린 버퍼로 슬라이드를 수정합니다. </li><li> 250 ML 버퍼에있는 슬라이드에게 10 번을 찍어 각 세척을위한 PBS 또는 TBST 버퍼에 세 번 씻으십시오. PBS 버퍼 인산 가수 분해 효소 - conjug 알카라인와 chromogenic 검색을 위해, 그러나, immunofluorescence 얼룩 사용할 수 있습니다항체를 ated, TBST은 PBS에있는 인산염부터 사용되어야은 알카라인 인산 가수 분해 효소 활동을 억제한다. </li><li> 조직 섹션 슬라이드 이제 물들 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 점액을 감지하는 등 Alcian 블루와 정기 산성 스키 프와 같은 Histochemical 착색제를 사용하여 <ol><li> Alcian 블루 얼룩 : <ol><li> 물에 슬라이드를 씻어 상온에서 3 분 3 % 아세트산에 품다. </li><li> 실온에서 30 분에 Alcian 블루 산도 2.5 솔루션 청바지. </li><li> 10 분에 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻으, DI 물에 씻어. </li><li> 상온에서 5 분을 위해 원자력 빠른 빨간색으로 Counterstain. </li><li> 워시는 DI 물에 세 번 슬라이드. </li></ol></li><li> 정기 산성 스키 프 얼룩 : <ol><li> 물에 슬라이드를 씻어, 5 분을위한 신선하게 조리 된 1% 정기적으로 산에 품다. </li><li> DI 물에 세 번 씻어 한 번 miliQ 물에 담구. </li><li> 객실 temperatur 15 분 동안 쉬프 시약으로 얼룩5. </li><li> 10 분에 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻으, DI 물에 씻어. </li><li> 실온에서 30 초에 Surgipath Hematoxylin에 Counterstain. </li><li> 워시는 DI 물에 세 번 슬라이드. </li><li> 배양은 상온에서 스캇의 수돗물에 30 초를 슬라이드. </li><li> DI 물에 세 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> 탈수 및 100 % 에탄올에 세 신속한 변경 및 Citrisolv의 세 변화, 2 분마다 다음 95 % 에탄올에서 1 분, 잠복기하여 슬라이드를 취소합니다. 실온에서 모든. </li><li> 수지 매체 (Cytoseal 60)와 coverslips에 슬라이드를 탑재합니다. </li></ol> 5. Histochemical 방법으로 Glycan Epitopes를 감지 할 수 Lectins과 항체 (표 1)를 사용 <ol><li> lectins로 3 glycan의 epitopes의 형광 검출를 들어, 실온에서 10-30 분 동안 PBS에 1 % BSA와 함께 슬라이드를 차단합니다. </li><li> biotinylated 렉틴이 사용되기 때문에, 0.1 %로 15 분 잠복기에 의해 내생 비오틴를 차단아비딘은 실온에서 0.01 % 비오틴과 15 분 부화 다음. </li><li> 각 차단 단계 후에 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 갓 1 μg / ML Rhodamine-복합 succinylated 밀 배아 agglutinin (sWGA), 1.3 μg / ML biotinylated Sambucus nigra agglutinin (SNA), 5 μg / HEPES / NaCl 버퍼에 ML Fluorescein-복합 Jacalin (10 밀리미터 HEPES,의 혼합물을 준비 150 MM NaCl의 산도 7.5). </li><li> 평평한 표면 또는 착색 상자 및 레이어 상단에있는 렉틴 혼합물 장소 슬라이드. 혼합 볼륨이 부드럽게 액체를 parafilm을 배치하여 감소 될 수 parafilm는 액체를 평탄하고 증발을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 1 시간을 품다. </li><li> 워시는 PBS로 세 번 슬라이드. </li><li> 0.7 μg / ML streptavidin - 복합 CY5 (biotinylated-SNA를 감지 할), 그리고 어둠 속에서 실온에서 30 분에 품다와 레이어 슬라이드. </li><li> 워시는 PBS로 세 번 슬라이드. </li><li> 0.1 &amp; m로 핵을 CounterstainU; g / ML DAPI. </li><li> VectaMount 설치 미디어 (또는 수성 미디어) 등의 수성 매체가 coverslips에 슬라이드를 탑재합니다. </li></ol> 6. 렉틴 염색의 특이성에 대한 통제 <ol><li> 렉틴 염색의 특이성 전에 얼룩을 대상 glycan 에피토프의 특정 효소 절단 또는 작은 분자와 경쟁하여 중 제어됩니다. </li><li> Sambucus nigra agglutinin (SNA) 결합 특이성에 대한 효소 절단 <ol><li> 250 50 MM 나트륨 아세테이트 산도 5.5의 무 / ML에 Arthrobacter ureafaciens sialidase (AUS)을 희석. </li><li> 팁 박스 빈의 바닥에 물을 추가이 부화하는 동안 습윤 챔버를 형성합니다. </li><li> 장소 슬라이드 coverslip으로 슬라이드와 커버에 팁 박스, 층 150-200 μl AUS 솔루션의 상단 트레이에 직면하고 있습니다. 기포 형성을 피하십시오. </li><li> 2.5 시간에 37 ° C에서 상자 뚜껑과 품다를 닫​​습니다. </li><li> 워시 룸 성질에 PBS로 3 번 슬라이드무료로 sialic 산을 제거 할 ature. 이 슬라이드는 SNA의 착색에 대해서는 제외해야합니다. </li></ol></li><li> Jacalin 및 succinylated 밀 배아 agglutinin (sWGA) 특이성에 대한 경쟁력 억제제 <ol><li> 렉틴 혼합물의 나누어지는 200 μl 단계 5.4 두 Eppendorf 용 시험관에 준비했습니다. </li><li> 다른 유리 병에 1시 10분 희석에서 병 및 키틴 - 가수 분해물 (sWGA 억제제) 중 하나에 200 MM Melibiose을 (Jacalin 억제제)를 추가합니다. </li><li> 있는 오버레이 대조군 슬라이드 억제제 함유 슬라이드의 나머지 부분과 같은 시간에 실온에서 혼합 및 품다 1 시간입니다. 이 슬라이드는 각각 Jacalin 또는 sWGA의 착색에 대해서는 제외해야합니다. </li></ol></li></ol> 7. 대표 결과 cryo-protectant 미디어 (OCT)에 포함 된 냉동 조직에 파라핀에 포함 된 조직 샘플 사이의 비교는 muci에 얼룩의 보존과 품질에서 큰 차이점을 보여N의 glycoproteins. 이러한 Alcian 블루와 정기 산성 스키 프와 같은 histochemical 염료와 조직 염색법은 냉동 또는 파라핀 임베디드 샘플 (그림 1)에서 비교 조직 섹션에서 매우 다른 결과를 생산하고 있습니다. 이 나타납니다 유기 용매 파라핀 삽입 과정에서 사용되는 (크실렌 또는 Citrisolv)은 상피 조직에서 분비의 mucins 배포뿐만 아니라 많은 샘플 (그림 2)에서 glycolipids의 제거 등의 영향을 미칩니다. 그 결과, 점액 층은 점막 세포에 쓰러져 대부분 블렛 세포에서 발견됩니다 나타납니다. cryo-protectant 미디어 조직의 플래시 동결 (OCT)는 샘플 보습을 유지하고 분비 mucins 레이어 크기를 보존. 파라핀 퍼가기 과정은 비슷한 방식으로 다른 점액 - 관련 glycans 및 glycolipids에 영향을. Glycan 배포를 찾을 epitopes에 대해 정기적으로 glycan 탐지에 사용되는 lectins, (그림 3)과 항체를 사용하여 검사를 한mucins 및 glycolipids (그림 6). 렉틴 구속력이 잘 정의되지 않고 glycans뿐만 아니라 glycan 구조 14,15의 공간적 분포의 영향 때문에 렉틴 착색에 대한 적절한 컨트롤을 적용하는 것이 중요합니다. 효소 절단 및 경쟁 억제 : 여기 우리는 테스트 조직에 렉틴 착색을 제어하기위한 두 가지 방법을 보여줍니다. glycan의 epitopes의 절단은 glycan 특정 효소와 조직 섹션을 소화하여 수행, 예를 들어 세균 sialidase에 대한 SNA (그림 4)에 의해 구속력을 sialic 산성에 대한 제어 있습니다.되었습니다 특정 효소 (예 glycosidase) 공부 glycan 에피토프를 제거를 사용할 수 없습니다 경우에는 렉틴 특이성은 이러한 sWGA의 착색에 대한 Jacalin의 착색 또는 키틴 - 가수 분해물에 대한 Melibiose (그림 5)와 같은 경쟁력있는 억제제를 추가하여 확인 할 수 있습니다. 우리는 스냅 - 냉동 조직 샘플은 어느 rou 것을 여기에 설명tinely 병원과 연구소의 취득, 추가 10월에 포함하고 점액 glycoproteins하고에 존재하는 많은 glycans을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 렉틴 / AB </td><td> 출처 </td><td> 주요 특성 </td></tr><tr><td> LFA </td><td> Limax flavus (황색 탄환) </td><td> 터미널 SIA </td></tr><tr><td> MAA의 * </td><td> Maackia amurensis (아무르 Maackia) </td><td> Galβ1-R에 Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-황산 </td></tr><tr><td> SNA </td><td> Sambucus nigra (Elderberry) </td><td> Siaα2 - 6Gal / Siaα2 - 6GalNAc </td></tr><tr><td> WGA </td><td> Triticum의 vulgaris (밀 배아) </td><td> GlcNAcβ1 - 4GlcNAcβ1-4GlcNAc / SIA </td></tr><tr><td> sWGA </td><td> Succinylated Triticum의 vulgaris (밀 배아) </td><td> GlcNAc &amp; B도착 예정 시간, 1 4GlcNAcβ1 - 4GlcNAc </td></tr><tr><td> PNA </td><td> Arachis hypogaea (땅콩) </td><td> Galβ1 - 3GalNAc (수정되지 않은 T-항원) </td></tr><tr><td> Jacalin </td><td> Artocarpus integrifolia (Jacalin) </td><td> Galβ1 - 3GalNAc는 O-링크 glycans에서 발견 </td></tr><tr><td> ECA </td><td> Erythrina cristagalli (산호 나무) </td><td> Galβ1 - 4GlcNAc </td></tr><tr><td> TKH2 </td><td> 항독소 </td><td> O-링크 glycans에 Siaa2-6GalNAc (역) </td></tr><tr><td> CA19-9 </td><td> 항독소 </td><td> Siaa2 - 3Galβ1-4 (Fuca1-3) GlcNAc (SLe) </td></tr><tr><td> SNH3 </td><td> 항독소 </td><td> Siaa2 - 3Galβ1-3 (Fuca1-4) GlcNAc (SLe X) </td></tr></tbody></table> 약어 : AB, 항체, SIA, Sialic 산, 걸, 갈락토오스, GalNAc, <em&gt; N-acetylgalactosamine, GlcNAc, N-acetylglucosamine, Fuc, Fucose, 역, Sialyl TN, SLe, sialyl Lewisa, SLe X, sialyl 루이스 X. MAA에 대한 * 상용 소스는 말리, MALII 및 마판이 포함되어 있습니다. 표 1. glycan의 epitopes에 대한 lectins과 항체의 일부 목록입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig1.jpg" /> 1 그림. Alcian 블루 및 냉동 및 파라핀 - 임베디드 결장 조직의 정기적 산성 스키 프 착색. 인간, 마우스 또는 닭 결장 표본의 조직 섹션 10월 (위 패널)에 냉동 또는 파라핀 (아래 패널)에 포함이 정기 산 스키 프 (PAS)에 물들되었습니다 또는 Alcian 블루 (AB). 이 시약은 각각 분홍색이나 파란색 점액을 얼룩. 상단 패널 : 냉동 조직에서 고 블렛 셀에 mucins뿐만 아니라, 분비의 점액도 마주했다였죠 (화살표). 낮은 패널 :에서 파라핀 - 임베디드 조직, 점액의 착색은 고 블렛 셀에 국한되었다. 핵은 Surgipath (PAS) 또는 메이어의 (AB) Hematoxylin과 counterstained했다. 스케일 바는 100 μm을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3928/3928fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig2.jpg" /> 그림 2. 10 % 포르말린 버퍼와 수화 (왼쪽 패널) 유지에 mucins의 상당한 손실 Citrisolv의 배양 결과입니다. 냉동 닭 회장의 표본의 직렬 섹션은 연속 70%에서 부화, 90 % 및 100 % 에탄올에 의한 에탄올의 탈수 20 분 동안 고정 된 각 (가운데 패널) 또는 에탄올에 수분이 1 시간 (오른쪽 패널)에 대한 Citrisolv에게 허가. 건조 샘플은 Hematoxylin과 Eosin (H &amp; E) 또는 Alcian 블루 염색하기 전에 PBS로 rehydrated되었습니다. 에탄올 탈수 및 Citrisolv 개간 개선 조직 morphology (예를 들어, 맨 위에, 중간 및 오른쪽 이미지를 대 왼쪽 이미지). 에탄올 탈수는 Alcian 블루 착색 (중간 행, 왼쪽 중간 이미지를 비교)에 더 큰 영향을 미치지 않았다. 반면, Citrisolv의 부화는 Alcian 블루 착색을 감소 파라핀 - 임베디드 조직 (그림 1)에서 볼 수 비슷했다 패턴의 고 블렛 셀 (중간 행, 오른쪽 이미지)에 국한. 이 데이터는 파라핀 - 임베디드 샘플에 점액의 과립의 강한 착색이 소요되는 단계에서 감소하고 잔 세포에서 점액의 응축에 의한 것을 암시. 냉동 월 임베디드 조직에서 점액의 희미하고 덜 조밀 한 착색은 조직에서 점액의 더 자연 분포를 반영합니다. 박스 지역의 높은 배율은 화살표로 표시됩니다. 스케일 바는 50 μm (상단 및 중간 행)와 10 μm (하단 행)을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig3.jpg" /> 그림 3. 의 바인딩냉동 및 파라핀 - 임베디드 조직에 glycan의 epitopes에 lectins. 치킨 소장 (회장) 표본은 10월 (상단 패널)에 냉동 또는 Jacalin (파란색), sWGA (녹색)와 SNA를 탐색했다 (아래 패널) 파라핀에 포함 (빨간색 ). 박스 지역의 높은 배율은 화살표로 표시됩니다. 냉동 조직에서 O-링크 glycans에게 구속력 Jacalin는 루멘 (Jacalin, 상단 패널, 화살표)로 블렛 셀에서 흘러 것으로 보인다 구조를 공개했다. 반면, 파라핀 - 임베디드 조직에 대한 구속력을 Jacalin는 고 블렛 셀 (Jacalin 낮은 패널, 화살표)과 villi 브러시 테두리 (왼쪽 하단 이미지, 화살표)에 국한되었다. β1-4GlcNAc의 sWGA의 착색은 부분적으로 모두 냉동 조직의 Jacalin의 렉틴의 바인딩 (상단 패널, 화살표)로 공동 번역과에서 조직 (하단 패널, 화살표) 파라핀 - 임베디드. 반면, α2-6 연결 sialic 산에 바인딩 SNA의 렉틴은 (SNA, 화살촉) 세포이며, Jacalin (색상 공동 현지화되지 않습니다붉은 색의 이미지, SNA는 화살촉, 점선 화살표로 표시된 파란색으로 Jacalin)로 표시된. 스케일 바는 100 μm (왼쪽 이미지) 및 20 μm을 (확대 박스 영역) 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig4.jpg" /> 4 그림. SNA와 sialic 산성 염색을위한 효소 절단 제어. 치킨 소장의 표본은 37 ° C.에 250 무 / ML Arthrobacter ureafaciens sialidase (AUS) 또는 2.5 H 50 MM 나트륨 아세테이트 산도 5.5 버퍼와 incubated되었습니다 AUS 치료 sialic 산에 SNA 결합 특이성을 확인, biotinylated SNA와 얼룩 시킨다는. 스케일 바는 100 μm을 나타냅니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig5.jpg" /> 그림 5. Jacalin 및 sWGA과 glycan 착색을위한 경쟁 저해 제어 할 수 있습니다. 치킨 소장 (회장) 표본은 특정 lec의 존재에 Jacalin와 sWGA 혼합물에 incubated되었습니다주석 억제제 : Melibiose (가운데 열), 키틴 - 가수 분해물 (오른쪽 열) 또는 억제제없이 (A와 D). 어퍼 패널 (왼쪽) 억제제없이 Jacalin의 착색. (중앙) Jacalin의 착색은 Melibiose에 의해 저해되었다. (오른쪽) 키틴 - 가수 분해물은 Jacalin의 착색을 억제하지 않았습니다. 낮은 패널 (왼쪽) 억제제없이 sWGA의 착색. (중앙) Melibiose는 sWGA의 착색을 억제하지 않았습니다. (오른쪽) sWGA의 착색은 키틴 - 가수 분해물에 의해 저해되었다. 이 억제는 조직과 lectins의 특정 상호 작용을 확인합니다. 착색 억제의 별표 마크 이미지입니다. 스케일 바는 100 μm을 나타냅니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig6.jpg" /> 6 그림. 분비의 mucins, glycolipids 및 냉동 인간의 대장 암 조직에서 glycan epitopes의 감지. villous 암과 점액 암에서 대장 암 biopsies는 액체 질소 스냅인 냉동 있었고, 10월에 포함. 조직 섹션은 1 H에 대한 incubated되었습니다분비 점액에 대한 항체와 MUC5AC는 sialyl 루이스 - glycan 에피토프는 gangliosides (대장 암 마커 CA 19-9)에 있으며 sialyl-TN - mucins에 풍부한 glycan의 에피토프은 (TKH2 항체를 검출)와 30 분 배양 한 다음 biotinylated 당나귀 안티 - 마우스 IgG 항체 보조하고, 퍼 옥시 데이즈 - 복합 streptavidin으로 30 분 배양. 추가 조직은 퍼 옥시 데이즈 - 복합 streptavidin으로 30 분 부화 다음, biotinylated lectins SNA와 sWGA으로 1 시간에 incubated되었습니다. 퍼 옥시 데이즈의 착색은 AEC 키트를 사용하여 개발되었습니다. 블랙 규모 바는 200 μm을 나타냅니다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

냉동 조직의 점액과 glycan epitopes의 보존은 파라핀에 포함 된 조직의 우수합니다. 우리는 분비의 점액 층 (그림 1 및 3)과 파라핀 - 임베디드 조직에 비해 냉동 조직의 세 glycans 구조의 분포 (그림 3)의 보전을 보여 주었다. 이러한 Carnoy의 솔루션으로 전문 fixatives은 (60 % 에탄올, 30 % 클로로포름, 10 % 아세트산) 17는 조직 샘플에있는 점액 층의 최적의 보존을 위해 개발되었습니다. 최적이 솔루션은 점액 연구에 최선을 다하고 있습니다 조직 샘플을 수집하는 데 사용되어야하며 점액 층 16-17의 원활한 모양을 유지하기 위해 표시되었습니다. 10월에 포함 된 고정되지 않은 냉동 샘플의 점액 층이 견고 나타나고 일부 지역에서 조직에서 분리 할 수​​ 있습니다, 그러나 전체 층의 두께는 Carnoy의 솔루션과 embedd 고정 된 조직에서 관찰 그와 계약에파라핀 16-17에서 거구나. 16 - 예를 들어, 냉동 인간의 결장 조직 섹션에있는 점액 층은 Carnoy&#39;s - 고정 인간 대장 샘플 55.4 ± 2.5 μm (204.8 μm 범위 7.7)에 대한보고 범위 내에 ~ 100 μm (그림 1)입니다. 그것은 수십 년 동안 알려져왔다 그 생물 표본 18 ~ 30 %의 수축 및 조직 13 일부터 같은 크실렌 등의 유기 용제, Citrisolv과 어느 정도 클로로포름 추출 지질, glycolipids하고는, 단백질한다는 점에서 에탄올 탈수 결과. 고정 (10 % 포르말린 버퍼), 탈수 (증가 에탄올 농도) 및 어음 (Citrisolv 또는 크실렌) : 파라핀 삽입하기위한 조직 처리는 다음 단계가 포함되어 있습니다. 고정되지 않은 냉동 조직 섹션에서 다음 단계를 모방함으로써, 우리는 Citrisolv합니다 (Figur 파라핀 - 임베디드 조직의 그것과 비슷 조직 형태의 결과로 냉동 조직 섹션에서 점액을 추출하는 증명전자 2, 오른쪽 패널). 반면, 점액 층은 (그림 2, 왼쪽과 중앙 패널) 포르말린 또는 에탄올과 부화에 의해 변경되지 않았습니다. 이 제안이 Citrisolv / 크실렌에서 장시간 배양을 필요로 표준 파라핀 퍼가기 절차의 소요 단계, 점액 층의 붕괴의 결과. 포르말린 고정이 쉽게 glycans, glycolipids 및 단백질 (그림 2, 3, 6)에 대한 lectins과 항체 물들 일 수있는 포르말린으로 고정 된 점액 층 및 냉동 조직 섹션을 손상하지 않습니다. 이러한 효과는 막에 바인딩 단백질 및 조직 병리의 연구 크지 않을 수 있습니다하지만, 이러한 분비 점액 층으로 높은 수화 구조에 망연자실하고 있습니다. mucins의 그러나 조직 학적 연구는 계속 점액 층 보존 차선이있는 파라핀 - 임베디드 샘플과 주로 실시하고 있습니다. 이러한 SE의 정확한 신원과 같은 점액 층 구성의 깊이 분석에서creted 또는 막 바운드 MUC 당 단백질의 조합은 특정 항체와 단백질 백본의 식별을위한 대량 분석법이 필요합니다. 점액 층의 보존은 연구뿐만 초기 요구 사항입니다. 대부분의 실험실은 다른 프로젝트에 과거에 수집 된 10월에 냉동 조직 샘플이 조직은 쉽게 mucins, glycolipids 및 점액 보존을 위해 독특하게 디자인 된 특수 fixatives으로 조직을 수집 할 필요가 없습니다 glycan 분포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 냉동 조직은 최소한의 처리를 받아야하기 때문에 자연의 수화 아르 glycans의 자연 배포, 보존되어 있습니다. 이 미생물 - 호스트 상호 작용의 영역에서 특히 중요합니다. 이 &quot;장벽&quot;분자 장식 분비의 mucins과 많은 glycan 구조의 자연 배포하고 풍부한 지식은 호스트 방어, 미생물 착취와 pathogenes을 이해 열쇠가 될 것이다수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 장비 명 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 2 - 메틸 부탄 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 03551-4 </td></tr><tr><td> AEC 퍼 옥시 데이즈 기판 키트 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td> Alcian 블루 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A3157 </td></tr><tr><td> 안티 - CA 19-9 단클론 항체 </td><td> Calbiochem </td><td> CA1003 </td></tr><tr><td> 안티 MUC5AC 단클론 항체 </td><td> Millipore </td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td> 아비딘 - 비오틴 차단 키트 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td> Biotinylated 당나귀 안티 - 마우스 항체 </td><td> 잭슨 Immunoresearch </td><td> 90,863 </td></tr><tr><td> Biotinylated SNA </td><td> 벡터 연구소 </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> 소 혈청 albu분 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> 키틴 - 가수 분해물 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 마이크로톰 </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td> Leica CM 1800 </td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> Surgipath 의료 공업 </td><td> 3801570 </td></tr><tr><td> 과산화수소 30% </td><td> 피셔 과학 </td><td> H325-100 </td></tr><tr><td> Jacalin-FITC </td><td> 벡터 연구소 </td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td> 마이어의 Hematoxylin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> MHS32 </td></tr><tr><td> Melibiose </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M5500 </td></tr><tr><td> 원자력 빠른 레드 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> 10월 화합물 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> 퍼 옥시 데이즈 복합 streptavidin </td><td> 잭슨 Immunoresearch </td><td> 94,638 </td></tr><tr><td> 쉬프 시약 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 26,052 </td></tr><tr><td> sWGA-Rhodamine </td><td> 벡터 연구소 </td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2 단클론 항체 </td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount 수성 장착 미디어 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> 열 과학 </td><td> 8310-4 </td></tr><tr><td> 필-A 웨이 금형 </td><td> Polysciences 주식회사 </td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

자연 점액 배포를 공부하기 위해 떼어 낸, 냉동 조직을 사용하여

Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Mucins 무게 1-3으로 70 % 이상 탄수화물을 포함 복잡하고 크게 glycosylated O-링크 glycoproteins입니다. 분비의 mucins은 고 블렛 셀과 위 점막에서 생산, 마이크로 미터 두께의 점액 층의 비계를 제공하는 선 내장 및 호흡기 3,4의 상피 조직. mucins뿐만 아니라, 점액 레이어는 또한 항균 펩티드, 크린 시토 킨, 그리고 면역 글로불린 5-9가 포함되어 있습니다. 점액 층은 호스트 타고난 면역의 중요한 부분이며, 미생물 8,10-12을 침해 방어의 첫 번째 라인을 형성한다. 따라서 점액이 미생물과 다양한 상호 작용에 따라 달라질 수 있습니다, 모두 병원균과 symbionts 및 분비의 mucins이 상호 작용에 대한 중요한 인터페이스를 형성하고 있습니다. 이러한 생물학적 상호 작용의 연구는 일반적으로 조직 수집 및 착색에 대한 조직 학적 방법을 포함한다. 조직 수집 및 preserv에 대한 두 가지 가장 일반적으로 사용되는 조직 학적 방법병원 및 연구소의 ation은 다음과 같습니다 포르말린 고정은 cryo-protectant 미디어에 삽입하여 다음에 파라핀 삽입하여 다음과 조직 냉동. 파라핀 - 임베디드 조직 샘플은 명확하고 잘 정의 된 형태를 포함한 조직 학적 시각화에 대한 최적의 품질로 섹션을 생산합니다. 그러나, 파라핀 삽입 과정에서 epitopes의 숫자가 변경 이러한 epitopes을 연구하기 위해, 조직 섹션은 더 많은 에피토프 검색 방법 13 하나 처리해야된다. 분비 mucins 및 지질은 유기 용제 (크실렌 또는 Citrisolv)로 부화을 연장해야 파라핀-퍼가기 소요되는 단계 동안 조직에서 추출됩니다. 그러므로이 방법은 mucins 및 생체 내 점액의 성격 및 배포에 초점을 연구에 대한 하위 최적입니다. 대조적으로, 최적의 절삭 온도에서 동결 조직 (OCT)는 매체를 삽입공극 샘플의 탈수 및 개간 및 샘플 보습을 유지합니다. 이것은 수화 점액 층의 더 나은 보존이 가능하고, 따라서 상피 생물학 mucins의 다양한 역할 연구를 할 수 있습니다. 이 방법은 조직의 최소한의 처리를 필요에 따라, 조직은보다 자연 상태로 보존되어 있습니다. 따라서 냉동 조직 섹션 전에 착색에 대한 추가 처리를 필요로하지 않으며 쉽게 immunohistochemistry 방법을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 우리는 냉동 대장 샘플에 마이크로 미터 두께의 분비 점액 층의 보전을 보여줍니다. 같은 조직은 파라핀에 포함 된 경우 계층은 크게 감소된다. 우리는 또한 공장 lectins를 사용하여 mucins에 표시 glycan의 epitopes의 immunofluorescence 얼룩을 보여줍니다. 이 방법의 장점은 특별한 fixatives의 사용을 요구하고 이미 연구실에 보존 할 수 있습니다 냉동 조직을 활용 할 수 없다는 것입니다.

최적의 절삭 온도 매체 (OCT)에 포함 된 고정되지 않은 냉동 조직 샘플은 숨겨진 점액 자연 유통 및 글리코 실화를 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법 조직 처리에 최소한이며, glycolipids, mucins 및 glycan - epitopes의 자연 프리젠 테이션는 보존됩니다. 조직 섹션은 형광 또는 chromogenic 검색을 사용하여 immunohistochemistry에 의해 분석 할 수 있습니다.

뮤신은 복잡하고 당화가 많이 된 O-결합 당단백질로, 무게 기준 70% 이상의 탄수화물을 함유하고 있습니다1-3. ...에 의해 생성되는 분비형 뮤신은...

다음 실험의 전반적인 목표는 조직 시료 내 분비 점액의 당화 분포를 자연 상태 그대로 보존하는 것입니다. 이를 위해 먼저 조직을 최적 절단 온도 매질(optimal cutting temperature medium, OCT)에 임베딩하여 조직 처리 과정을 최소화한 후, 글리칸 구조, 뮤신 및 점액을 검출할 수 있도록 합니다. 이렇게 준비된 절편을 렉틴, 항체 및 조직 화학 염색액과 함께 반응시킵니다.렉틴 결합 특이성을 확인하기 위해 경쟁적 억제 또는 글리칸 에피토프의 효소적 절단을 통해 렉틴 결합에 추가적인 챌린지를 줄 수 있습니다. 최종적으로, 점막 및 냉동 조직 샘플의 보존 상태를 화학적 분석을 통해 파라핀 매립 샘플의 점막 보존 상태와 비교할 수 있습니다. 조직을 파라핀에 매립하고 카르노 용액으로 고정하는 기존 방법보다 이 기술을 사용할 때의 주요 장점은 특수 고정액을 사용할 필요가 없으며, 실험실에 이미 보관 중일 수 있는 냉동 조직을 활용할 수 있다는 점입니다.우선, 급속 동결된 조직을 크라이오 마이크로톰 챔버에 넣어 -20°C까지 온도를 높입니다. 그동안 얕은 스티로폼 상자에 2-메틸뷰테인을 붓고 드라이아이스를 추가하여 동결조를 만듭니다. 다음으로, 박리형 동결 몰드 바닥을 덮을 정도의 OCT를 넣은 후, 조직을 몰드에 배치합니다.조직이 원하는 방향으로 몰드 바닥에 안착되었는지 확인하십시오. 조직 위에 OCT를 더 덮은 다음, 몰드를 급속 냉동조에 넣으십시오. 조직이 얼면서 OCT 화합물이 흰색으로 변합니다. 완전히 얼면 냉동 블록에서 몰드를 떼어내고, 표기된 냉동 보관백에 블록을 넣으십시오.조직 절편 제작 전까지 동결 블록을 -80 °C에서 보관하십시오. 분석 대상 동결 블록을 크라이오 마이크로톰 챔버에 약 30분 동안 두어 -20 °C에 도달하게 합니다. 블록이 적당히 따뜻해지면 3~5 µm 두께로 절편을 제작하고, 그 위에 양전하 처리된 유리 슬라이드를 배치하십시오.조직을 30분에서 60분 동안 공기 건조시키면 조직이 슬라이드에 부착됩니다. 실온에서 10% 완충 포르말린으로 30분 동안 슬라이드를 고정시킨 후, 250 mL의 완충액에 10회 빠르게 담그는 방식으로 PBS를 사용하여 슬라이드를 3회 세척합니다. 조직을 aum. Blue로 염색하기 위해 먼저 슬라이드를 물로 헹군 다음 3% 아세트산에 3분 동안 배양합니다.그 다음 조직을 AUM blue 용액으로 배양합니다. 30분 후, 슬라이드를 흐르는 수돗물에 10분 동안 세척하고 DI water로 헹굽니다. 핵을 nuclear fast red로 5분 동안 대조 염색한 후, 슬라이드를 DI water로 3회 세척합니다. 이제 슬라이드를 95% ethanol에서 1분 동안 배양하고, 이어서 100% ethanol로 3회 빠르게 교체한 뒤, citrus resolve로 각 2분씩 3회 교체하여 탈수 및 투명화 과정을 진행합니다.마지막으로 Cyto Seal 60과 같은 봉입제를 사용하여 슬라이드 위에 커버글라스를 덮고, 주기산-실버(periodic acid-silver)법으로 조직을 염색합니다. 먼저 슬라이드를 물로 헹군 다음, 갓 조제한 1% 주기산 용액에서 5분 동안 배양합니다. 이제 슬라이드를 증류수로 3회 세척합니다.슬라이드를 Milli Q수에 한 번 담갔다가 shiff 시약으로 조직을 염색합니다. 15분 후, 흐르는 수돗물에 슬라이드를 10분 동안 더 세척한 다음 증류수에 한 번 담급니다. sgio metin으로 핵을 30초 동안 대조 염색한 후, 증류수로 슬라이드를 세 번 세척합니다.마지막으로 슬라이드를 30초 동안 배양합니다. Scot's tap water bluing reagent로 처리한 후 DI water로 3회 더 세척하고, 앞서 calcium blue 염색에서 보여준 것과 같이 조직을 탈수시킵니다. 렉틴을 이용한 글리칸 에피토프의 형광 검출을 위해 커버 슬립으로 슬라이드를 마운팅합니다.먼저, PBS에 희석한 BSA로 슬라이드를 10분에서 30분 동안 블로킹합니다. 그다음, 슬라이드를 avadon과 함께 15분 동안 배양하여 내인성 비오틴을 블로킹하고, PBS로 세척한 후, 다시 PBS로 세척하고 0.01% biotin과 함께 15분 동안 배양합니다. 슬라이드를 염색 상자에 넣고 각 조직 절편 위에 새로 준비한 원하는 렉틴 혼합물을 층을 이루도록 도포한 다음, 렉틴 혼합물을 parfum으로 부드럽게 덮어줍니다.이제 슬라이드를 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 퍼퓨엄(parfum)을 조심스럽게 제거하고 PBS로 슬라이드를 3회 세척합니다. 그다음 conjugate SCI 5에 포함된 strep avid를 슬라이드에 도포하고 다시 암소에서 30분 동안 배양한 후, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고 dappy로 핵을 대조 염색합니다.마지막으로, sase 효소 대조군을 위해 vector mount 마운팅 매질과 같은 수성 매질을 사용하여 커버 슬립으로 슬라이드를 마운트합니다. 우선 빈 팁 박스 바닥에 물을 부어 습윤 챔버를 만듭니다. 음성 대조군 슬라이드를 팁 박스의 상단 트레이 위에 앞면이 위로 향하게 놓습니다.150~200 µL의 US 용액을 조직 절편 위에 층을 이루게 도포한 다음, 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 슬라이드에 커버슬립을 덮습니다. 박스 뚜껑을 닫고 37 °C에서 2시간 30분 동안 배양합니다. 실온의 PBS로 슬라이드를 3회 세척하여 유리 슬라이드에 남아 있는 유리산을 제거합니다.그 다음, 경쟁적 억제를 위해 슬라이드를 SNA와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 대조군으로 렉틴 혼합물 200 µL를 두 개의 einor 바이알에 나눕니다. 그 후, 한 바이알에는 200 mM의 Jacqueline 억제제 Meli bios를 첨가하고, 다른 바이알에는 1:10 희석한 SWGA 억제제 chitin hydrolysate를 첨가합니다.그 후 슬라이드를 억제제 포함 혼합물과 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이 첫 번째 조직 사진에서, OCT로 동결하거나 파라핀에 매립한 생쥐 또는 닭의 결장 표본 절편을 Periodic Acid Schiff로 분홍색으로 또는 Calcium Blue로 파란색으로 염색하였습니다. 파라핀에 매립된 조직 샘플과 OCT 냉동 보호제 매질에 매립된 동결 조직을 비교한 결과, 동결 조직의 뮤신 당단백질 보존 상태와 염색 품질에서 현저한 차이가 나타났습니다.파라핀 포매 조직에서 화살표로 표시된 바와 같이, 술잔세포 내의 뮤신 외에도 분비된 점액이 관찰되었습니다. 점액 염색은 술잔세포에 국한되었습니다. 이 그림에서는 시트러스 리졸브(citrus resolve)로 배양한 조직에서 뮤신의 상당한 손실이 관찰되는 것을 확인할 수 있습니다.냉동된 닭 회장 표본의 연속 절편을 10% 완충 포르말린으로 고정하여 수화 상태를 유지하였으며, 70%, 90%, 100% 에탄올에 각각 20분씩 순차적으로 배양하여 에탄올로 탈수하거나, 에탄올로 탈수 후 citrus all로 한 시간 동안 투명화 처리하였습니다. 에탄올 단독 탈수 및 에탄올 탈수 후 citrus all 투명화 처리가 조직 형태학적 분석 결과를 개선하였습니다. 추가적인 에탄올 단독 탈수는 청색 염색에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다.이와 대조적으로, 감귤류(citrus)의 모든 배양 조건에서는 청색 염색이 감소하였으며, 이전 그림의 파라핀 임베딩 조직에서 관찰된 것과 유사한 패턴으로 술잔세포(goblet cells)에 국한되어 나타났습니다. 상자는 allium blue 염색 조직 절편에서 고배율로 관찰한 영역을 나타냅니다. 다음 이미지 시리즈에서는 OCT로 동결하거나 파라핀에 임베딩한 후 Jacqueline(청색), SWG(녹색), SNA(적색)로 프로브 분석한 닭의 회장 표본을 동결 조직 상태로 보여줍니다.OCT 동결 조직 절편의 화살표로 표시된 바와 같이, Jacqueline이 olink 글리칸에 결합한 결과 goblet 세포에서 루멘으로 흘러나오는 듯한 구조가 확인되었습니다. 이와 대조적으로, 파라핀 포매 조직에서의 Jacqueline 결합은 화살표로 표시된 goblet 세포와 융모 브러시 경계(brush border)에 국한되었습니다. 화살표로 표시된 바와 같이, beta one four GL의 SWGA 염색은 동결 조직과 파라핀 포매 조직 모두에서 Jacqueline 렉틴의 결합과 부분적으로 공국소화(co-localize)됩니다.이와 대조적으로, 화살표 머리로 표시된 빨간색의 SNA 렉틴은 세포 내의 alpha two six 연결 시알산(sialic acids)에 결합하며, 이 그림에서 점선 화살표로 표시된 파란색의 Jacqueline과는 공국소화(co localize)되지 않습니다. 시알산 에피토프는 조직 절편을 neuraminidase로 소화시켜 닭 회장 표본에서 제거하거나, 여기에서 보는 것처럼 sodium acetate 완충액으로 배양하여 제거되지 않은 상태로 두었습니다. neuraminidase 처리는 처리되지 않은 조직에서 관찰되는 biotinylated SNA 염색을 없앰으로써, 시알산에 대한 SNA의 결합 특이성을 확인시켜 주었습니다.렉틴 특이성은 Jacalin 염색을 위한 melibiose 또는 SWGA 염색을 위한 chitin hydrolysate와 같은 경쟁적 억제제를 추가하여 확인할 수 있습니다. 닭의 회장 표본을 다시 한번 Jacalin과 SWGA 혼합액과 함께 배양하였습니다. 이번에는 특정 렉틴 억제제인 melibiose 또는 chitin hydrolysate를 함께 처리하였습니다. Jacalin 염색은 melibiose에 의해 억제되었으나, chitin hydrolysate에 의해서는 억제되지 않았습니다. 반대로, SWGA 염색은 chitin hydrolysate에 의해 억제되었으나, melibiose에 의해서는 억제되지 않았습니다.이 마지막 이미지 시리즈는 임상 및 연구 실험실에서 일상적으로 얻는 급속 냉동 조직 샘플을 OCT에 추가로 매립하여 뮤신, 당단백질, 당지질 및 당쇄의 글리칸을 연구하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 융모 암종 및 점액 암종 조직에서 얻은 이 대장암 생검 샘플들은 액체 질소로 급속 냉동 후 OCT에 매립되었으며, 지시된 다양한 뮤신 및 글리칸 에피토프에 대해 성공적으로 염색되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조직을 OCT에 매립하는 방법과 면역화학적 방법을 사용하여 점액 및 조직의 당화 상태를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Cajal (ICC)의 중간 세포는 위장 (GI) 트랙트의 맥박 조정기 세포입니다. 그들은 평활근 세포와 GI 수축성 조절에 게시할 - ganglionic의 연결 섬유 사이의 복잡한 네트워크를 형성하고 있습니다. 여기, 우리는 immunofluorescence 횡단면 방법과 murine ICC 네트워크 전체 마운트 시각화를 제시한다.

마우스의 Cajal (ICC) 네트워크의 중간 세포의 시각화

이 동영상은 유방암의 쥐 모델에서 종양 표적 항체의 생체 내 분포를 연구하기 위한 IVIL(in vivo immunofluorescence localization) 기술을 보여줍니다. 마우스에 종양 특이적 항체를 정맥 주사하면 종양을 외과적으로 분리하고 종양 조직 내 항체의 국소화를 생체 외 면역 염색을 통해 확인합니다.

항체 생체내 분포를 연구하기 위한 In Vivo Immunofluorescence 국소화 방법

여기에서는 기저에 있는 크립트 베이스 세포에서 공간적으로 구별되는 쥐 결장 상피 표면 세포를 분리하는 간단한 방법을 설명합니다.

쥐 대장 점막의 이외에 Microdissection을위한 냉동 절편 방법

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

구가 외 인 산화 상태는 말라 바인딩 단백질 girdin 티로신 1798 (pY1798)에 phosphorylated에 대 한 특정 항 체 술 셀 (TCs)을 사용할 수 있습니다 발견. 이 프로토콜의 부동성 공장 cryosections pY1798 항 체와 immunofluorescent 얼룩을 사용 하 여 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다.

장 술 셀 부동성 마우스 공장 Cryosections에 시각화에 안티 인 girdin 항 체의 사용

이 프로토콜의 목적은 포유류 위장관에서 칸디다 알비칸스 세포 모양 및 국소화를 시각화하는 것입니다.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

여기에서는 뮤신에서 O-글리칸을 방출하고 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용한 후속 탈염, 과메틸화 및 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Profiling of Permethylated Mucin O-glycans Using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight 질량 분석기

본 연구는 전체 마운트 장 조직과 다광자 현미경을 사용하여 분비된 점액을 정량화하여 카르바모일콜린 클로라이드와 같은 자극에 대한 점액 역학의 정밀한 체적 분석 및 시각화를 가능하게 하는 3D 이미징 방법을 제시합니다.

전체 마운트 조직 이미징을 사용한 장 점액의 3차원 정량화

배우세요 OCT 매립을 이용한 냉동 조직에서 점액과 당화 패턴을 보존하는 방법을. 레틴과 조직화학 염색을 통해 당질 구조를 정확히 분석하고 기존 냉동 샘플을 활용할 수 있습니다.

자연 점액 배포를 공부하기 위해 떼어 낸, 냉동 조직을 사용하여

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