Name: 호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 학습하세요 호스트 식물 휘발성 물질을 전기생리학적 반응으로 선별하는 방법을 Amyelois transitella 성충을 이용하여. 이 기법은 해충 관리 전략 개발에 활용할 수 있는 효율적인 화학 생태학 연구 도구입니다.

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이 연구는 USDA-ARS 크리스틴 프로젝트 5325-42000-037-00D 아래와 CRADA 58-3K95-7-1198 및 TFCA 58-5325-8-419의 결과와 함께 실시되었다. 저자들은 기꺼이 그의 선물 Suterra을 인정 (지지) -11,13-hexadecadienal, 생산적 토론 B. Higbee, 기술 지원 J. 베이커.에게

1. 심사를 EAG에 대한 호스트 공장에서 포착한 휘발성 물질의 작성 <ol><li> GC-MS를 통해 모든 휘발성 물질의 적절한 식별 및 인증 후 사용 가능한 각 휘발성의 EAG 퍼프 분석을 수행합니다. 초기 검사 시간이 짧은 금액 (표 1)에 상대 chemoreceptivity의 표시를 달성하기 위해 각각의 섹스를 위해 antennal 반응 낮은 복제 번호 (N = 3-5) 될 수 있습니다. </li><li> pentane에 5 밀리그램 / ML 농도에서 각 휘발성의 솔루션을 준비합니다. 단단히 (예 : 아세토페논, 밀도 = 1.03 g / ML, 부피 = (0.005 g/1.03 G / ML) × 1,000 = 4.85 1.0 ML 용적 플라스크에 아세토페논의 μL와가 희석 즉시 사용 준비가 될 때까지 샘플을 밀봉하고 냉장 보관 1.0 pentane과 ML). </li><li> 직전 EAG 분석, 테스트하는 휘발성 물질의 5 밀리그램 / ML 농도를 포함하는 튜브를 제거하고 실내 온도를 따뜻하게 수 있습니다. 한편으로 파스퇴르의 pipettes의 적절한 수를 레이블테스트 각 휘발성와 연관 및 피펫의 팁을 통해 parafilm의 작은 조각 (15 ca. × 15mm)을 싸다. 초기 심사 열 자극 pipettes의 경우 (N은 = 4는 각각 남성과 여성을위한) 불량 준비이나 기타 예상치 못한 장애 발생시로드됩니다. </li><li> 족집게의 쌍을 사용하여 부드럽게 피펫으로 배치를 용이하게 반으로 bioassay 디스크를 접어 후 부분적으로 CA 있도록 피펫의 큰 끝에 접힌 디스크를 넣으십시오. 디스크의 2~3mm이 노출됩니다. 선반 홀더의 라벨 및 준비 pipettes을 맞춥니다. </li><li> pipettor이나 주사기를 사용하여, 각 디스크에 휘발성 용액의 10 μL (50 μg)를로드하고 완벽하게 피펫으로 디스크를 삽입하기 전에 합격 2 분 수 있습니다. 일단로드, 즉시 parafilm (15 ca. × 30mm)와 피펫의 끝을 밀봉. 로드되고 숨이 차서되는 휘발성 자극의 양은 대부분 곤충 종에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 동일한 프로토콜을 준수하면 위에서 언급한에 컨트롤을 준비각 분석에 포함됩니다. 각 디스크에 단지 pentane의 부정적인 제어 부하 10 μL 들어, 2 분 기다려 표시된 피펫으로로드 및 인감. 긍정적인 제어 들어, 디스크에 10 μL (50 μg)를로드 2 분 기다 라벨 피펫으로로드 및 parafilm과 인감. </li><li> 곤충 antennal 사립의 생존 능력은 가능성이 가장 높은 수종에 따라 달라질 것이지만, 우리는 Amyelois transitella 안테나는 일반적으로 기술된 프로토콜을 사용하여 절단 후&gt; 30 분 동안 적극적이고 일관성있게 유지 것으로 나타났습니다. 시간이 금액은 일반적으로까지 평가될 수 있도록 4-10 휘발성 시료에 대해있게됩니다. 표 2는 시간과 시퀀스의 예제를 제공합니다. </li></ol> 2. Bioassay를 EAG위한 곤충 안테나의 작성 <ol><li> 이 실험의 초점은 분석을 EAG되며, 따라서 각 조사 적절하게 reared 곤충에 액세스할 것이라는 가정합니다. </li><li> 본 실험에서는 우리는 마셨다 3~4일를 공부한다D, 성관계 남성과 여성의 나방. 개별 나방은 작고, lidded, 플라스틱 용기 분석 당일로 전송됩니다. bioassay로 바로 전에, 테스트되는 나방이 들고기구 (즉, 각종 플라스틱 pipettor 팁 만든)과 뒤에서 담보로 머리를 최초 전송됩니다. 곤충의 조작은 절단을 촉진하기 위해 저전력 스테레오 - 현미경으로 볼 수 있습니다. </li><li> 안테나 와이어 스쳐 도구를 사용하여 밖으로 조롱하고 있습니다. 전극 젤 작은 영화와 포크 홀더는, 안테나의 빠른 전송을위한 근접 거리에 위치합니다. 첫 번째 안테나는 마이크로 가위를 사용하여 excised과 포크에 배치, 안테나의 기반을 확보하는 것은 포크 (무관심 접지 전극)의 빨간색이 아닌 부분에 위치입니다. 10 분 타이머 세트가 시작되고 두 번째 안테나는 포크의 동일한 측면에 두 기지로 최초의 안테나 옆에 excised과 배치됩니다. </li><li> 또는 안테나 머무르고 내에서 보안 남아있을 수 있습니다g 튜브는 excised 다음, 부드럽게 관과 끝에 젤의 명인과 함께 와이어 스쳐 도구를 사용하여 곤충 사이에서 제거. </li><li> 안테나를 기반과 팁은 전극 젤로 포장되어 있습니다 있도록 확인하고 아무런 거품이 젤에 존재하지 않습니다. 엔드 / 팁은 전극 젤에 대한 전체 노출을 보장 줄어들 수 있습니다. 관리는 각 안테나의 나머지가 따라서 퍼프에 노출되는 최대 antennal 표면적을 보장, 젤 덮여되지 않도록하는 데 사용해야합니다. </li><li> 준비 포크 그런 다음 프로브 프리 앰프에 삽입 200 ML / 기간을 기다리는 십분의 남은 시간을 분에 humidified 공기의 지속적인 흐름 밑에 보관됩니다. 공기 / 퍼프 흐름에게 2-3밀리미터을 지시하도록 조정되는 소비세 시간과 개시 시간을 EAG가 주목된다 (표 2)와 첫 경기 부양 퍼프 이전 삼십초는 긍정적인 컨트롤을 포함하는 피펫은 unsealed와 홀더에 배치됩니다 이 안테나를 준비한. </li><li> 각 exper 후iment은 테스트 나방은 드라이 아이스 환경에서 euthanized 정상적으로 처리됩니다. </li><li> 여성 나방은 짝짓기 상태를 확인하기 위해 해부를하고 있습니다. Cohabitating 수컷들이 짝짓기가로 간주됩니다. </li></ol> 3. 개별 구성 요소에 대한 프로토콜을 EAG <ol><li> Antennal 응답 Syntech의 EAG 악기에 포함된 AutoSpike 소프트웨어를 통해 기록됩니다. EAG 프로브와 채널에 대한 AutoSpike 등록 정보 탭에서 구성은 106.7의 샘플링 속도, NO 수습하고, 그리고 0-42 Hz의 필터로 설정됩니다. 필터 탭을 들어, EAG 필터에 있고 낮은 컷오프는 0.1 Hz로 설정됩니다. </li><li> 자극 퍼프는 기간 1~2초 있습니다. 1 분 설정된 타이머는 각각 낸 후에 시작됩니다. </li><li> 다음 시험 휘발성 피펫은 unsealed와 홀더에 배치됩니다. 무작위 간의 테스트 휘발성 물질의 순서는 어떤 시험 화합물은 지속적으로 다른 테스트 휘발성을 따라하지 않도록 실행 후 다음됩니다 (예 : 표 2) 조심스럽게 allowi퍼프 사이 NG 일분. </li><li> EAG 답변을 읽기의 용이성을 촉진하기 위해 통치자의 일부는 컴퓨터 화면에 배치하고 아래 방향으로 편향 신호의 정점에 기본적인 수준은 mm로 측정하고 데이터 시트 (즉, 5 MV 설정을위한, 33mm에 기록된다 = 2.5 MV). 소프트웨어는 향후 분석을 위해 저장 레코딩의 재생 능력을 가지고 있습니다. MV 또는 μV 진폭 중 하나에 mm의 전환은 나중에 데이터 분석에서 수행됩니다. </li><li> 최종 긍정적인 제어 퍼프가 (예를 들어, 레코드 # 12) 투여 후 안테나가 제거되고 포크는 에탄올 포화 닦아로 세척 및 이후 사용하기 전에 건조 허용됩니다. </li><li> assays의 처리량을 높이려면 안테나의 다음 세트의 절단은 약 10 분 현재 실험이 끝나기 전에 두 번째 실험실 요원에 의해 시작될 수 - 네 번째 낸 후, 현재 실험의 두 번째 테스트 휘발성, 표에 따라 2. 이것은 구경 할 수 있습니다R 직접 현재의 실험 종료 후 다음 실험의 시작. </li><li> 복제의 높은 숫자 (다른 안테나에서) 더 통계적 검증을 제공하기 위해 관심있는 화합물을 수행할 수 있습니다. </li></ol> 4. 혼합 또는 기타 매트릭스의 EAG 분석의 예 (표 3) <ol><li> 다음 두 차 조화 (3-컴포넌트 혼합물)에 대한 비율과 볼륨이 높은 EAG 응답 (표 4)을 도출하도록 의도 휘발성 물질을 결합의 예를 제공하기 위해 계산됩니다. 다음 2 phenylethanol과 1시 2분 4초의 두 번째 혼합 비율로 비교 : 2-undecanone : 계산은 기본적인 비율, α-humulene의 1시 1분 1초 어금니 비율을위한 것입니다. </li><li> 유사한 프로토콜을 사용하여 이전 버전 혼합물의 준비를하고 레이블이 붙은 파스퇴르의 pipettes가 필요한 긍정적이고 부정적인 컨트롤과 함께로드되어 있습니다 설명했다. </li><li> 휘발성 샘플은 남성과 여성의 안테나를 통해 부풀하고 응답을 측정하고 로그온되어데이터 시트 (표 3). </li></ol> 5. 대표 결과 여성의 배꼽 orangeworm 들어 다음과 같은 설정이 사용됩니다 : 이초 퍼프, 십초 녹화 시간, 10 초간 열리, 5 MV 규모. 부정적인 편향은 전형적인 반응이며, 아직 절대 값 (예 : -3,400 μV 편향은 3400 μV로 기록됩니다) 기록됩니다. 긍정적인 컨트롤에 대한 준비의 비교적 약한 반응은 무시됩니다. 그림 1은 배꼽 orangeworm에 의해 긍정적인 제어 가난한 응답의 그래픽 표현을 제공합니다. 가난한 제어 결과의 예를 들어, 아세토페논으로 평균 여성 antennal 반응은 일반적으로 CA입니다. 2600 μV (그림 2), 준비만이 CA의 응답을 해준다면 말이지. 1300 μV 그것은 폐기 및 안테나 또 한 쌍의가 준비됩니다. 마찬가지로 평균 남성 응답 (Z, Z) -11,13-hexadecadienal는 typicall였다Y 3000 μV은, 따라서, 모든 응답은 이하 1,500보다 μV는 일반적으로 폐기되었다. 각 실험의 시작과 끝에 긍정적인 컨트롤은 또한 안테나의 상태에 관한 정보를 제공합니다. 포스트 컨트롤 (레코드 # 12, 표 2) 퍼프에 antennal 반응은 미리 제어 1 일 퍼프 (레코드 # 1 미만의 75% 하나있다면 우리는 신속한 심사를 위해 다음과 엄지손가락의 규칙입니다 , 표 2) 또는 이전 컨트롤 (레코드 # 2, 표 2) 다음 실험 (그림 3)로 인해 준비 가능한 저하로 데이터 분석에 사용되지 않습니다의 2 차 퍼프보다. 엄지의 첫 번째 규칙의 예는 기록 # 1이 될 것입니다 = 2,730 μV 및 레코드 # 12 = 1,680 μV, 그리고 엄지의 두 번째 규칙은 만약 이러한 경우 각각에 기록 # 2 = 2350 μV 및 레코드 # 12 = 1,680 μV, , 준비 및 실험의 결과는 폐기됩니다. 와 같은 긍정적인 컨트롤로 측정 EAG 응답 값을 수정 대표 예제는 다음과 같이 될 것입니다. <table border="1"><tbody><tr><td> # 실행 </td><td> EAG (μV) </td><td> # 2를 실행 </td><td> EAG (μV) </td><td> # 3를 실행 </td><td> EAG (μV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2800 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2420 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 3030 </td></tr><tr><td> 를 Cmpnd </td><td> 3000 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 2500 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 3440 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 530 </td><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 755 </td><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 910 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 2400 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2000 </td><td> Cmpnd B </td><td> 2560 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2770 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2400 </td><td> (+) 클릭률리터 </td><td> 3020 </td></tr></tbody></table> N = 3 실험 위의 값을 사용하여 부정적인 제어 응답이 부정적인 제어가 기계적 퍼프와 용매 잔류에 대한 기준 antennal 반응이다 가정하에 각 실험 내의 모든 값에서 빼는됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1를 실행 </td><td> EAG (μV) </td><td> # 2를 실행 </td><td> EAG (μV) </td><td> # 3를 실행 </td><td> EAG (μV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2270 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 1665 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2120 </td></tr><tr><td> 를 Cmpnd </td><td> 2470 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 1745 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 2530 </td></tr><tr><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 0 </td><td> (-) Ctrl 키를 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Cmpnd B</td><td> 1870 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1245 </td><td> Cmpnd B </td><td> 1650 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2240 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 1645 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2110 </td></tr></tbody></table> 각 실험에 대한 긍정적인 컨트롤이 후 평균 1,000 μV로 정정에 대한 비율을 지적하며, 1,000 μV로 수정됩니다. 데이터 시트 (예, 엑셀)를 쉽게 사용할 데이터에 대한 응답을 변환하는 조작 할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1를 실행 </td><td> 평균 (μV) </td><td> # 2를 실행 </td><td> 평균 (μV) </td><td> # 3를 실행 </td><td> 평균 (μV) </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2255 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 1655 </td><td> (+) Ctrl 키를 </td><td> 2115 </td></tr><tr><td> (+) Ctrl 키를 형용사. </td><td> 1000 (0.443) </td><td> (+) Ctrl 키를 형용사. </td><td> 1000 (0.604) </td><td> (+) Ctrl 키를 형용사. </td><td> 1000 (0.473) </td></tr></tbody></table> 각 실험 이내에 보정 비율로 곱한, 화합물의 값이 A와 화합물 B는 그때 조정됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> # 1를 실행 </td><td> 형용사. EAG (μV) </td><td> # 2를 실행 </td><td> 형용사. EAG (μV) </td><td> # 3를 실행 </td><td> 형용사. EAG (μV) </td></tr><tr><td> 를 Cmpnd </td><td> 1094 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 1054 </td><td> 를 Cmpnd </td><td> 1197 </td></tr><tr><td> Cmpnd B </td><td> 828 </td><td> Cmpnd B </td><td> 752 </td><td> Cmpnd B </td><td> 780 </td></tr></tbody></table> 각각의 화합물에 대한 평균 (수단)은 다음엔 평가할 수있다 시험 화합물에 대한 기타 관련 통계 자료 및 EAG 답변과 함께 결정됩니다자세한 조사를 위해 후보입니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 화합물 </td><td> EAG (μV) </td><td> 아니요 실행, N = </td></tr><tr><td> </td><td> 1115 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> B </td><td> 787 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig1.jpg" /> 그림 1. 안테나 확보 후 가난한 antennal 반응에 의해 삭제됩니다 미리 제어 (1 일 양수 제어 퍼프)로 남성 antennal 대응 (1180 μV)의 대표 EAG가 젤로 좋은 연락 있습니다. 아래쪽 창문에 파란색 막대는 휘발성의 이초 퍼프를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig2.jpg" /> <s<html> trong&gt; 그림 2.에 여성 antennal 응답 (3400 μV)의 대표 EAG 1 일 낸 적절한 간주되는 사전 관리 기능을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig3.jpg" /> 그림 3. 여성 antennal 가난한 간주되는 포스트 제어에 대한 응답 (1680 μV) (각 실험의 마지막으로 긍정적인 제어) 및 안테나 저하 (&lt;75 1 일 사전 통제 % 또는 &lt;의 암시를위한 대표 EAG 사전 통제 제 2 퍼프 값). 이 예를 들어 1 일 이전 제어 퍼프는 사전 통제 퍼프가 2,350 μV였다 2730 μV 및 2 차했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . &quot;dflinebreak&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig4.jpg" /> 그림 4. 후보 휘발성 조화의 퍼프로 여성 antennal 응답 (3800 μV) 및 최대 초기 편향 (3800 μV), 낸 기간 동안 초기 기울기 (의 후속 측정 EAG 대표 0.3 s/1.2 MV = 0.25 S / MV), 나머지 낸 기간 동안 기울기 (1.6 s/1.9 MV = 0.84 S / MV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3931/3931fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931fig5.jpg" /> 샘플 매트릭스 및 관련 휘발성 물질을 포함하는 그림 5. 작은 수정 배는 A. 걸쳐 부풀 수 transitella 안테나. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3931/3931table1.jpg" /> 표 1.의에서Autospike 프로그램에 다른과 덜 민감한 구성에 의해 결정 비할 아몬드 (2007)과 EAG 응답 ITU 휘발성 방출. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/3931/3931table2.jpg" /> 표 2. 개별 휘발성 컴포넌트에 남성과 여성의 antennal 답변을 녹음 양식의 예. <img alt="표 3" src="/files/ftp_upload/3931/3931table3.jpg" /> 표 3. 휘발성 혼합 및 / 또는 꽃다발로 남성과 여성의 antennal 답변을 녹음 양식의 예. <img alt="표 4" src="/files/ftp_upload/3931/3931table4.jpg" /> 표 4. 혼합된 두 가지 비율에 대한 5 MG / ML 솔루션의 10 ML의 준비의 예. <img alt="표 5" src="/files/ftp_upload/3931/3931table5.jpg" /> 표 5. 2 conse 레코딩을위한 양식의 예남성과 여성 안테나에 걸쳐 하나의 휘발성의 구성 요소 cutive 퍼프.

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</ol>

저자는 파라마운트의 농업 회사, Suterra LLC과 연줄이있는 회사와 기존의 공동 연구 개발 계약을하고 있습니다.

대상 곤충의 chemoreception 응답을 결정하는 bioassay로 electroantennogram 녹음의 사용은 가스 크로마토 그램 (GC-EAD)의 유출에 대한 감지기로 EAG을 활용한 연구는 문헌에서 찾을 수 흔하다는 다수이다. 9,10 방법 시연 상대적인 응답의 확신 임무 높은 복제와 휘발성 구성 요소의 상당 금액의 신속한 심사를 제공할 것입니다. 우리가 &quot;심사&quot;값으로 여기서 제시 안테나의 최대 편향 진폭 신호를 (그림 1-3), 제공할 수 있기 때문에 Syntech 소프트웨어의 AutoSpike 프로그램은 심사 휘발성 물질에 대한 좋은 프로그램입니다. 또한 세미 고급 사용에 대한 기타 기본 정보 (그림 4 참조) AutoSpike는 구성 설정과 연구자가 antennal 반응으로부터 나오는 싶어에 따라 함께 얻을 수있다. GcEAD 또는 EagPro Syntech 프로그램은 응용 프로그램입니다결과 흔적이 antenn...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 아세토페논 </td><td> 알파 - Aesar </td><td> A12727 </td><td> 여 긍정적인 제어 </td></tr><tr><td> (Z, Z) -11,13-Hexadecadienal </td><td> Suterra </td><td></td><td> 남자 긍정적인 제어 </td></tr><tr><td> α-Humulene </td><td> 올드 리치 </td><td> 53,675 </td><td> Sesquiterpene </td></tr><tr><td> 2 - Undecanone </td><td> 올드 리치 </td><td> U1303 </td><td> 지방산 유도체 </td></tr><tr><td> 2 - Phenylethanol </td><td> 올드 리치 </td><td> 77,861 </td><td> Benzenoid </td></tr><tr><td> Pentane </td><td> EMD </td><td> PX0167-1 </td><td> 용제 </td></tr><tr><td> 4 채널 수집 컨트롤러 </td><td> Syntech </td><td> 나DAC-4 </td><td></td></tr><tr><td> EAG 프로브, 프리 앰프 </td><td> Syntech </td><td> 타입 PRG-2 </td><td></td></tr><tr><td> 안테나 홀더 </td><td> Syntech </td><td> PRG-2의 경우 </td><td> 포크 전극 </td></tr><tr><td> 자극 컨트롤러 </td><td> Syntech </td><td> CS-55 </td><td> 공기 흐름과 퍼프 </td></tr><tr><td> 스펙트럼 전극 젤 </td><td> 파커 </td><td> 12-02 </td><td></td></tr><tr><td> Bioassay 디스크 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 2017-006 </td><td> 6mm </td></tr><tr><td> 파스퇴르 pipets </td><td> VWR </td><td> 14673-010 </td><td> 5 잡았다 &quot;(14.6 ㎝) </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> Bemis </td><td> PM-992 </td><td></td></tr></tbody></table>

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 electroantennographic bioassay

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

식물 휘발성 물질은 식물 곤충의 상호 작용에 중요한 역할을한다. 초식 곤충들은 호스트 공장을 찾습니다 kairomones로 알려진 식물의 휘발성 물질을 사용합니다. 1,2를 호스트 공장 재배자에 심각한 경제적 손실를 입힐 수있는 해충에 의한 중요한 농경 법의 상품 먹이 손상되면. 따라서 kairomones는 유인하거나 혼동이 곤충을하고, 따라서, 곤충 제어를위한 살충제에 환경 친화적인 대안을 제공하는 attractants으로 사용할 수 있습니다. 3 불행히도, 식물 생물 기후학 의존 배출량의 다양한 성분과 비율로 광대한 숫자 휘발성 물질을 방출 수 상품 또는 하루의 시간. 이것은 생물학적으로 활성화된 구성 요소 또는 휘발성 컴포넌트 힘든 과정의 조화를 이루고의 신분을 만듭니다. 우리가 실험실 기반의 심사 bioassay의 electroantennography (EAG)를 채용 호스트 식물 휘발성 배출 bioactive 구성 요소를 식별하는 데 도움합니다. EAG는 평가하고 recor 수있는​​ 효과적인 도구입니다D electrophysiologically들은 antennal 수용체를 통해 곤충의 후각 반응. EAG 심사 절차는 유망 bioactive 구성 요소를 식별하는 테스트 휘발성 물질의 수를 줄일 수 있습니다. 그러나 EAG bioassays은 수용체의 활성화에 대한 정보를 제공합니다. 그것은 화합물 elicits 곤충 행동의 유형에 대한 정보를 제공하지 않는다; 행동 반응의 유인, 혐오감 또는 기타 형식으로 될 수 있습니다. 적절한 긍정적인 컨트롤에 대한 상대 EAG에 의해 상당한 반응을 도출하도록 의도 휘발성 물질은 일반적으로 곤충 해충의 행동 반응의 추가 검사로 이동합니다. 실험 디자인을 제시합니다 상세 한 구성 요소 및 bioassay를 EAG 통해 부품의 단순한 조화에 어른 벌레 해충 배꼽 orangeworm (Amyelois transitella)의 electrophysiological antennal 반응의 측정에 의한 4,5 아몬드 기반 호스트 식물의 휘발성 물질을 구분할 고용 방법론. 방법은 두 전직을 활용cised 안테나는 &quot;포크&quot;전극 홀더에 걸쳐 배치. 여기서 보여준 프로토콜 심사 휘발성 물질에 대한 신속한 높은 처리량 표준화된 방법을 제공합니다. 자극 수준을 표준화하기 때문에 antennal 응답이 상대적 chemoreceptivity는 지표가 될 수 있도록 각 휘발성이 세트 일정한 금액을 부담합니다. 부정적인 컨트롤 낸 두 잔류 용매 및 기계적 힘을 electrophysiological 응답을 제거하는 데 도움이됩니다. 긍정적인 컨트롤 (이 인스턴스 아세토페논에서) 남성과 여성의 배꼽 orangeworm (NOW) 나방의 일관된 반응을 elicited있다 하나의 화합물이다. 남성하세요 나방과 일관성있는 응답을 제공하고 bioassay 연구에 사용되는 추가 semiochemical 표준 (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, 여성의 생산 성 페로몬에서 알데히드 구성 요소. 6-8입니다

성인 배꼽 orangeworm의 electrophysiological 응답 (측정하여 빠르게 화면 호스트 식물의 휘발성 물질에 대한 방법<em&gt; Amyelois transitella</em&gt;) 하나의 구성 요소와 electroantennographic 분석을 통한 조화에 안테나를 시연한다.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

식물 휘발성 물질은 식물과 곤충의 상호작용에서 중요한 역할을 합니다. 초식 곤충은 카이로몬(kairomones)으로 알려진 식물 휘발성 물질을 이용하여 자신의 기주를 찾습니다...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 수많은 기주 식물 휘발성 물질의 잠재적 생물학적 활성을 신속하게 스크리닝하는 것입니다. 이는 먼저 관심 대상인 기주 식물 휘발성 물질을 수집하여 GCMS로 분석함으로써 수행됩니다. 그 다음으로 화학 성분을 식별하고 검증합니다.세 번째 단계는 전기영동 분석을 통해 개별 성분들의 생물학적 활성을 충분한 반복 횟수로 스크리닝하는 것입니다. 마지막 단계는 활성 성분들의 혼합물을 제조하고 평가하는 것입니다. 최종적으로, 이러한 결과는 대상 곤충을 이용한 행동 연구에서 추가 조사를 위해 준비된 축소된 성분 목록 또는 성분 혼합물을 제공할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 시간 소모가 많은 행동 연구와 같은 기존 방법들과 비교했을 때, 전기생리학적 분석을 통한 신속한 스크리닝을 통해 절차를 입증하기 위한 다른 연구에 필요한 화합물의 수를 크게 줄일 수 있다는 점입니다. MR Wage가 제 실험실의 기술자인가요? 가스 크로마토그래피 및 질량 분석법으로 관련 휘발성 물질을 확인한 후에는, 사용 가능한 각 휘발성 물질에 대해 전기觸각도 분석 또는 EAG를 먼저 수행할 수 있습니다.하지만, 사용 가능한 휘발성 물질을 준비해야 합니다. 밀폐가 가능하고 4°C에서 보관할 수 있는 용기에 각 휘발성 물질을 펜탄에 녹여 5mg/mL 농도로 조제하십시오. 그 다음, 자극용 피펫을 준비하십시오.휘발성 물질당 10개의 파스퇴르 피펫에 라벨을 붙이고, 팁 부분을 파라필름 조각으로 감쌉니다. 10개의 피펫은 낮은 반복 횟수의 예비 스크리닝에서 각 성별에 휘발성 물질을 전달하기에 충분한 양입니다. 이제 남은 5개의 피펫 세트를 랙 홀더에 정렬하고, 각 피펫의 열린 끝부분에 바이오어세이 디스크를 넣습니다.핀셋으로 디스크를 부드럽게 접어 피펫의 넓은 끝부분에 넣고, 디스크의 2~3mm 정도가 노출되게 합니다. 피펫팅 장치나 주사기를 사용하여 각 디스크에 10 µL의 휘발성 용액을 적하합니다. 일관된 반복 실험 결과를 얻기 위해서는 용액의 계산, 조제 및 준비를 정확하게 수행하는 것이 매우 중요합니다.2분 동안 기다린 후, 디스크를 피펫 안으로 완전히 밀어 넣으십시오. 로딩이 완료되면 즉시 각 피펫을 파라필름으로 밀봉하십시오. 원하는 반복 횟수만큼 이 피펫 준비 과정을 반복하십시오.동일한 프로토콜을 사용하여, 펜탄(pentanes)만 포함된 음성 대조군과 이번 실험의 양성 대조군인 아세토페논(acetophenone) 및 성호르몬을 준비하십시오. 이제 곤충 촉각 준비 단계로 진행합니다.본 실험에서는 프리앰프가 포크 전극의 신호를 EAG 획득 장치로 전달합니다. EAG 장치와 함께 제공된 소프트웨어를 소프트웨어 내에서 적절하게 설정해야 합니다. 먼저 샘플링 속도를 106.7로 설정하여 설정을 구성하십시오.필터 탭에서 rectify 토글을 know로 설정하고 필터를 0에서 42 hertz로 설정하십시오. EAG 필터를 on으로 설정하고 low cutoff를 0.1 hertz로 설정하십시오. 그 다음, 향후 사용을 위해 설정을 구성 파일로 저장하십시오.프로그램의 작동 방식은 새 프로젝트 파일을 열고 특정 이름으로 저장한 뒤 기록을 진행하는 것만큼 간단합니다. 빨간색 삼각형 아이콘을 누르면 기록 프로세스가 시작되며, 각 개별 퍼프(puff)에 대해 미리 설정된 시간 동안 켜진 상태로 유지됩니다. 촉수에 대한 모든 퍼프가 완료되면 검은색 X 아이콘을 눌러 기록을 중단함으로써 EAG 응답을 더 정확하게 읽을 수 있도록 합니다.신호의 기선(baseline) 부분에 작은 자를 컴퓨터 화면에 테이프로 붙일 수 있습니다. 반응은 밀리미터(mm) 단위로 기록한 후, 나중에 마이크로볼트(µV) 단위의 진폭으로 변환합니다. 필요한 경우, 추가 평가를 위해 기록된 내용을 다시 재생할 수 있습니다.본 예시에서는 우화한 지 3~4일 된 수컷 naval orange 나방과 교미한 암컷 나방을 사용하였습니다. 하지만 이 프로토콜은 다른 곤충에게도 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다. 각 곤충을 뚜껑이 있는 작은 플라스틱 용기에 옮깁니다.분석 당일, 생물학적 분석 직전에 곤충을 피펫 팁의 큰 입구에 넣습니다. 이 피펫 팁은 곤충의 머리가 겨우 들어갈 정도의 작은 입구를 가지고 있어야 합니다. 그다음 더 작은 피펫 팁을 사용하여, 실체 현미경 하에서 곤충의 머리가 보일 때까지 곤충을 작은 입구 쪽으로 조심스럽게 밉니다. 촉각이 고정 튜브 내에 잘 고정되었는지, 그리고 촉각의 기부가 절단을 위해 노출되었는지 확인하십시오.다음으로, 전극 겔을 얇게 바른 포크 홀더를 안테나와 아주 가까이 배치합니다. 마이크로 가위로 안테나 두 개를 조심스럽게 떼어낸 후 절제하고, 이 시점부터 이후 자극이 가해질 때까지의 시간을 기록하기 위해 타이머를 시작합니다. 끝에 겔을 약간 묻힌 와이어 팁 도구를 사용하여 안테나 하나를 집어 포크 위에 올립니다. 이때 안테나의 기저부가 포크의 적색이 아닌 무차별 접지 전극(indifferent ground electrode)에 놓이도록 합니다.두 번째 안테나에 대해서도 동일하게 수행합니다. 포크의 같은 쪽에 안테나의 하단을 배치하고, 안테나 위치를 잡은 상태에서 2~3 mm 간격을 둡니다. 필요에 따라 안테나의 끝부분을 다듬습니다.브러시를 사용하여 전극에 겔을 도포하고, 겔 내에 기포가 생기지 않도록 전극의 하단과 팁 부분이 전극 겔에 충분히 잠겼는지 확인하십시오. 휘발성 물질의 퍼프(puff)에 노출되는 안테나 표면적을 최대화하기 위해 안테나의 중앙 부분에는 겔이 닿지 않도록 하십시오. 준비 과정에서 겔 도포가 적절히 완료되면, 포크를 프로브 프리앰프(pre amplifier)에 연결하십시오.이제 안테나 표본의 생존력을 유지하기 위해 준비물 위에 가습된 공기를 흘려줍니다. 절단 후 10분이 지나면 첫 번째 자극을 가합니다. 표본 자극의 작업 순서는 양성 대조군으로 시작하고 종료하며, 그 사이에는 동일한 화합물이 연속되지 않도록 무작위 순서로 화합물을 자극하고 최소 하나 이상의 음성 대조군을 포함합니다. 안테나에 전달되는 화합물의 수는 종마다 다릅니다.Naval orange worm moth 표본은 30분 이상 활성 상태를 유지할 수 있어, 적은 반복 횟수로도 최대 10가지의 휘발성 물질을 용이하게 분석할 수 있습니다. 동일한 시료 전달 원리가 예비 스크리닝에서 반응을 유도하는 것으로 확인된 혼합 화합물의 후속 스크리닝에도 적용됩니다. 첫 번째 자극 피펫은 퍼프(puff)를 가하기 30초 전에 준비해야 하며, 피펫의 밀봉을 해제하고 홀더에 배치하여 공기 흐름이 촉각 절단 후 10분이 지났을 때 촉각에서 2~3mm 떨어진 지점을 향하게 합니다.첫 번째 자극 퍼프를 300 milliliters per minute의 속도로 1~2초 동안 분사합니다. 이제 피펫을 빠르게 교체하여 첫 번째 자극 후 1분이 지났을 때 두 번째 자극이 분사되도록 합니다. 샘플 간의 일관성을 유지해야 실제로 분사되는 휘발성 물질 양의 변동성을 최소화할 수 있습니다.마지막 양성 대조군 퍼프(puff)를 투여한 후, 안테나를 제거하고 포크를 세척하십시오. 에탄올로 적신 와이프로 닦아낸 후, 다음 사용 전에 완전히 건조시키십시오. 분석 처리량을 높이려면 보조 연구원이 이전 준비가 끝나기 10분 전에 깨끗한 포크가 장착된 다음 안테나를 준비해야 합니다.테스트 서열의 경우, 이 방법에는 두 개 이상의 Y-자형 통로(fork)가 필요합니다. 각 실험 후, 테스트용 나방을 드라이아이스 환경에서 안락사시키고 암컷 나방을 해부하여 교미 여부를 확인하십시오. 동거한 수컷은 교미한 것으로 간주합니다. 네이블 오렌지 웜(naval orange worm) 촉각 준비물은 2초간의 퍼프로 자극하였으며, 5mV 스케일의 10초 창을 사용하여 10초 동안 기록하였습니다.전형적인 반응은 음의 편향이었습니다. 하지만 절대값으로 기록하였습니다. 양성 대조군에 대해 약한 반응을 보인 모든 암컷 표본은 폐기하였습니다.나머지 준비물의 평균 반응은 2,600 microvolts였습니다. 마찬가지로, 성 pH 대조군에 대한 수컷의 평균 반응은 일반적으로 3000 microvolts였습니다. 따라서 반응이 기준 미달인 개체는 제외되었으며, 시험 과정 동안 반응이 저하된 촉수에서 얻은 데이터 또한 폐기되었습니다.최종 양성 대조군의 퍼프(puff)에 대한 Anton 반응이 사전 대조군(pre-con control)의 첫 번째 퍼프의 75% 미만이거나, 나머지 실험 런(run)에 대해 사전 대조군의 두 번째 퍼프보다 낮은 경우 분해가 일어난 것으로 판단하였습니다. 반응 값은 각 런의 가공되지 않은 측정값에서 해당 런의 음성 대조군 반응 값을 모든 값에서 빼어 분석하였습니다. 그다음, 각 런의 모든 양성 대조군 값을 평균 냈으며, 각 런의 1000 Microvolts 보정 비율을 기록하여 1000 Microvolts로 보정하였습니다.그 후 테스트 화합물의 값을 양성 대조군 보정 비율에 곱하였습니다. 마지막으로, 모든 실험 횟수에 걸친 각 테스트 화합물의 평균 보정 응답을 비교하여 각 화합물의 추가 조사 가능성을 평가하였습니다. 화학 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 적절한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

곤충 후각 시스템은 electroantennograms (EAG)와 안테나에 위치한 모든 odorant 수용체 뉴런 (ORNs)에서 개별 안에 보관되어과는 반응을 표현하는 아르 단일 sensillum 레코딩 (SSR)의 형태로 기록 odorant 유발 반응에 대한 독특한 기회를 제공 각각 sensilla.

모쓰 강한 시스템에서 Electrophysiological 측정

후각 신호는 곤충의 여러 가지 행동을 중재하고, 휘발성 화합물의 수백 수십 구성 종종 복합 혼합물이다. 곤충 antennal 엽의 멀티 채널 녹음과 가스 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 bioactive 화합물의 식별하는 방법을 설명합니다.

곤충 Antennal 엽에 가스 크로마토 그래피 - 멀티 유닛 레코딩 (GCMR)를 사용하여 강한 휘발성 물질의 식별

이 비디오에서는 선충에 대한 저분자 선충제의 효능을 확인하기 위한 스크리닝 분석을 시연합니다. 선충제는 노출 후 샘플에서 이동성 선충의 수를 감소시키는 경우 효과적인 것으로 간주됩니다.

Small Molecule Nematicides 스크리닝 분석: Ditylenchus dipsaci 에 대한 잠재적 선충제를 스크리닝하는 중간 처리량 방법

수직, T-미로 olfactometer는 절지 동물의 행동 반응을 시금에 설명되어 있습니다. olfactometer은 두 잠재적 인 냄새 필드에 대상이 때 실험은 실험 대상으로 수행 선택권을 측정 할 수 있습니다. 모두 인력과 odorants의 반발이 장치와 함께 측정 할 수 있습니다.

Odorants에 Arthropod 응답을 수직 T-미로 초이스 분석

우리는 자율 로봇에서 EAG(electroantennogram) 형태로 곤충 안테나를 사용하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 당사의 실험적인 설계로 하루 이내에 안정적인 녹음이 가능하며 최대 10Hz까지 개별 냄새 패치를 해결할 수 있습니다. 후각 검색을위한 EAG 센서의 효율성은 로봇을 냄새 소스로 운전하는 것으로 입증됩니다.

후각 검색을위한 자율 로봇에 곤충 Electroantennogram 센서를 사용하여

빈대는 더듬이 후각 감각에 있는 후각 수용체 뉴런에 의존하여 환경의 기호화학 물질을 감지합니다. 단일 센실럼 기록을 활용하여 기호화학 물질에 대한 빈대 반응을 평가하고 관련된 코딩 프로세스를 탐구하는 방법을 보여줍니다.

Semiochemicals에 침대 버그의 후각 신경 세포 응답을 감지하기 위해 단일 ​​Sensillum 기록을 사용하여

사진 매력 검정 경기장; 곤충 매력을 극대화 하기 위해 최적의 빛 색상을 결정 하는 데 사용 됩니다. 그러나 생물 검정 및 메서드는 특정 곤충 행동 및 서식 지. 사용자 지정 가능한 장비 및 수정 야행성 일주 및 지상 또는 공중 곤충에 대 한 설명 합니다.

곤충 연구 또는 모니터링 프로그램에 대 한 사진 매력 생물의 핵심 요소

여기, 우리는 건설 및 기술 바람 터널의 사용 냄새 중재 곤충과 행동 분석에 대 한. 바람 터널 설계와 시각적 자극 없이 여러 방법으로 악취 소스 출시를 촉진 한다. 풍 동 실험은 행동 활성 휘발성 화학 물질을 식별 하는 중요 한 방법.

냄새에 대 한 바람 터널 중재 곤충 행동 분석 실험

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이 연구는 실크모스 안테나를 기반으로 하는 바이오 하이브리드 악취 감지 드론을 위한 실험 프로토콜을 소개합니다. 실크모스 안테나를 이용한 실험용 일란텐노그램 장치의 작동이 제시되고, 나선형 서지 알고리즘을 이용하여 악취 원 국소화를 위해 설계된 바이오 하이브리드 드론의 구조가 더해있다.

악취원 국산화용 실크모스 안테나를 이용한 일탄텐노그래피 기반 바이오 하이브리드 악취 감지 드론

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬에 대한 반응을 추출하고 정량화하는 방법을 확립하여 화학적 통신 및 탐색 궤적을 연구하기 위한 도구를 제공합니다.

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

학습하세요 호스트 식물 휘발성 물질을 전기생리학적 반응으로 선별하는 방법을 Amyelois transitella 성충을 이용하여. 이 기법은 해충 관리 전략 개발에 활용할 수 있는 효율적인 화학 생태학 연구 도구입니다.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

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