호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

이 실험 절차의 전반적인 목표는 수많은 기주 식물 휘발성 물질의 잠재적 생물학적 활성을 신속하게 스크리닝하는 것입니다. 이는 먼저 관심 대상인 기주 식물 휘발성 물질을 수집하여 GCMS로 분석함으로써 수행됩니다. 그 다음으로 화학 성분을 식별하고 검증합니다.

세 번째 단계는 전기영동 분석을 통해 개별 성분들의 생물학적 활성을 충분한 반복 횟수로 스크리닝하는 것입니다. 마지막 단계는 활성 성분들의 혼합물을 제조하고 평가하는 것입니다. 최종적으로, 이러한 결과는 대상 곤충을 이용한 행동 연구에서 추가 조사를 위해 준비된 축소된 성분 목록 또는 성분 혼합물을 제공할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 시간 소모가 많은 행동 연구와 같은 기존 방법들과 비교했을 때, 전기생리학적 분석을 통한 신속한 스크리닝을 통해 절차를 입증하기 위한 다른 연구에 필요한 화합물의 수를 크게 줄일 수 있다는 점입니다. MR Wage가 제 실험실의 기술자인가요? 가스 크로마토그래피 및 질량 분석법으로 관련 휘발성 물질을 확인한 후에는, 사용 가능한 각 휘발성 물질에 대해 전기觸각도 분석 또는 EAG를 먼저 수행할 수 있습니다.

하지만, 사용 가능한 휘발성 물질을 준비해야 합니다. 밀폐가 가능하고 4°C에서 보관할 수 있는 용기에 각 휘발성 물질을 펜탄에 녹여 5mg/mL 농도로 조제하십시오. 그 다음, 자극용 피펫을 준비하십시오.

휘발성 물질당 10개의 파스퇴르 피펫에 라벨을 붙이고, 팁 부분을 파라필름 조각으로 감쌉니다. 10개의 피펫은 낮은 반복 횟수의 예비 스크리닝에서 각 성별에 휘발성 물질을 전달하기에 충분한 양입니다. 이제 남은 5개의 피펫 세트를 랙 홀더에 정렬하고, 각 피펫의 열린 끝부분에 바이오어세이 디스크를 넣습니다.

핀셋으로 디스크를 부드럽게 접어 피펫의 넓은 끝부분에 넣고, 디스크의 2~3mm 정도가 노출되게 합니다. 피펫팅 장치나 주사기를 사용하여 각 디스크에 10 µL의 휘발성 용액을 적하합니다. 일관된 반복 실험 결과를 얻기 위해서는 용액의 계산, 조제 및 준비를 정확하게 수행하는 것이 매우 중요합니다.

2분 동안 기다린 후, 디스크를 피펫 안으로 완전히 밀어 넣으십시오. 로딩이 완료되면 즉시 각 피펫을 파라필름으로 밀봉하십시오. 원하는 반복 횟수만큼 이 피펫 준비 과정을 반복하십시오.

동일한 프로토콜을 사용하여, 펜탄(pentanes)만 포함된 음성 대조군과 이번 실험의 양성 대조군인 아세토페논(acetophenone) 및 성호르몬을 준비하십시오. 이제 곤충 촉각 준비 단계로 진행합니다.

본 실험에서는 프리앰프가 포크 전극의 신호를 EAG 획득 장치로 전달합니다. EAG 장치와 함께 제공된 소프트웨어를 소프트웨어 내에서 적절하게 설정해야 합니다. 먼저 샘플링 속도를 106.7로 설정하여 설정을 구성하십시오.

필터 탭에서 rectify 토글을 know로 설정하고 필터를 0에서 42 hertz로 설정하십시오. EAG 필터를 on으로 설정하고 low cutoff를 0.1 hertz로 설정하십시오. 그 다음, 향후 사용을 위해 설정을 구성 파일로 저장하십시오.

프로그램의 작동 방식은 새 프로젝트 파일을 열고 특정 이름으로 저장한 뒤 기록을 진행하는 것만큼 간단합니다. 빨간색 삼각형 아이콘을 누르면 기록 프로세스가 시작되며, 각 개별 퍼프(puff)에 대해 미리 설정된 시간 동안 켜진 상태로 유지됩니다. 촉수에 대한 모든 퍼프가 완료되면 검은색 X 아이콘을 눌러 기록을 중단함으로써 EAG 응답을 더 정확하게 읽을 수 있도록 합니다.

신호의 기선(baseline) 부분에 작은 자를 컴퓨터 화면에 테이프로 붙일 수 있습니다. 반응은 밀리미터(mm) 단위로 기록한 후, 나중에 마이크로볼트(µV) 단위의 진폭으로 변환합니다. 필요한 경우, 추가 평가를 위해 기록된 내용을 다시 재생할 수 있습니다.

본 예시에서는 우화한 지 3~4일 된 수컷 naval orange 나방과 교미한 암컷 나방을 사용하였습니다. 하지만 이 프로토콜은 다른 곤충에게도 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다. 각 곤충을 뚜껑이 있는 작은 플라스틱 용기에 옮깁니다.

분석 당일, 생물학적 분석 직전에 곤충을 피펫 팁의 큰 입구에 넣습니다. 이 피펫 팁은 곤충의 머리가 겨우 들어갈 정도의 작은 입구를 가지고 있어야 합니다. 그다음 더 작은 피펫 팁을 사용하여, 실체 현미경 하에서 곤충의 머리가 보일 때까지 곤충을 작은 입구 쪽으로 조심스럽게 밉니다. 촉각이 고정 튜브 내에 잘 고정되었는지, 그리고 촉각의 기부가 절단을 위해 노출되었는지 확인하십시오.

다음으로, 전극 겔을 얇게 바른 포크 홀더를 안테나와 아주 가까이 배치합니다. 마이크로 가위로 안테나 두 개를 조심스럽게 떼어낸 후 절제하고, 이 시점부터 이후 자극이 가해질 때까지의 시간을 기록하기 위해 타이머를 시작합니다. 끝에 겔을 약간 묻힌 와이어 팁 도구를 사용하여 안테나 하나를 집어 포크 위에 올립니다. 이때 안테나의 기저부가 포크의 적색이 아닌 무차별 접지 전극(indifferent ground electrode)에 놓이도록 합니다.

두 번째 안테나에 대해서도 동일하게 수행합니다. 포크의 같은 쪽에 안테나의 하단을 배치하고, 안테나 위치를 잡은 상태에서 2~3 mm 간격을 둡니다. 필요에 따라 안테나의 끝부분을 다듬습니다.

브러시를 사용하여 전극에 겔을 도포하고, 겔 내에 기포가 생기지 않도록 전극의 하단과 팁 부분이 전극 겔에 충분히 잠겼는지 확인하십시오. 휘발성 물질의 퍼프(puff)에 노출되는 안테나 표면적을 최대화하기 위해 안테나의 중앙 부분에는 겔이 닿지 않도록 하십시오. 준비 과정에서 겔 도포가 적절히 완료되면, 포크를 프로브 프리앰프(pre amplifier)에 연결하십시오.

이제 안테나 표본의 생존력을 유지하기 위해 준비물 위에 가습된 공기를 흘려줍니다. 절단 후 10분이 지나면 첫 번째 자극을 가합니다. 표본 자극의 작업 순서는 양성 대조군으로 시작하고 종료하며, 그 사이에는 동일한 화합물이 연속되지 않도록 무작위 순서로 화합물을 자극하고 최소 하나 이상의 음성 대조군을 포함합니다. 안테나에 전달되는 화합물의 수는 종마다 다릅니다.

Naval orange worm moth 표본은 30분 이상 활성 상태를 유지할 수 있어, 적은 반복 횟수로도 최대 10가지의 휘발성 물질을 용이하게 분석할 수 있습니다. 동일한 시료 전달 원리가 예비 스크리닝에서 반응을 유도하는 것으로 확인된 혼합 화합물의 후속 스크리닝에도 적용됩니다. 첫 번째 자극 피펫은 퍼프(puff)를 가하기 30초 전에 준비해야 하며, 피펫의 밀봉을 해제하고 홀더에 배치하여 공기 흐름이 촉각 절단 후 10분이 지났을 때 촉각에서 2~3mm 떨어진 지점을 향하게 합니다.

첫 번째 자극 퍼프를 300 milliliters per minute의 속도로 1~2초 동안 분사합니다. 이제 피펫을 빠르게 교체하여 첫 번째 자극 후 1분이 지났을 때 두 번째 자극이 분사되도록 합니다. 샘플 간의 일관성을 유지해야 실제로 분사되는 휘발성 물질 양의 변동성을 최소화할 수 있습니다.

마지막 양성 대조군 퍼프(puff)를 투여한 후, 안테나를 제거하고 포크를 세척하십시오. 에탄올로 적신 와이프로 닦아낸 후, 다음 사용 전에 완전히 건조시키십시오. 분석 처리량을 높이려면 보조 연구원이 이전 준비가 끝나기 10분 전에 깨끗한 포크가 장착된 다음 안테나를 준비해야 합니다.

테스트 서열의 경우, 이 방법에는 두 개 이상의 Y-자형 통로(fork)가 필요합니다. 각 실험 후, 테스트용 나방을 드라이아이스 환경에서 안락사시키고 암컷 나방을 해부하여 교미 여부를 확인하십시오. 동거한 수컷은 교미한 것으로 간주합니다. 네이블 오렌지 웜(naval orange worm) 촉각 준비물은 2초간의 퍼프로 자극하였으며, 5mV 스케일의 10초 창을 사용하여 10초 동안 기록하였습니다.

전형적인 반응은 음의 편향이었습니다. 하지만 절대값으로 기록하였습니다. 양성 대조군에 대해 약한 반응을 보인 모든 암컷 표본은 폐기하였습니다.

나머지 준비물의 평균 반응은 2,600 microvolts였습니다. 마찬가지로, 성 pH 대조군에 대한 수컷의 평균 반응은 일반적으로 3000 microvolts였습니다. 따라서 반응이 기준 미달인 개체는 제외되었으며, 시험 과정 동안 반응이 저하된 촉수에서 얻은 데이터 또한 폐기되었습니다.

최종 양성 대조군의 퍼프(puff)에 대한 Anton 반응이 사전 대조군(pre-con control)의 첫 번째 퍼프의 75% 미만이거나, 나머지 실험 런(run)에 대해 사전 대조군의 두 번째 퍼프보다 낮은 경우 분해가 일어난 것으로 판단하였습니다. 반응 값은 각 런의 가공되지 않은 측정값에서 해당 런의 음성 대조군 반응 값을 모든 값에서 빼어 분석하였습니다. 그다음, 각 런의 모든 양성 대조군 값을 평균 냈으며, 각 런의 1000 Microvolts 보정 비율을 기록하여 1000 Microvolts로 보정하였습니다.

그 후 테스트 화합물의 값을 양성 대조군 보정 비율에 곱하였습니다. 마지막으로, 모든 실험 횟수에 걸친 각 테스트 화합물의 평균 보정 응답을 비교하여 각 화합물의 추가 조사 가능성을 평가하였습니다. 화학 물질을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 항상 적절한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.