Name: 단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 자성 비즈를 이용한 액상 동질 캡처 분석법으로 단백질-단백질 상호작용을 정량적으로 연구하는 방법을. 폴리오바이러스와 나노바디 상호작용 분석에 활용할 수 있습니다.

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저자 방사성 레이블 바이러스의 준비를 위해 제약 생명 공학 및 분자 생물학의학과, 특히 모니크 드 Pelsmacker의 직원을 감사드립니다. 우리는 엘렌 Merckx하고 흥미로운 발언 및 토론을위한 Hadewych Halewyck과 실험실에서 그의 도움을 Gerrit 드 Bleeser에 감사를드립니다. 이 작품은 재정적 Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoe​​k Vlaanderen (G.0168.10N)와 세계 보건기구 (TSA 200,410,791)의 OZR의 교부금에 의해 지원되었다. 리자 Schotte는 Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoe​​k Vlaanderen (FWO)의 predoctoral 동료입니다.

원칙적으로 (A)와 방법에 대한 개요는 (B) 그림 1에 표시됩니다. 1. 버퍼의 작성 <ol><li> 용해 나트륨 dihydrogen 인산 (50 ㎜)과 물에 나트륨 염화물 (300 ㎜)에 의해 워시 / 바인딩 버퍼를 준비하고 8.0로 산도를 조정합니다. 또한 메티오닌 (2 % (M / V) 최종 농도) 및 알부민 십대 초반 20 (0.01 % (M / V) 최종 농도), (0.1 % (M / V) 최종 농도)을 추가하고 필요한 볼륨으로 조정합니다. </li></ol> 2. 마그네틱 비즈의 작성 사용 설명서에 따라 자기 구슬을 준비합니다. 간단히 : <ol><li> 와동을 사용하여 자기 구슬을 Resuspend. </li><li> 양도, 각 샘플에 대해, 튜브로 resuspended 자석 구슬 (40 밀리그램 / ML) 10 μl. </li><li> 뜨는가 분명하다 때까지 자석을 사용하여 자기 구슬을 모아서 (+ / - 30 초)과 뜨는을 조심스럽게 제거합니다. </li><li> 씻으십시오자석 구슬로 두 번 : 워시 / 바인딩 버퍼 150 μl에 구슬을 resuspend. 자석 구슬 뜨는 분명히 때까지 자석을 사용하여 튜브의 한쪽으로 마이 그 레이션하고 신중하게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 구슬을 (10 밀리그램 / ML) resuspend하려면 각 샘플에 대해 워시 / 바인딩 버퍼 40 μl를 사용하십시오. </li></ol> 3. 동질 캡처 분석 참고 : (우주) 배경 방사능 (0 % 방사능)를 측정하려면 어떤 radiolabeled 바이러스가 제어 예제 1에 추가되지 않습니다. 대신, 같은 볼륨 바인딩 / 워시 버퍼가 추가됩니다. 참고 : 100 % 방사능 모든 구성 요소가 nanobody 제외하고는 추가됩니다하도록 컨트롤 샘플 2로 정의됩니다. 대신, 같은 볼륨 바인딩 / 워시 버퍼가 추가됩니다. <ol><li> 96 - 웰 microtiter 접시에 80 μl로 워시 / 바인딩 버퍼에 희석 (β-방사선) poliovirus 세이빈 변형 유형 1 9, 라벨 35 S 2000 CPM 와요. </li><li> 추가 10 &amp; MU; 우물에 nanobody 희석의 리터. </li><li> 흔드는를 사용하여 약 10 초간 섞는다. </li><li> 샘플은 실온에서 1 시간 품어하도록 허용합니다. </li><li> 한물간 자석 구슬 서스펜션의 40 μl를 추가하고 지속적으로 흔들어 아래 실온에서 10 분 동안 품어. </li><li> 구슬과 자석을 사용하여 표면에 뜨는을 분리하고 튜브로 정리 뜨는을 전송. </li></ol> 4. 방사능의 측정 <ol><li> 계산 플라스크에 단계 3.6에서 뜨는 50 μl를 전송합니다. </li><li> 섬광 액과 혼합 3 ML을 추가합니다. β-신틸레이션 계수기의 방사능을 측정합니다. </li></ol> 5. 비즈를 재활용 <ol><li> 이분 500 XG이나 맑은 뜨는 얻을 때까지 튜브와 원심 분리기에 사용되는 자성 비즈를 수집합니다. </li><li> 뜨는 제거 및 6 ML 0.5 M NaOH에 구슬을 resuspend. </li><li> multipl로 정학을 전송전자 튜브 5 분간 초음파 욕조에서 품어. </li><li> 자석 구슬을 수집하고 뜨는을 제거 자석을 사용합니다. </li><li> 각 관 1 ML 2% SDS-솔루션을 추가하고 와동을 사용 resuspend. 오분 동안 끓여야. </li><li> 비즈를 수집하고 뜨는을 제거하십시오. 한 ML 0.2 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 = 7)에서 구슬을 Resuspend. </li><li> 5 분간 초음파 욕조에서 튜브를 부화하고 한번 더 뜨는을 제거합니다. </li><li> 각 튜브에 물 1 ML을 추가하고 염주를 resuspend. 비즈를 수집하고 뜨는을 제거하십시오. 두번 세차 단계를 반복합니다. </li><li> 뜨는을 제거하고 1 ML 10 밀리미터 CoCl 2 용액에 구슬을 resuspend. 10 분 동안 흔드는 쓰세요. </li><li> 비즈를 수집하고 워시 / 바인딩 버퍼의 1 ML에 resuspend하기 위해 자석을 사용하여 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 표면에 뜨는를 제거하고 비즈 20 %의 한 ML을 사용하여 두 번 (V / V) 에탄올을 씻어 </li><li> 20 % 원래 부피 (V / V) 동부 표준시에 구슬을 Resuspend40 MG / ML의 농도로 거듭난 구슬을 얻는 hanol. </li></ol> 6. 결과의 해석 <ol><li> 더 radiolabeled 바이러스가 추가되지 않았습니다있는 컨트롤 샘플 1, 배경 방사능을 위해 수정하고 0 % 방사능 값을 설정하는 데 사용됩니다. nanobody, 어디 따라서 모든 radiolabeled 바이러스가 뜨는에 남아를 포함하지 않는 컨트롤 샘플 2, 100 % 방사능 값으로 설정됩니다. </li><li> nanobody 의해 radiolabeled 바이러스 - 뜨는의 방사능의 비율 (= %) 전체 강수량 (% = 100)의 통계입니다. </li></ol> 7. 대표 결과 이 친화 캡처 분석을위한 대표적인 결과는 그림 2, 3 및 4에 표시됩니다. 그림 2에서 PVSS38C, poliovirus를위한 nanobody의 특정의 친화력이 나타납니다. PVSS38C의 친화력은 poliov 세 가지 항원에 대한 검사를했습니다irus : 네이티브-항원 (N-항원), 온수-항원 (H-항원)와 14S subunits. N-항원은 전염성이있는 그대로 바이러스입니다. 바이러스가 가열 (56 빠르면 20 분정 ° C) 또는 바이러스 RNA의 (부분) 손실 및 capsid 단백질 VP4 그 결과 고체 표면 (미발표 결과), capsid 변화의 형태로 부착하고, 비어있는 경우 capsids 그런 다음, H 항원이라고하는 형성된다. 14S subunits는 어셈블리 중간체입니다. 이러한 항원은 예방 접종 10시 항체의 다른 세트를 인정하므로 다른 epitopes와 antigenic 사이트를 보유하고 있습니다. 그림에서 뜨는에서 발견된 방사능의 비율은 nanobody의 농도의 함수로 표현된다. 그것은 radiolabeled 14S subunits를 포함하는 시료의 표면에 뜨는에서 방사능이 nanobody PVSS38C의 증가 농도와 함께 저하되는 모습을 볼 수 있습니다. 이것은 poliovirus 14S subunits 죄수에게의 양을 증가로 번역될 수nanobody PVSS38C와 간접적으로 자석 구슬로 nected. 캡처 titer는 (radiolabeled 바이러스의 50 %를 캡처 nanobody 필요한 중 = 농도) 그래픽 0.099 NM로 계산됩니다. N-antigenic과 poliovirus의 H-antigenic 양식에 대한 PVSS38C의 어떠한 친화력을 준수하지 않습니다. 이러한 데이터에서 그것은 PVSS38C가 poliovirus의 두 개의 다른 antigenic 양식에 대한 독점적 14S subunit에 존재하며 없습니다 에피토프와 상호 작용하는 것을 해석됩니다. 표면에 뜨는에서 방사능의 손실만이 그 항원에 대한 nanobody의 구체적인 친화력에 의한 것이 입증하기 위해 동일한 분석이 Nb1으로 수행되었다 Sulfolobus sulfataricus의 lrpB transcriptional 레귤레이터로부터 생성되고 알려진 nanobody은 상호 작용과이 없습니다 모든 poliovirus의 항원. 이 분석의 결과는 그림 3에 표시됩니다. 모든 radiolabeled 바이러스는 전혀 반응이 없다는 것을 보여주는 supernatants에 남아 있습니다poliovirus의 세 antigenic 양식에 대한 Nb1. 결과의 재현성이 다른 일에 하나의 주어진 nanobody (즉, PVSP29F)에 여덟 배나 총 실험을 반복하여하고 다른 사람에 의해 테스트되었다. 결과는 그림 4에 표시됩니다. 뜨는의 비율 방사능의 평균 가치는 각 nanobody 농도에 대해 계산하고 표준 편차와 안내문 표시됩니다. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> 1 그림. 분석의 원칙 (A)의 개요 및 방법 (B). A. 구체적으로 특정 poliovirus의 항원은 코발트 코팅 자성 구슬과 상호 작용하고 radioactively 레이블이 바이러스를 침전 것입 수있을 것입 인식 nanobodies을 그의 -이 태그로 지정했습니다. B. 그 .. 태그를 nanobodies는 radioactively 분류 poliovirus에 추가 incubated됩니다. 코발트 - 코팅 자석 구슬입니다추가 및 바운드 / 언바운드 항원의 자성 분리가 수행됩니다. 뜨는의 방사능이 측정되며 캡처한 항원의 양은 얻을 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> 그림 2. nanobody PVSS38C하여 다른 poliovirus의 항원의 마그네틱 비즈 친화 캡쳐. 표면에 뜨는에서 발견된 방사능의 비율은 PVSS38C의 농도의 함수로 표현된다. 14S의 경우 농도 - 반응 관계는 14S에 독점적으로 현재 에피토프로 PVSS38C의 상호 작용을 보여주는 찾을 수 있습니다. 아무도 상당한 상호 작용이없는 N-않으며이 아닌 특정 매우 높은 농도에서 캡처 무시할들이 언급되고 있지만, H 항원이, 감지가 가능하다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> 그림 3. nanobody Nb1하여 다른 poliovirus의 항원의 마그네틱 비즈 친화 캡쳐 </stronG&gt;. 표면에 뜨는에서 발견된 방사능의 비율은 Nb1의 농도의 함수로 표현된다. Nb1 어떤 poliovirus-항원 또는-subunit와 아무런 상호 작용이 없다 것으로 알려져 있습니다. 방사능의 100 %가 뜨는에서 발견되기 때문에 어떤 바이러스가 아닌 특별히 Nb1에 바인딩 없었다. 그림 2에 방사능의 손실 따라서 그 항원에 대한 nanobody의 구체적인 친화력에게만 때문입니다. <img alt="4 그림." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> 4 그림. 분석의 재현성. 뜨는의 비율 방사능의 평균 가치는 nanobody의 농도의 함수로 표현된다. 실험은 다른 일에, 다른 사람에 의해 8 번 반복되었다. 표준 편차는 세로 막대로 표시됩니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

프로토콜에서 nanobody 상호 작용 항원의 방사능이 뜨는에서 radiolabeled 바이러스의 손실로 정의됩니다. 따라서 시켰던 방사능 (= 100 - %)의 금액은 (자성 비즈에 바인딩) 뜨는 (= %)에서 방사능에 의해 간접적인 방법으로 추정됩니다. 한편 500 MM 이미다졸으로 자기 구슬에서 immunocomplexes를 eluting하여 직접적인 방법으로 항원의 시켰던 바운드 분수의 방사능을 측정하는 것도 가능합니다. 그것은 이전에 방사능의 총량과 뜨는 및 펠렛 분수에있는 방사능의 합계 간의 완벽한 일치가있다는 것을 11을 시연했다. 그러므로 허용하고 뜨는의 방사능을 측정하여 시간을 절약할 수있다. 자석 구슬에서 immunocomplexes의 용출을위한 방법은 Thys 외 의해 설명되어 있습니다., 2011 11. APApoliovirus의 RT는 다른 picornaviruses는 경제적으로 중...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;<td<strong&gt; 코멘트</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dynabeads 그 .. 태그 분리 및 풀다운</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; 자성 구슬</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;HiSafe&#39;2</td&gt;<td&gt; Perkin 엘머</td&gt;<td&gt; 1200-436</td&gt;<td&gt; 섬광 유체</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : poliovirus-nanobody의 예

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 한 단백질이 태그를 수 있도록 제공하여 다른 단백질이 라벨이 방법은 단백질 - 단백질 상호 작용 조사하기 위해 구현할 수 있습니다. 그것은 코발트 코팅 자성 구슬에 의해 태그가 단백질의 인식을하고 태그를 단백질과 레이블이 붙은 두 번째 특정 단백질 간의 상호 작용에있는 반면에 손을 대어를 기준으로합니다. 첫째, 라벨 및 태그 단백질을 섞어 실온에서 incubated됩니다. 태그를 인식 자석 구슬은, 추가하고 레이블이 단백질의 바운드 분율은 자석을 사용하여 언바운드 분획에서 분리됩니다. 캡처되는 분류 단백질의 양은 언바운드 분율에 남아 표시된 단백질의 신호를 측정하여 간접적 방법으로 결정될 수있다. conformational 변환 민감한 단백질 엉덩이가되었을 때 설명한 액체 위상 선호도 분석은 매우 유용합니다ayed. 분석의 개발 및 응용 프로그램은 poliovirus 및 nanobodies 1을 인식 poliovirus 간의 상호 작용에 대해 증명하고 있습니다. poliovirus는 단단한 표면 (미발표 결과)에 연결된 conformational 변환 2 ~ 민감한이므로 엘리사의 사용은 제한되며 액상 기반의 시스템은 따라서 선호한다. 자주 polioresearch 3,4에 사용되는 액상 기반 시스템의 예는 마이크로 단백질-immunoprecipitation 시험 5. 이 테스트는 적용을 입증하고있다하더라도, 그것은 6,7 nanobodies에 결석 FC-구조를 필요로합니다. 그러나 또 다른 기회로,이 흥미로운 안정 단일 도메인 항체 8은 쉽게 다른 태그로 조작 할 수 있습니다. 광범위하게 (그의) 6 태그와 같은 자신의 차례에 쉽게 자석 구슬에 코팅 수 니켈이나 코발트와 같은 이가 이온에 대한 친화력을 보여줍 사용됩니다. 따라서 우리는이 간단한 양적 개발친화 캡쳐 분석은 코발트 코팅 자석 구슬을 바탕으로. Poliovirus은 nanobodies과 unhindered 상호 작용을 가능하게하고 정량 검출이 가능하도록 35 S로 분류되었다. 방법은 수행이 용이하고 더 효과적으로 재생 자석 구슬의 가능성에 의해 지원되는 저렴한 비용으로 작성할 수도 있습니다.

이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 그것은 한 손으로 그리고 다른 한편으로는 태그를 단백질과 두 번째 레이블이 붙은 단백질 (예 : poliovirus) 간의 친화력에 자석 구슬 및 태그 단백질 (예 : nanobodies) 사이의 상호 작용을 기반으로 안정적인 기술입니다.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

본 논문에서는 간단하고 정량적인 액상 친화성 캡처 분석법(liquid phase affinity capture assay)을 제시합니다. 한 단백질에는 태그를 부착할 수 있고 다른 단백질에는...

본 프로토콜은 폴리오바이러스(poliovirus)와 폴리오바이러스 인식 나노바디(Poliovirus recognizing nano bodies) 사이의 상호작용을 이용하여 간단한 정량적 액상 친화성 캡처 분석법(quantitative liquid phase affinity capture assay)을 시연합니다. 원칙적으로 코발트 코팅 자기 비드를 사용하여 태그가 붙은 단백질과 상호작용하는 모든 방사성 표지 단백질을 침전(pull down)시킵니다. 먼저, 표지된 단백질과 태그가 붙은 단백질을 혼합하고 상온에서 배양하십시오.그 다음 태그를 인식하는 자성 비드를 첨가하고, 자석을 사용하여 표지된 단백질의 결합 분획을 비결합 분획으로부터 분리합니다. 이어서 비결합 분획에서 발견된 표지된 단백질의 신호를 측정하여 비결합 분획에 존재하는 표지된 단백질의 양을 결정합니다. 이러한 액상 친화성 분석법의 결과는 구조적 변환에 민감한 단백질을 분석할 때 매우 유용합니다.이 액상 상 친화성 캡처 분석법은 폴리오바이러스를 인식하는 나노바디와 다양한 폴리오바이러스 항원 사이의 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이 방법은 한 단백질을 표지하고 다른 단백질을 검출할 수 있다는 전제하에 다른 단백질-단백질 상호작용에도 적용될 수 있습니다. 저희는 폴리오바이러스를 인식하는 나노바디와 다양한 폴리오바이러스 항원 사이의 상호작용을 조사하는 데 관심을 가졌을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.폴리오바이러스는 고체 표면에 부착될 때 구조적 변형에 민감하므로, e LSA의 사용이 제한적입니다. 따라서 액상 기반 시스템을 사용하는 것이 바람직합니다. 폴리오바이러스 연구에서 자주 사용되는 이러한 액상 기반 시스템의 한 예로 마이크로 단백질이 있습니다.면역침강 분석법입니다. 이 테스트는 그 적용 가능성이 입증되었음에도 불구하고, 나노바디(nano bodies)에는 없는 기존 항체의 결정 구조를 필요로 합니다. 흥미롭고 매우 안정적인 단일 도메인 항체인 이러한 나노바디는 다양한 텍스트로 쉽게 엔지니어링될 수 있습니다.널리 사용되는 His-tag은 니켈이나 코발트와 같은 2가 이온에 친화력을 보이며, 이러한 이온들은 자기 비드에 쉽게 코팅될 수 있습니다. 따라서 본 연구진은 코발트가 코팅된 자기 비드 기반의 간단한 정량적 친화성 캡처 분석법을 개발하였습니다.볼텍싱으로 마그네틱 비드 스톡을 재현탁하고, 샘플당 10 µL씩 튜브에 옮긴 후 자석을 사용하여 비드를 펠렛화합니다. 비드를 세척하기 위해 투명한 상층액을 제거합니다. 결합 버퍼 150 µL를 추가합니다.자석을 사용하여 비드를 수확하고, 2차 세척 후 상층액을 제거합니다. 대조군을 포함한 각 샘플당 40 µL의 결합 완충액에 비드를 재현탁합니다. 샘플 1의 배경값을 위해, 방사성 표지 바이러스 없이 대조군과 동일한 부피의 결합 완충액만 넣은 웰을 준비합니다.100% 방사능 시료를 준비합니다. 나노바디 대신 결합 완충액을 사용하여 나머지 모든 성분을 웰에 첨가합니다. 이제 모든 시료에 총 부피 80 µL의 결합 완충액에 포함된 2000 cpm의 S 35 표지 poliovirus seven strain type one을 첨가합니다.대조군을 수용합니다. 샘플 1입니다. 각 샘플에 나노바디 희석액 10 µL를 첨가합니다.쉐이커에서 10초 동안 잘 섞은 후 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 세척된 자성 비드 현탁액 40 µL를 첨가하고 지속적으로 흔들어주며 실온에서 10분 동안 배양합니다. 자석을 이용해 비드를 펠렛화하고, 각 시료의 방사능을 측정하기 위해 맑은 상층액을 튜브로 옮깁니다. 상층액 50 µL를 계수 플라스크로 옮깁니다. 신틸레이션 액 혼합물 3 mL를 첨가하고 신틸레이션 카운터로 측정합니다.물을 사용하여 튜브 내의 사용된 자기 비드를 역으로 끌어당겨 회수한 후 500 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 비드를 0.5 M 수산화나트륨 6 mL에 다시 현탁합니다. 그 후 현탁액을 여러 개의 튜브에 분주하고 초음파 세척기에서 5분 동안 배양합니다.자석을 사용하여 비드를 펠렛화하고 상층액을 제거한 후, 각 튜브에 2% SDS 용액 1 mL를 첨가하고 볼텍싱과 포일링으로 5분 동안 혼합합니다. 이어서 비드를 회수합니다. 각 튜브에 0.2 M EDTA (pH 7) 1 mL를 첨가하고 초음파 세척기에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 비드를 수집하고, 1 mL의 물로 3회 세척한 후 10 mM 염화 코발트 용액 1 mL로 세척합니다. 튜브를 셰이커에 올리고 10분 동안 흔들어 줍니다. 마그넷을 이용하여 비드를 회수한 후, 1 mL의 결합 버퍼에 다시 현탁합니다.1 mL의 20% Ethanol로 두 번 세척한 후, 최종적으로 비즈를 원래 부피의 20% ethanol에 재현탁하여 40 mg/mL 농도의 재생 비즈를 얻습니다. 대조군을 설정하여 배경 방사능을 보정합니다. 대조군 시료 1을 0% 방사능 값으로, 대조군 시료 2를 100% 방사능 값으로 설정합니다.이제 각 샘플에 대해, 나노바디에 의해 방사성 표지된 바이러스가 전체적으로 침전된 정도를 측정하기 위해 상층액 내 방사능의 백분율을 계산하십시오. 본 실험은 천연 항원, 가열 항원 및 14 s 서브유닛의 세 가지 서로 다른 폴리오바이러스 항원을 사용하여 PVSS 38 C와 폴리오바이러스 특이적 항체의 친화도를 평가합니다. 흥미롭게도, 방사성 표지된 14 s 서브유닛을 포함하는 샘플의 상층액 내 방사능은 나노바디 PVSS 38 C의 농도가 증가함에 따라 감소합니다. 이는 나노바디 PVSS 38 C, 그리고 간접적으로는 자성 비드에 결합된 폴리오바이러스 14 s 서브유닛의 양이 증가했음을 나타냅니다.pvs S 38 C가 폴리오바이러스의 N 항원성 및 H 항원성 형태에 대해 아무런 친화력을 보이지 않으므로, 이 나노바디는 폴리오바이러스의 14 s 서브유닛에 특이적인 것으로 보입니다. 이 방법으로 측정한 나노바디의 항원 친화력은 무관한 나노바디인 NB one이 폴리오바이러스의 세 가지 항원성 형태에 대해 반응성을 보이지 않는 것과 비교했을 때 특이적입니다.서로 다른 날에 서로 다른 연구자들이 생성한 이 용량 반응 곡선에서 알 수 있듯이, 이 시스템은 높은 재현성을 나타냅니다. 숙련된 경우, 비드의 재사용을 포함하여 이 신뢰할 수 있는 액상 친화성 캡처 분석을 2시간 이내에 적절히 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 특히 고상 기반 시스템을 사용할 수 없는 경우, 서로 다른 단백질 간의 상호작용을 연구할 때 자기 비드 기반의 액상 친화성 캡처 분석을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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이 비디오에서는 샘플에서 항원 표시 바이러스 유사 입자(VLP)를 분리하기 위해 VLP 포획 분석이라고 하는 면역침전 분석을 시연합니다. 항원은 자기 비드에 결합된 특정 항체와 결합하여 고정화된 항원-항체 복합체를 형성하고 나중에 추가 분석을 위해 분리 및 저장됩니다.

Virus-like Particles Capture Assay: 중화 항체 접합 마그네틱 비드를 사용하여 샘플에서 항원 표시 VLP를 분리하는 방법

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

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단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

여기서는 항원 표시 바이러스 유사 입자(VLP)에서 중화 에피토프를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-유래 VLP의 면역 침전은 단백질 G-컨쥬게이트 자기 비드에 결합된 봉투 당단백질 특이적 단일 클론 항체를 사용하여 수행된다. 포획된 VLP는 이후 바이러스 성 코어 단백질 개그 특이적 항체를 사용하는 SDS-PAGE 및 서양 블롯 분석을 받게 된다.

포획 분석기를 사용하여 바이러스와 같은 입자(VLP) 기반 백신에 표시되는 항원에서 중화에 민감한 에피토프 검출

여기에서는 이중 리포터 유세포 분석 시스템을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2 결합 자기 마이크로스피어에 의해 포착된 온전한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 입자에서 두 개의 고유한 스파이크 단백질 에피토프를 동시에 검출하는 새로 개발된 다중 형광 면역분석법에 대해 설명합니다.

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배우세요 자성 비즈를 이용한 액상 동질 캡처 분석법으로 단백질-단백질 상호작용을 정량적으로 연구하는 방법을. 폴리오바이러스와 나노바디 상호작용 분석에 활용할 수 있습니다.

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