2012년 5월 29일
이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 그것은 한 손으로 그리고 다른 한편으로는 태그를 단백질과 두 번째 레이블이 붙은 단백질 (예 : poliovirus) 간의 친화력에 자석 구슬 및 태그 단백질 (예 : nanobodies) 사이의 상호 작용을 기반으로 안정적인 기술입니다.
이 프로토콜은 폴리오바이러스와 폴리오바이러스 간의 상호작용을 사용하여 나노체를 인식하여 간단한 정량적 액상 친화성 포획 분석을 입증합니다. 주로 코발트 코팅된 마그네틱 비드는 태그가 지정된 단백질과 상호 작용하는 무선 표지 단백질을 끌어내리는 데 사용됩니다. 먼저, 표지되고 태그된 단백질을 혼합하고 실온에서 배양합니다.
그런 다음 태그를 인식하는 자성 비드를 추가하고 자석을 사용하여 표지된 단백질의 결합된 부분과 결합되지 않은 부분을 분리합니다. 그런 다음 unbound fraction에서 발견된 표지된 단백질의 신호를 측정하고 unbound fraction에서 발견되는 표지된 단백질의 양을 측정합니다. 이 액상 친화성 분석의 결과는 확인 전환에 민감한 단백질을 분석할 때 매우 유용합니다.
이 액상 친화성 포획 분석법은 소아마비 바이러스 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하여 나노 보이와 다양한 소아마비 바이러스 항원을 인식할 수 있습니다. 이 방법은 하나의 단백질을 표지하고 다른 단백질을 검출할 수 있는 경우 다른 단백질 단백질 상호 작용에도 적용할 수 있습니다. 우리는 소아마비 바이러스와 다른 소아마비 바이러스 항원 간의 상호 작용을 조사하고 나노 바디와 다른 소아마비 바이러스 항원을 인식하는 데 관심이 있었을 때 이 방법에 대한 ID를 처음 갖게 되었습니다.
소아마비 바이러스는 확증적 전환에 민감하기 때문에 고체 표면에 부착될 경우 e LSA의 사용이 제한된다. 따라서 액상 기반 시스템이 선호되어야 합니다. 폴리오바이러스 연구에 자주 사용되는 액상 기반 시스템의 예로는 마이크로 단백질이 있다.
면역침전 분석법. 이 검사는 그 적용 가능성이 입증되었지만 나노체에는 없는 기존 항체의 결정화된 구조를 필요로 합니다. 흥미롭고 매우 안정적인 단일 도메인 항체인 이러한 나노체는 다른 텍스트로 쉽게 엔지니어링할 수 있습니다.
널리 사용됩니다. 그는 니켈 및 코발트와 같은 2가 이온에 대한 친화력을 보여주며, 이는 차례대로 자기 비드에 쉽게 코팅될 수 있습니다. 따라서 우리는 코발트 코팅된 마그네틱 비드를 기반으로 간단한 정량적 친화성 포획 분석을 개발했습니다.
Reese는 소용돌이에 의한 자성 구슬의 재고를 가지고 각 샘플에 대해 10 마이크로 리터를 튜브 펠릿으로 옮기고 자석을 사용하여 구슬을 펠릿합니다. 구슬을 씻기 위해 투명한 supinate를 제거하십시오. 150마이크로리터의 결합 완충액을 추가합니다.
자석을 사용하여 구슬을 수확하고 두 번째 세척 후 supinate를 제거합니다. 각 샘플에 대해 40마이크로리터의 결합 완충액에 비드를 다시 현탁시킵니다.amp제어할 수 있습니다. 샘플 1의 배경으로, 방사성 표지된 바이러스가 없는 웰을 준비하되 제어를 위해 동일한 부피의 결합 완충액을 준비합니다.
100% 라디오 활동의 두 가지 샘플. 나노 본체를 결합 완충액으로 대체하는 것을 제외한 모든 구성 요소를 웰에 추가합니다. 이제 총 80마이크로리터의 결합 완충액 중 S 35 표지된 소아마비 바이러스 7종 1형을 분당 2000회 주입합니다.
제어를 수락합니다. 샘플 하나. 각 샘플에 10마이크로리터의 나노체 희석액을 추가합니다.
셰이커에서 10초 동안 잘 섞고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 세척된 마그네틱 비드 현탁액 40마이크로리터를 추가하고 연속 진탕 하에 실온에서 10분 동안 배양한 후 비드를 자석으로 펠릿화하고 세척된 SUP natant를 튜브에 옮겨 각 샘플의 방사능을 측정하고 50마이크로리터의 supinate를 계수 플라스크로 옮깁니다. 3ml의 섬광 유체 혼합물을 넣고 이 단열재를 읽으십시오.
사용한 마그네틱 비드를 튜브에 넣고 물과 원심분리기를 500회 G로 2분 동안 역으로 당깁니다. supinate를 버리고 0.5 몰 수산화 나트륨 6 밀리리터에 비드를 다시 매달아 놓습니다. 그런 다음 현탁액을 여러 개의 튜브로 분취하고 초음파 수조에서 5분 동안 배양합니다.
자석으로 구슬을 펠릿화하고 supinate를 제거한 후, 각 튜브에 2%SDS 용액 1밀리리터를 첨가한 다음 5분 동안 와류와 호일로 혼합합니다. 이제 구슬을 수확하십시오. 각 튜브에 1ml의 0.2몰 EDTA pH 7을 추가하고 초음파 수조에서 튜브를 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 구슬을 모으고 1ml의 물로 구슬을 세 번 씻은 다음 10 밀리 몰의 코발트 염화물 용액 1 ml를 씻습니다. 튜브를 셰이커에 10분 동안 놓습니다. 자석에서 비드를 수확하고 1ml의 결합 완충액에 현탁
액을 복원합니다.20 % 에탄올의 1 밀리리터에 두 번 세척하고 마지막으로 20 % 에탄올의 원래 부피로 비드를 재현탁하여 밀리리터 당 40 밀리그램의 농도로 재생 된 비드를 얻습니다. 제어를 설정하여 배경 방사능을 수정합니다. 샘플 1은 0% 방사능 값으로, 대조 샘플 2는 100% 방사능 값으로 지정합니다.
이제 각 샘플에 대해 나노체에 의한 방사성 표지 바이러스의 전체 침전량을 측정하기 위해 sates의 방사능 비율을 계산합니다. 본 실험은 PVSS 38 C와 폴리오바이러스에 특이적인 항체의 3가지 항원, 천연항원, 가열항원, 14 s subunit을 이용하여 친화도를 평가한다. 흥미롭게도, 14 s subunit으로 표지된 radio를 함유하는 샘플의 sate 내 방사능은 nano body PVSS 38 C의 농도가 증가함에 따라 감소하며, 이는 nano body P pvs, S 38 C에 연결되고 간접적으로 자기 구슬에 연결된 Poliovirus 14 s subunit의 양이 증가함을 나타낸다.
N 항원 및 H 항원 형태의 소아마비 바이러스에 대한 pvs S 38 C의 친화성이 관찰되지 않았기 때문에, 나노 바디는 소아마비 바이러스의 14 s subunit에 특이적으로 보인다. 이 방법으로 측정된 항원에 대한 나노체의 친화도는 관련이 없는 나노체와 같이 특이적입니다. NB 1은 세 가지 항원 형태의 소아마비 바이러스에 대해 반응성을 보이지 않는다.
이 시스템은 서로 다른 날에 다른 연구자에 의해 생성된 이 용량 반응 곡선에 표시된 대로 높은 재현성을 생성합니다. 이 신뢰할 수 있는 액상을 마스터하면 포함된 beats를 재활용하는 데 2시간 이내에 친화성 포획 분석을 적절하게 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 특히 고체상 기반 시스템을 사용할 수 없는 경우 서로 다른 단백질 간의 상호 작용을 연구할 때 자기 박동을 기반으로 하는 이 액상 친화성 캡처 분석을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 문서는 마그네틱 비드를 사용하여 태그가 지정된 단백질과 상호작용하는 정량적 액상 친화성 캡처 분석법을 제시합니다. 이 방법은 태그가 지정된 단백질과 마크 단백질(예: 폴리오바이러스) 간의 상호작용을 분석하는 데 특히 효과적입니다.
Quantitative liquid phase affinity capture assays using magnetic beads address a critical need for studying protein-protein interactions where conformational sensitivity limits solid-phase approaches. This method enables robust, reproducible measurement of binding events, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. Its adaptability and low cost make it valuable for early discovery and assay development pipelines across diverse protein systems.
This assay integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, especially for systems where conformational integrity is essential.