파편을 사용하여 풀링된 장면에서 드문 게놈 변종의 탐지

본 절차의 전반적인 목표는 희귀 기능적 변이가 우세하게 나타나는 개체 집단 내에서 특정 유전자를 식별하는 것입니다. 이는 우선 DNA 샘플 집단을 풀링(pooling)함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 차세대 염기서열 분석(NGS) 라이브러리를 제작하고 시퀀싱하는 것입니다.

이어서 리드(read)를 참조 서열에 정렬하고 오류 모델을 생성합니다. 마지막 단계는 splinter 알고리즘을 이용한 컴퓨터 분석입니다. 최종적으로, 풀링된 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing)의 splinter 분석은 희귀 기능적 변이가 다수 존재하는 집단 내의 유전자를 보여주는 데 사용됩니다. 절차를 시연합니다.

오늘은 제 멘토이자 공동 연구자인 Rob Mitra 교수님 연구실의 대학원생 Francesco Vilania와 제 연구실의 대학원생 Enrique Ramos가 함께 진행하겠습니다. 단일 개체 유전자형 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 사전 정보 없이도 혼합된 DNA 분자 집단 내에서 희귀 서열 변이를 매우 정밀하게 검출할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 대규모 코호트 연구에서 새로운 질병 유발 희귀 변이의 빈도를 결정하는 방법과 같이 유전학 및 유전체학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

모든 splinter 실험은 최적의 정확도를 얻기 위해 음성 및 양성 대조군이 필요합니다. PFU ultra high fidelity DNA polymerase를 사용하여 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오. 음성 대조군은 클론화된 벡터 백본과 같이 유전적 변이가 없는 것으로 알려진 임의의 DNA 서열로부터 얻은 PCR 산물입니다.

본 실험에서는 M 13 MP 18 벡터 유래의 1, 934 base pair 앰플리콘(amplicon)을 사용합니다. 양성 대조군은 전체 집단에 존재하는, 이전에 검증된 일련의 서열 변이체들을 사용할 수 있습니다. 해당 데이터를 사용할 수 없는 경우, 본 연구실에서는 이 표에 기재된 바와 같이 PGMT easy 벡터에 클로닝된 엔지니어링 서열 혼합물로부터 생성된 331 base per PCR 산물로 구성된 인공 양성 대조군을 설계하였습니다.

이 서열들을 조합하여 환자군 내 실제 변이의 다양한 소수 대립유전자 빈도를 모사합니다. 본 영상에 첨부된 서면 프로토콜에서 설명한 대로 시료를 PCR 증폭한 후, Kyogen Kayak Quick Column Purification 또는 대량 정제를 위한 진공 매니폴드 장착 96-well 필터 플레이트를 사용하여 각 PCR 생성물에서 과잉 프라이머를 제거합니다. 정제가 완료되면 표준 기술을 사용하여 각 PCR 생성물의 양을 정량합니다.

모든 PCR 산물과 대조군을 분자 수에 따라 정규화하여 하나의 풀(pool)로 합칠 준비를 합니다. 농도 기준으로 풀링할 경우, 크기가 큰 산물보다 작은 앰플리콘이 과잉 대표될 수 있습니다. 대신, 앰플리콘당 정규화된 분자 수를 풀링하십시오.

피펫팅 동안 정확도를 유지할 수 있을 만큼 충분히 큰 임의의 숫자를 선택하십시오. PCR 생성물과 대조군을 준비합니다. 작은 PCR 산물의 경우 단편화 시 말단 부분의 표현이 편향될 가능성이 높으므로, PCR 생성물의 라이게이션이 필요합니다.

이러한 이유로, 우리는 PCR 산물을 단편화하기 전에 대형 벡터에 라이게이션합니다. 프로토콜에 기재된 대로 T four Ligase, T four PNK 및 PEG를 사용하여 평활 말단 라이게이션을 위한 혼합물을 준비합니다. 반응물을 22 °C에서 17시간 동안 배양합니다.

이어서 65 °C에서 20분 동안 배양한 후 4 °C에서 보관하십시오. 그 후, 50 ng의 샘플을 agarose gel에 로딩하여 ligation 여부를 확인합니다. ligation이 성공적이었다면 레인에 고분자량 밴드가 나타납니다.

시료의 점도를 낮추기 위해 Qiagen PB Buffer로 10:1 비율로 희석하여 무작위 초음파 분쇄 전략을 통한 DNA 단편화 준비를 합니다. 그런 다음 24개 시료용 Diagenode Bioruptor를 사용하여 PCR 산물의 거대한 농축물을 단편화하며, 1분당 40초 작동 및 20초 휴지 주기로 25분 동안 고출력으로 초음파 분쇄를 수행합니다. 아가로스 겔에서 DNA 단편화 결과를 확인하고 본문에 설명된 대로 일루미나 시퀀싱을 진행합니다.

시퀀싱을 시작하려면 리드 정렬(read alignment)을 수행하십시오. 원시 시퀀싱 리드 파일을 scarf 형식으로 변환하거나 이를 압축하십시오. 압축은 선택 사항입니다.

관련 정보의 손실 없이 후속 분석 단계에 필요한 시간과 공간을 절약할 수 있습니다. 포함된 정렬 도구를 사용하여 raw read를 주석이 달린 faster 참조 서열에 정렬하십시오. 표적 영역에 특이적인 PCR 반응과 양성 및 음성 대조군을 포함하십시오.

입력 형식은 scarf 형식 또는 압축 형식이어야 합니다. 다음으로, 본문에 설명된 대로 파일 태깅을 수행합니다. 각 런(run)은 고유한 시퀀싱 오류 프로필을 생성하며, 각 런의 오류를 모델링하여 정확한 변이 호출(variant calling)을 수행하기 위해 이를 특성 분석해야 합니다.

정렬된 태그 파일로부터 각 풀 샘플 라이브러리에 서열 변이가 발생하는 것으로 알려진 내부 대조군이 포함됩니다. 포함된 도구를 사용하여 음성 대조군 참조 서열로 오류 모델 파일을 생성하십시오. 모든 음성 대조군 서열을 사용하거나, 5' 말단과 3' 말단이 지정된 경우 일부 서열만 사용할 수 있습니다. 고유 리드(unique reads)와 의사 카운트(pseudo counts)는 항상 적용되어야 합니다.

이 도구는 출력 파일 이름 파라미터 뒤에 0, 1 또는 2가 붙은 세 개의 파일을 생성합니다. 이 파일들은 각각 splinter를 이용한 변이 호출(variant calling) 시의 0차, 1차 및 2차 오차 모델에 해당합니다. 런 오차율 프로필(run error rate profile)을 시각화할 때는 항상 2차 오차 모델을 사용해야 합니다.

오차 모델 그래프를 그리는 데 사용된 Pearl 스크립트를 이용하면 0차 오차 모델 파일에 대한 PDF 오차 플롯을 생성할 수 있습니다. 이 플롯 파일은 런(run)별 오차 경향을 보여주며, 분석을 위한 최대 리드 염기 수를 추론하는 데 활용될 수 있습니다. 다음 섹션에서는 희귀 서열 변이를 검출하기 위해 오차 모델을 사용하여 정렬된 파일에 splinter를 실행하는 방법을 설명하겠습니다.

분석의 첫 번째 단계는 참조 서열과 오류 모델을 사용하여 정렬된 파일에 splinter를 실행하는 것입니다. 결함이 있는 것으로 판명된 단일 리드 염기는 분석에서 제외할 수 있습니다. P-value 컷오프는 변이 호출 분석의 엄격함을 결정합니다.

-1.301의 최소 컷오프 값을 설정하는 것이 적절한 시작점입니다. 풀 크기(pool size) 옵션은 실제 풀 내의 단일 대립유전자보다 낮은 소수 대립유전자 빈도를 가진 잠재적 분산을 제거함으로써 알고리즘의 신호 대 잡음 판별력을 최적화합니다. 풀 크기 옵션은 실험에서 분석된 실제 대립유전자 수보다 크면서 가장 가까운 값으로 설정해야 합니다.

낮은 빈도로 나타나는 변이는 노이즈로 간주하여 무시됩니다. 모든 파라미터와 파일 이름을 입력한 후 splinter를 실행하십시오. 이 파일은 샘플 전체에서 통계적으로 유의미한 모든 히트(hits)를 변이 유형의 위치 설명과 함께 반환합니다.

DNA 가닥당 변이 빈도의 P-value 및 DNA 가닥당 총 커버리지입니다. 샘플 전반의 커버리지를 정규화하기 위해 splinter에서 리스트 바이알을 사용합니다. 첫 번째 필드는 관심 앰플리콘을 나타내며, 두 번째 필드는 돌연변이가 존재하는 위치를 나타냅니다.

N은 서열의 나머지 부분에 돌연변이가 없음을 나타냅니다. 정규화 단계에서는 특정 실험 회차의 민감도와 특이도를 극대화하기 위해 양성 대조군 분석이 핵심적입니다. 이는 초기 컷오프 값인 -1.301만으로는 모든 위양성을 제거하기에 충분하지 않을 가능성이 높기 때문에 중요합니다.

모든 splinter 분석에서는 호출된 각 변이에 대한 실제 P-value가 표시되며, 이는 우선순위를 미리 예측할 수 없는 값입니다. 하지만, 알려진 진양성(true positive) 염기 위치에 대해 초기 결과에 표시된 가장 덜 엄격한 P-value를 사용하여 전체 분석을 반복할 수 있습니다. 이렇게 하면 일반적으로 진양성에 비해 P-value의 유의성이 훨씬 낮은 대부분의, 혹은 모든 위양성(false positive)을 배제하면서 모든 진양성을 유지하는 역할을 합니다.

이 과정을 자동화하기 위해 cutoff tester 스크립트를 사용할 수 있습니다. cutoff tester 스크립트는 splinter 출력 파일과 정규화에 사용된 것과 같은 탭 구분 형식의 양성 대조군 hit 목록 파일이 필요합니다. 결과물로 최적의 값에 점진적으로 도달하는 cutoff 목록이 생성됩니다.

마지막 줄은 해당 런(run)에서 가장 최적의 컷오프(cutoff) 값을 나타내며, 따라서 데이터 분석에 사용할 수 있습니다. 가장 이상적인 결과는 민감도와 특이도가 모두 1에 도달하는 것입니다. 하지만 이 수치에 도달하지 못한 경우, 포함된 리드 염기(read bases) 수를 변경하여 스플린터 분석(splinter analysis)을 최적화할 수 있습니다.

최종 컷오프(cutoff)는 cutoff cut 스크립트를 사용하여 데이터에 적용할 수 있으며, 이를 통해 최적 컷오프 값 미만의 히트(hit)들을 splinter 출력 파일에서 필터링합니다. 이 단계를 거치면 샘플에 존재하는 snip 및 indel이 포함된 최종 splinter 출력 파일이 생성됩니다. 삽입(insertion)에 대한 출력 결과는 치환(substitution)이나 결실(deletion)과는 약간 다르다는 점에 유의하십시오.

혼합 샘플 내 단일 대립유전자의 커버리지에 따른 정확도가 이러한 유형의 그래프로 시각화됩니다. 정확도는 수신자 조작 특성 곡선(ROC curve)의 곡선 아래 면적(AUC)으로 추정하며, 무작위 정확도인 0.5에서 완벽한 정확도인 1.0까지의 범위를 갖습니다. 이 예시에서는 200, 500, 1,000개의 대립유전자가 포함된 풀에서 단일 돌연변이 대립유전자를 검출하기 위한 대립유전자당 커버리지의 함수로 AUC를 도식화하였습니다.

여기 삽입, 결실 및 치환에 대한 전체 함수로 UC가 도식화되어 있습니다. 이 오류 도표는 특정 위치에서 잘못된 염기가 삽입될 확률을 보여줍니다. 오류 프로필은 낮은 오류율을 보이며, 시퀀싱 리드의 3' 말단으로 갈수록 증가하는 경향을 나타냅니다.

특히 서로 다른 기준 뉴클레오타이드는 각기 다른 오류 확률을 나타냅니다. 이 그래프는 대립유전자당 커버리지가 25배를 초과하는 위치에 대해 splinter가 대립유전자 빈도를 추정하는 정확도를 보여줍니다. 이는 splinter로 추정한 풀링된 DNA 대립유전자 빈도와 전장 유전체 연관 분석(GWAS) 결과로 측정된 대립유전자 수 사이의 비교입니다.

매우 높은 상관관계에서 974명의 개인으로 구성된 집단을 추출하여 20 kilobases 이상의 영역을 대상으로 시퀀싱을 수행하였습니다. 희귀 변이 검출을 위해 Splinter를 적용하였습니다. 표준 프로토콜에 따라, 각 개인에 대해 태그된 변이와 새로운 변이의 유전자형 분석 간의 gwas 일치성을 통해 이전에 유전자형 분석을 수행하였습니다.

풀드 샘플(pooled sample)에서 검출된 결과는 매우 우수했습니다. 시퀀싱 결과로부터 집단 내에서 드물게 나타나는 두 가지 변이를 포함하여 총 세 가지의 변이가 신규(denovo)로 검출되었으며, 이는 개별 파이로 시퀀싱(pyro sequencing)을 통해 검증되었습니다. 파이로 시퀀싱과 풀드 시퀀싱 간의 마이너 대립유전자 빈도(minor allele frequencies) 또는 수학적 일치도는 매우 뛰어났습니다. 풀드 샘플에서 희귀 변이 탐색을 완료하면, 많은 연구자가 식별된 변이가 어떠한 기능적 결과(functional consequences)를 초래하는지 알고 싶어 합니다.

따라서 변이의 주석 달기가 개발 이후 프로세스의 다음 단계가 됩니다. 이 기술은 DNA 시퀀싱 분야의 연구자들이 대규모 인구 집단 연구에서 희귀 변이를 특성화하기 위해, 신속하고 비용 효율적인 방식으로 희귀 변이를 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, splinter를 사용하여 풀링된 DNA 샘플에서 희귀 서열 변이를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.