고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

다음 실험의 전반적인 목표는 빠르고 효율적인 방식으로 인간 줄기세포 콜로니를 분리하는 것입니다. 이는 인간 배아 세포를 생쥐 배아 섬유아세포의 조밀한 층 위에 배양함으로써 달성됩니다. 시간이 지남에 따라 줄기세포 집단이 확장되면서 인간 줄기세포의 수가 증가하며, 이들이 중간에 섬과 같은 콜로니를 형성하게 됩니다.

다음으로, 흡입을 통해 meth 층을 제거하여 인간 배아 줄기세포의 개별 콜로니만 남깁니다. 줄기세포 마커에 대한 면역조직화학 염색 결과, 이 방법이 피더 세포를 제거하고 콜로니의 무결성을 유지하는 데 효과적인 분리 방법임이 확인되었습니다. 저는 저희 실험실에서 세포를 공배양하던 중, 과하게 밀집된 배양 시스템으로부터 줄기세포 배양물을 보호하고 싶다는 생각에 이 방법을 처음 고안하게 되었습니다.

따라서 대부분의 사용자가 이 시스템을 사용할 때 겪게 될 문제는 인간 줄기세포 배양 경험의 부족입니다. 저희는 정렬(sorting)이나 줄기세포 콜로니를 직접 손으로 집어내는 방식과 같은 다른 방법에 비해, 실험을 위해 다량의 인간 배아 줄기세포를 분리해야 할 때 이 기술이 특히 유용하다는 것을 발견했습니다. 이 방법은 고밀도 배양물에서 콜로니를 분리하는 데 있어 더 빠르고 효율적입니다.

마우스 배아 섬유아세포는 배아 줄기세포와 공배양하기 전에 분열을 억제하기 위해 mitomycin C로 처리하거나 방사선을 조사해야 합니다. mEF 파종 2시간 전에, 0.05% Gelatin 2 mL를 사용하여 60 mm 플라스마 처리 배양 접시를 각각 코팅하십시오. 처리된 mEF 바이알을 해동한 후 1,500 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고, 젤라틴 코팅 접시에 cm²당 약 20,000개의 세포가 되도록 파종하십시오. 세포가 부착될 수 있도록 하룻밤 동안 배양하십시오. 새로운 배양은 냉동 보존된 세포로부터 시작하거나 기존 배양물을 mEF 코팅 접시로 계승하여 시작할 수 있습니다. 대형 인간 배아 줄기세포 콜로니가 포함된 플레이트로 시작할 때는 가온된 phosphate buffered saline 3 mL로 한 번 세척하십시오.

1 mg/mL 농도의 collagenase four 용액 3 mL를 첨가하고, 37 °C에서 5~10분 동안 배양합니다. 이때 세포는 trypsin을 사용했을 때처럼 뚜렷하게 분리되거나 뭉치지 않습니다. 5 mL 피펫 팁의 끝부분을 사용하여 콜로니에 격자무늬를 만들어 작은 세포 덩어리로 분쇄합니다.

이제 피펫 팁의 끝을 배양 플레이트에 수직으로 세운 상태에서, 배양 플레이트 바닥을 긁어 표면의 모든 세포를 떼어냅니다. 세포를 수확하기 위해 팔콘 튜브로 옮긴 후 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리하고 배지를 흡입하여 제거합니다. 다음으로, 전날 플레이팅한 마우스 배아 섬유아세포에서 배지를 흡입하여 제거합니다.

그 다음, 원래 플레이트에서 1:3 비율로 인간 배아 줄기 세포를 분주하고 3 mL의 인간 배아 줄기 세포 배지로 배양합니다. 인간 HECS를 10~14일 동안 고밀도로 배양합니다. 흡입 피펫의 팁을 플레이트 가장자리에 놓고 흡입력을 이용해 meth 시트의 가장자리를 조심스럽게 들어 올립니다.

디쉬에서 배지를 제거합니다. 팁이 세포 시트를 잡을 수 있게 한 다음, 플레이트 위에서 팁을 완만한 호 모양으로 천천히 움직입니다. 시트가 피펫을 심하게 막는 경우, 배양물에서 시트를 제거하십시오.

흡입기로 배양 접시의 윗부분을 가볍게 두드려 세포 분리를 완료하고, 완전히 흡입하여 세포를 제거합니다. 즉시 인간 배아줄기세포 배지를 교체하고, 배양 접시에 파종한 후 배양기를 사용하여 배양합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 마우스 배아 섬유아세포로 둘러싸인 고밀도의 인간 배아줄기세포 콜로니가 형성됩니다.

흡입 기술은 MES를 제거하여 교란되지 않은 작은 인간 배아줄기세포 콜로니를 생성합니다. 온전한 콜로니 주변에 MES가 거의 남아 있지 않기 때문에, 배아줄기세포 콜로니는 매우 큰 콜로니로 상당히 확장될 수 있습니다. 예를 들어, meth 고갈 직후에 나타난 이 인간 배아줄기세포 콜로니는 meth 처리 후 최대 10일까지의 콜로니 면역형광 식별 결과에서 보듯 매우 큰 콜로니로 확장되었습니다.

결핍 상태에서도 콜로니가 다능성 마커의 발현을 유지하며 중배엽 운명으로의 분화를 나타내지 않음이 확인되었습니다. 이 투과광 이미지들은 서로 다른 배율에서 면역 형광 염색된 콜로니의 형태를 보여줍니다. DAPI는 세포의 핵을 염색합니다.

중요한 점은, 인간 배아 줄기세포가 인간 줄기세포 마커인 SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81을 발현한다는 것입니다. 이미지는 전형적인 매끄러운 경계를 나타내는 콜로니를 보여줍니다. 이들은 중배엽 분화의 초기 마커인 FLK-1을 발현하지 않으며, DDR2 염색의 부재에서 알 수 있듯이 섬유아세포를 포함하지 않습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 배양 기술을 이용해 천연 환경을 조절함으로써 인간 줄기세포 콜로니를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련된 후에는 이 과정을 수초 내에 완료할 수 있습니다. 또한, 배지와 불순물 층을 제거할 때 배양물이 건조해지지 않도록 주의하십시오.