쥐의 장간막의 Exteriorization : Angiogenesis에 관련된 세포 역학을 조사하기위한 모델

본 실험의 목적은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하는 과정으로 정의되는 혈관신생(angiogenesis)에 관여하는 세포의 공간적 및 시간적 역동성을 확인하는 것입니다. 단순하고 재현 가능한 모델을 사용하여, 먼저 쥐의 장간막을 잠시 외부에 노출시켜 혈관신생을 자극하고, 자극 후 서로 다른 시점에서 장간막 조직을 수집합니다. 그 다음, 조직 절편을 면역 표지합니다.

예를 들어, 혈관 내피 세포 마커를 사용하여 조직 내 리모델링되는 전체 혈관계를 시각화하고, 성장하는 미세혈관 네트워크의 필수적인 2차원 시각화 영상을 생성하십시오. 이 모델은 비교적 짧은 전체 시간 경과 동안 여러 혈관 형성 지표가 급격히 증가한다는 점에서 매우 유용합니다. 단일 세포 수준에서 네트워크를 시각화하고 이러한 지표를 다세포 라벨링과 상관 분석하는 것은 모세혈관 발아와 관련된 새로운 세포 표현형을 식별하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다.

이 방법은 미세혈관 네트워크 성장과 관련된 세포 역학에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 모세혈관 발아 과정 중 특정 세포들이 언제 어디에 존재하는지에 대한 내용이 포함됩니다. 이 방법의 주요 장점은 간단하고 최소한의 외과적 개입만을 필요로 하며, 상대적으로 짧은 기간 내에 강력한 혈관 형성 반응을 유도한다는 점입니다.

또한, 단일 세포 수준까지 온전한 네트워크 관찰이 가능한 조직인 랩 장간막의 장점을 활용합니다. 저희의 경험상, 이 방법은 습득하기 매우 쉽고 따라서 연구자 간의 재현성 또한 높으며, 이를 통해 절차를 시연하겠습니다. 오늘은 저희 실험실의 대학원생인 Peter Stapler가 동반 텍스트에 상세히 설명된 대로 수술 준비를 진행하겠습니다.

쥐의 복부 영역을 제모한 후, 체온 유지를 위해 마취된 쥐를 가열 패드 위에 배가 위로 향하도록 놓습니다. 70% Isopropyl alcohol과 요오드가 적셔진 멸균 거즈로 복부 영역을 번갈아 닦아 세척하고, 흉골에서 약 1인치 아래 지점에서 피부와 백선을 따라 작은 종절개를 가합니다. 미리 절개된 드레이프를 복부 위에 올려 개구부가 절개 부위와 일치하도록 배치합니다. 절개 부위 주변을 부드럽게 압박하여 소장을 노출시킵니다. 면봉을 사용하여 소장의 일부를 조심스럽게 끌어내어 멸균 식염수가 담긴 플라스틱 스테이지 위에 장간막이 놓이도록 배치하고 회장을 찾습니다.

소장을 공급하는 동맥-정맥 쌍 사이의 얇고 투명한 막인 혈관화된 장간막 창(mesenteric windows)을 6~8개 확인합니다. 외부 노출 시작 시간을 기록하고 20분 타이머를 설정합니다. 멸균된 7-0 봉합사를 사용하여 장 근처의 지방 부위에 중앙에 위치한 두 개의 장간막 창을 표시합니다.

조직이 계속 잠겨 있고 촉촉한 상태를 유지할 수 있도록 멸균된 5 mL 주사기를 사용하여 페트리 접시의 식염수를 간헐적으로 보충합니다. 외재 시간이 지나면 장간막을 복강 내로 다시 되돌립니다. 복근을 5-0 단필라멘트 봉합사로 단순 결절 봉합법을 사용하여 봉합합니다.

그 후 4-0 단사 봉합사를 사용하여 단속 봉합 방식으로 피부를 폐쇄하고, 70% isopropyl alcohol과 요오드가 적셔진 멸균 거즈를 교대로 사용하여 봉합 부위를 닦아낸 뒤, 쥐의 양측 눈에 윤활 젤을 도포하고 회복을 위해 케이지로 돌려보냅니다. 자극 후 지정된 날짜에 기관 지침에 따라 쥐를 마취하고 안락사시킵니다. 그다음 복강을 다시 열고 복부 영역을 플라스틱 랩으로 덮습니다. 이제 소장을 부드럽게 끌어내고 핀셋과 미세 가위를 사용하여 표시된 두 개의 창(window) 위치를 찾습니다.

외부로 노출된 각 장간막 창(mesenteric window)을 지방 경계부를 포함하여 절제합니다. 창의 지방 경계부 내에 있는 동정맥 쌍을 절단하지 않도록 주의하여 창 내부에 혈액이 채워지는 것을 최소화하십시오. 또한, 장 내용물이 유출되지 않도록 장 절단을 최소화하십시오.

창(window)을 접촉시킨 직후 각 창을 PBS에 즉시 담급니다. 그다음 포셉을 사용하여 조직을 양전하 처리된 현미경 슬라이드 위에 펼쳐 고정합니다. 슬라이드 한 장당 두 개의 조직을 마운트합니다. 조직이 부분적으로 건조되면 메스 날을 사용하여 과도한 지방을 제거합니다.

샘플을 냉동고에 넣어 -20 °C에서 30분 동안 메탄올로 고정합니다. 슬라이드를 진공 건조하여 과잉 완충 용액을 제거합니다. 또한, 항체 용액이 조직 밖으로 무분별하게 흘러나가는 것을 방지하기 위해 왁스 펜으로 조직의 외곽선을 그립니다.

이제 희석된 1차 항체 용액 약 200 µL를 떨어뜨려 조직 전체를 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 0.1% sapin이 포함된 PBS로 조직을 세 번 세척합니다. 다음으로, strep adin peroxidase 2차 항체 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양한 뒤, 세 번 세척하고 샘플을 vector nova red에서 15분 동안 배양합니다.

슬라이드 마운팅을 위해 물로 헹굽니다. 95% ethanol에 10회 담근 후, 순차적인 탈수 단계를 거칩니다. 슬라이드를 건조시킨 후 조직에 얇은 층의 봉입제를 도포하고, 진공 건조 및 마킹 후 커버슬립을 덮습니다.

슬라이드를 준비합니다. 희석된 1차 항체 용액으로 조직 샘플을 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

0.1% saponin이 포함된 PBS로 10분씩 세 번 세척하십시오. 그다음 2차 항체를 첨가하고 1시간 동안 배양하십시오. 0.1% Saponin이 포함된 PBS로 세척을 수행한 후, glycerol이 포함된 PBS로 슬라이드를 마운팅하고 매니큐어로 밀봉하십시오.

여기에서는 일반적인 페트리 접시를 수술대로 사용하기 위해 개조하는 방법을 상세히 설명합니다. 미리 뚫어 놓은 구멍을 통해 장간막을 끌어올릴 때 매끄러운 표면을 제공하기 위해 노란색 모델링 점토를 사용하였습니다. 다시 한번 설명하자면, 외부 노출 기간 동안 수술대 위에 표시된 장간막 윈도우는 이곳의 장에 영양을 공급하는 동맥-정맥 쌍 사이의 얇고 반투명한 막으로 정의됩니다.

PCAM 라벨링을 통해 외부화 후 특정 시점의 리모델링 미세혈관 네트워크 계층 구조에 따른 모든 혈관 유형을 식별할 수 있습니다. 이러한 이미지는 자극 후 특정 시점의 혈관 형성 지표를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.

PCAM 라벨링을 통해 동맥과 정맥을 구분할 수 있습니다. 공급 동맥은 일반적으로 짝을 이루는 정맥에 비해 직경이 더 작고 내피세포의 형태가 길쭉하다는 점에 유의하십시오. 리모델링 네트워크의 전형적인 특성에는 혈관화 영역, 모세혈관 발아 및 혈관 밀도가 포함됩니다.

이러한 다양한 혈관 형성 지표들을 정량화하면 네트워크 성장 과정을 특성화할 수 있습니다. 기존 혈관에서의 모세혈관 발아는 3일에서 5일 사이에 정점에 도달하며, 10일째에는 자극 전 수준으로 돌아옵니다. 본 실험실의 결과에 따르면, 이러한 일시적인 발아 증가는 이후 혈관화된 면적과 혈관 밀도의 증가로 이어집니다.

이 모델 시스템은 리모델링 과정의 특정 시점에서 새로운 세포 표현형 변화를 식별하는 데 사용되어 왔습니다. 면역형광 PCA 라벨링은 혈관 내피세포를 적색으로 염색하며, class three beta tubulin 라벨링은 혈관 형성 혈관을 따라 분포하는 신경과 기생충을 녹색으로 염색합니다. 흥미롭게도, 자극되지 않은 조직에서 class three beta tubulin 발현은 신경 특이적입니다.

이와 대조적으로, 모세혈관 발아(capillary sprouting)의 정점 동안에는 혈관 주변 세포에서 class three beta tubulin이 발현됩니다. 이러한 결과는 혈관 형성 과정에 관여하는 새로운 세포 유형을 식별하는 데 있어 이 간단하고 견고한 혈관 형성 모델의 유용성을 강조합니다. 10일째가 되면 class three beta tubulin의 발현 패턴은 자극 전의 상태로 돌아가기 시작합니다.

이 모델은 세포 계보 연구에도 잠재적으로 활용될 수 있습니다. 전표지된 골수 세포 또는 중간엽 줄기세포를 20분간의 외부 노출 기간 동안 장간막 창(mesenteric windows) 위에 투여한 예비 연구들을 통해, 리모델링 중인 장간막 조직으로의 세포 통합 가능성이 입증되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 미세혈관 네트워크 성장에 관여하는 세포 역학을 조사하기 위해 쥐 장간막 내면화 모델을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 간단한 기술은 약 45분에서 1시간 내에 수행할 수 있습니다. 수술 절차 후에는 장간막을 섬세하게 다루고 혈관에 구멍이 나지 않도록 주의하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억하십시오. 혈관을 따라 여러 세포 유형을 식별하기 위해 면역 표지를 수행할 수 있습니다.

림프관과 신경에 대해서도 라벨링을 할 수 있습니다. 이를 통해 혈관 신생과 관련된 세포의 표현형 변화뿐만 아니라, 혈관 신생, 신경 생성 및 림프관 신생 사이의 상호 조절 작용을 조사할 수 있습니다.