Name: 성장 곡선 및 플레이트 카운트하여 양자 점 및 세균성 독성 Assays의 Solubilization 및 바이오 활용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 배우세요 항생제 결합 CdTe 양자점의 용해도 및 광활성화를 통한 항균 효과 평가 방법입니다. 이 기법은 나노입자 기반 신규 항균제 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 NSERC 개인 디스커버리 프로그램 NSERC / CIHR 공동 건강 연구 프로그램 (CHRP) 및 NSE​​RC CREATE 캐나다 생물학 교육 프로그램 (CATP)에 의해 재정 지원되었다.

1. QD의 Solubilization 이것은 CdTe에 적합한 방법입니다. 비슷한 방법 등 InP / ZnS 20 CdSe / ZnS 21 등 QDs 다른 유형과 함께 사용할 수 있습니다. <ol><li> 15 μm의 (첫 번째 exciton 피크에서 광학 밀도 = 2.5)에서 톨루엔의 CdTe QDs의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 유리관에이 주식 200 μL를 전송합니다. 플라스틱을 사용하지 마십시오! </li><li> 800 μL 톨루엔, 200 밀리미터 borate 버퍼 (산도 9) 1 ML과 11.5 M mercaptopropionic 산성 (MPA) 2 μL를 추가합니다. </li><li> 병을 모자 30~60초을 위해 적극적으로 잡고 흔들어. </li><li> 수성 및 유기 - 용매 단계는 자발적으로 분리됩니다. 수성 단계 QDs의 색상이 될 것입니다. 톨루엔 층을 방지하려면 그것을 제거하고 그것을 버리고. 그런 다음 깨끗한 유리병에 수성 단계를 전송합니다. </li><li> 500 μL, 10000 분자량의 컷오프 원심 분리기 필터를 사용하여 네 번 세척 / 필터링하여 solubilized QDs를 정화. 필터는 있어야13분위한 3,000 XG에 불러 냈어요. 최소한 지난 두 세차장 들어, 원하는 최종 버퍼로 씻는다. </li><li> 최종 세척 후, 4 ° C.에 원하는 산도와 가게에서 50 밀리미터 borate 버퍼에서 한물간 QDs을 정지 그들은 1-2 주 동안 안정 될 것입니다. </li><li> 출판 수식 22을 기반으로 농도를 추정하는 흡광도와 발광 스펙트럼을 측정합니다. </li></ol> 대표 결과 : 그림 1은 자외선 램프 조명 아래 CdTe QDs의 이미지를 보여주고, 물의 solubilization 전후 방출 스펙트럼은 캡 교류에서 무시할 변화를 보여주고 있습니다. 크기 값은 전자 현미경으로 측정 코어 직경입니다. 2. 항생제에 대한 QD 활용 프로토콜의이 부분은 ​​대부분의 상용 QDs, 금속 입자 등 19를 포함한 어떠한 부정 - 충전 물 solubilized nanoparticle에 적용됩니다. <ol><li> 모든 분자가 작동 것이다 eith응급실에 부정 - 충전 solubilized QDs에 자기 조립, 또는 그것과 같은 차 아민으로서 복합 될 수 있습니다 반응성 그룹을 가지고 있습니다. 이 예제에서 우리는 긍정적으로 충전과 활용의 시약을위한 필요없이 자체 - 조립되어 polymyxin B (PMB)를 사용하고 있습니다. 60 μm의에서 H 2 O에서 PMB를 해산. (선택된 항생제는 H 2 O를 용해없는 경우 0.1-1 mm의 농도로 DMSO 또는 에탄올에 용해). 이것은 10X 솔루션 (H 2 O) 또는 100x 용액 (용매)을 것입니다. </li><li> 당신은 세균성 독성 실험에 필요한 어느 정도 QD 솔루션을 계산합니다. 0.3 ML 당 잘 quadruplicates에있는 96 - 웰 플레이트의 경우, 200 나노미터 켤레축 0.5 ML이 필요합니다. 50 MM borate 버퍼 1 μm의 양자 도트의 100 μL 담긴 두개의 튜브를 준비합니다. </li><li> 일차 아민에 결합하면 19 밀리그램 / ML (100 ㎜) 1 - 에틸 -3 - [3 - 디메틸]의 솔루션은 H 2 O에 관련 carbodiimide 하이드로 클로라이드 (EDC)를 준비 솔루션 EDC는 안정되지 않습니다, 즉시 사용하고 나머지는 버린다. </li><li> 10X 항생제 용액 (H 2 O) 또는 켤레축 튜브로 100x 용액 (용매에서) 5 μL의 50 μL를 추가합니다. PMB의 경우 : 30:1의 어금니 비율 CdTe 활용은, 60 μm의 제품 PMB 50 μL를 추가합니다. H 2 O 또는 QD 전용 제어 튜브에 솔벤트를 추가합니다. </li><li> 필요한 경우 켤레축 튜브에 EDC 주식 용액 1 μL를 추가합니다. </li><li> 적절한 버퍼 (; 같은 트리스 등 노 아민 함유 버퍼, 그들은 EDC를 억제하므로 borate 버퍼 또는 PBS)로 0.5 ML에 켤레축 볼륨을 가져와. </li><li> 1 시간을위한 nutator 또는 로커에 알루미늄 호일, 장소와 빛과 실드 튜브. 집계가 발생하면 항생제의 낮은 농도와 결합을 반복합니다. 입자가 집계하지 때까지 농도 위쪽 적정하다. </li><li> 적절한 필터를 통과하여 conjugates 씻으십시오. 10,000 분자량의 컷오프 대부분의 항생제에 대한 아니지만 단백질이나 항체에 적용됩니다. </li&gt; <li> 흡광도 또는 형광 분광법, 겔 전기 영동, 또는 푸리에 변환 적외선 분광 (FTIR) : 분자에 따라 다른 방법 QD 당 항생제 분자의 개수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과가 있습니다.이 예제에서는 PMB의 활용은 QD 발광 스펙트럼의 변화에 의해 특징입니다. 그림 2는 PMB 더불어 함께 CdTe QDs의 스펙트럼을 보여줍니다. 3. 96 - 웰 화면에 대한 박테리아의 준비, 항생제 IC에서 50 결정 이것은 적절한 매체를 18 년 재배 거의 모든 박테리아 변종에 적용됩니다. 녹음을 계속해야 시간의 정확한 길이는 세균의 성장 속도에 따라 달라집니다. 우리 예제에서, 우리는 lysogeny 스프 (LB) 배지에서 자란 대장균을 사용합니다. <ol><li> 적절한 QD 켤레축의 농도를 선택하기 위해서는 그것을 아는 것이 중요항생제의 IC 50 혼자 QDs가 독성이있는 경우 복합하게합니다. 이것은 2 일 활용 실험 전에 시작되어야한다. 저녁에는 신선한 식민지에서 세균 성장​​ 매체의 씨앗 10 ML은 올바른 살균 및 biosafety 기법을 사용합니다. </li><li> 다음날, 1-2 시간 실험을하기 전에, 성장 매체의 거의-최대한의 금액과 맑은 하단 96 - 웰 플레이트의 우물을 각각 입력합니다. 세균성 문화의 1-50 μL (농도가 특정 변형이 성장 얼마나 빨리 의존하게되며 귀하의 실험실에서 보정해야합니다)와 각각 잘 멀티채널 피펫, 씨앗을 사용합니다. </li><li> 플레이트 판독기에 접시를 넣고 결정 파장 (보통 600 nm의)에서 2 시간 10 분 간격을 읽어 그것을 설정합니다. 박테리아가 너무 빨리 너무 조밀한 성장하지 않도록 접시를 모니터링합니다. </li><li> 세포가 모든 OD = 0.1-0.15에 도달하면 플레이트 리더에서 접시를 제거하고 녹음을 중지합니다. </li><li> 혼자 약물을 추가하고 홀로 QDs적어도 triplicates 서로 다른 농도. &quot;어둠&quot;의 제어 및 조명되어야 할 하나의 절반 접시의 한쪽을 사용합니다. 제안된 레이아웃은 그림 3에 있습니다. 농도 한 아주 작은 박테리아를 억제 농도, 그리고 그들을 모두 죽이고 하나를 포함하는 광범위한 충분한 범위에 걸쳐해야합니다. </li><li> 알루미늄 호일로 접시의 &quot;어둠&quot;의 측면을 보호. 원하는 파장의 램프에 반대쪽을 쉽게받을 수 있습니다. 우리는 2.4 MW 개의 LED (그림 4)와 30-60 분 비추다 만든 사용자 지정 96 자, ​​440 nm의 램프를 사용합니다. 맑은 하의와 검정색 접시는 길 잃은 빛으로부터 unexposed 박테리아를 보호하는 데 도움이됩니다. 빈 컬럼도 노출 및 취소 노출된 양쪽간에 사용할 수 있습니다. </li><li> 빛의 노출 후 플레이트 리더와 기록 OD 600 성장률에 따라 5-12시간를위한 10 분 간격으로 접시를 넣어. 보관 온도 &lt;32 ° C의 문화 건조 회피 할수있다면.에게 </li><li> 성장 곡선을 그리기선택한 시점에서 대 로그 [농도]와 힐 방정식을 사용하는 항생제의 IC 50 결정 : </li></ol><img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> H가 힐 계수이고, y를 최대 성장 (이상 고원에있는)의 가장 높은 지점이며, Y 분 고원에서도 이상적으로, 제로 지점입니다. 그것은 혼자 QDs 사용한 농도에서 세포 독성 정도 표시되지 않을 것이므로 값이 결정되지 않습니다. 대표 결과입니다. 녹음 기간 끝에, 맑은 우물이 완료 세포 죽음을 나타내는 것이고, 세포 밀도 구배는 약물의 농도를 증가를 따라 나타납니다. 박테리아는 S 자형 성장 곡선 (그림 5) 표시한다; 최대 고원의 위치는 변형하기 변형에서 매우 다양하며 온도에 따라 달라집니다 것입니다. 주어진 시점이 될 수 있습니다대표로 선택하고 값을 꾸몄다 대 로그 [항생제] IC에서 50 (그림 5 B에게) 주다. QD 독성을 평가하기 위해, 생존 대 로그 [QD]도 꾸몄다하지만, 혼자 QDs과 상당한 세균 살인을 달성하면 (그림 5 C) 드문 경우가 있습니다. 4. 항생제 / QDs와 96 - 웰 화면에 대한 박테리아의 작성 <ol><li> 실험, 적절한 풍부한 매체로 새로운 식민지에서 문화의 씨앗 10 ML은 올바른 살균 및 biosafety 기법을 사용하기 전에 일. 그것이 매우 불안정하지 않는 QD-항생제 켤레축는이 날에 대비해야합니다. </li><li> 실험 전에 1~2시간은 성장 매체의 거의-최대한의 금액과 맑은 하단 96 - 웰 플레이트의 우물을 각각 입력합니다. 세균성 문화의 1-50 μL와 각각 잘 멀티채널 피펫, 씨앗을 사용합니다. </li><li> 플레이트 판독기에 접시를 넣고 부 3과 같은 파장에서 2 시간 10 분 간격을 읽어 그것을 설정합니다.</li><li> 세포가 모든 OD = 0.1-0.15에 도달하면 플레이트 리더에서 접시를 제거하고 녹음을 중지합니다. </li><li> 적어도 사통으로 작성된 서로 다른 농도에서 QD conjugates를 추가합니다. &quot;어둠&quot;의 제어 및 조명되어야 할 하나의 절반 접시의 한쪽을 사용합니다. 제안된 레이아웃은 그림 6에 있습니다. 박테리아는 전용 제어 스트립은 항상 문화, 온도와 케이스의 문제에 포함되어야하는 등 성장 조건에 영향을 미칩니다. 단일 전용 약물의 스트립에만 QD는 또한 이전에 완료 제어 판과 일치하도록 포함되어야합니다. 우물의 나머지 부분은 좋은 통계를 허용하기 위해 conjugates을 다하고 있습니다. </li><li> 알루미늄 호일로 접시의 &quot;어둠&quot;의 측면을 보호. 원하는 파장의 램프에 반대쪽을 쉽게받을 수 있습니다. </li><li> 빛의 노출 후 플레이트 리더와 기록 OD 600 5~12시간를위한 10 분 간격으로 접시를 넣어. &lt;32 ° C 가능하면 박사를 피하기 위해 온도를 유지문화 잉. </li></ol> 대표 결과입니다. QDs과 항생제의 조합은 혼자 항생제보다 독성이있을 수 있으며, 마찬가지로 독성, 이상 독성. 이것은 성장 곡선과 IC 50 측정을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 그림 7 그 항생제로서 동등하게 독성 혼자, 그리고 더 많은 독성 conjugates의 예를 conjugates의 예를 보여줍니다. 5. 플레이트 카운트 <ol><li> 시리얼 dilutions과 식민지의 계산에 사용되는 치료를 9​​6 - 웰 플레이트 중 하나 이상 우물을 선택합니다. </li><li> PBS 또는 생리 식염수 (0.9 % NaCl)로 선택된 세균 샘플은 각각의 시리얼 희석하십시오. 세균 용액 20 μL를 전송 180 μL 생리 식염수로 희석, 피펫 팁, 믹스를 변경 180 μL 생리 식염수로 희석 세균성 해결책 20 μL를 전송합니다. 6 회 반복합니다. </li><li> 적절한에 각 희석 및 플레이트에서 10 μL을 가지고<html> 고체 미디어 플레이트. 그것이 물건을 살해하는 것이 더 쉽습니다로서 직사각형 요리가 선호되고 있지만 한 샘플의 모든 8 농도는 10cm 원형 배양 접시에 도금 수 있습니다. </li><li> 벌써 15 분 벤치에 말리면. 다음 16시간 동안 세균에 적합한 온도로 품어. </li><li> 에 (# 콜로니의 X 희석 계수) / 볼륨 도금 = CFU / ML. 따라 식민지 백작과 콜로니 형성 단위 (CFU)를 계산 </li></ol> 그림 8은 예제 CFU 플레이트를 보여줍니다. 6. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> 그림 1. CdTe의 QDs. () CdTe QDs의 여덟 준비는 자외선 지팡이 (365 nm의)와 조명. 물 solubilization 전과 후 5 선택한 크기의 (B) 흡광도와 방출 스펙트럼. 점선 라인이 톨루엔의 스펙트럼이며, 고체 라인은 물에있다. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. QD-PMB conjugates의 스펙트럼과 겔 분석. 오렌지 발광 CdTe의 QDs이 예제에 사용되었다; QDs 다른 종류의 효과가 각 실험에 대해 평가해야합니다. () 전형적인 흡광도 (회색 라인) 및 PMB의 활용 및 PMB 160 어금니 등가물의 추가 후 방출 (점선) 이전 QDs의 방출 스펙트럼 (블랙 라인). PMB의 비율과 QD 방출 강도 (사각형)과 피크 파장 위치 (삼각 관계) 사이 (B) 관계. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> 그림 3. 제어 성장 접시 플레이트 레이아웃을 제안했습니다. PMB와 QD 농도의 넓은 범위가 표시됩니다. 판 중 하나는 절반 (파란색 강조 표시) 반구되고, 동일한 절반 빛으로부터 보호됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>큰 그림을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> 그림 4. 균일한 플레이트 조사하기위한 사용자 지정 96 LED 램프, 외관을 자랑 되겠지요. 일반적인 휴대용 자외선 램프도 사용할 수 있지만 균일하게 전체를 커버 플레이트하지 않습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> 그림 5. 제어 성장 플레이트에 대한 예제 결과입니다. () 다른 약물 농도와 대표 세균 성장​​ 곡선은 0에서 세포 죽음을 완료합니다. 농도가 주어로 열린 기호 PMB에만이므로 단단한 기호 조사없이 CdTe-PMB가, 그리고 절반 채워진 기호 조사와 CdTe-PMB입니다. 조사는 PMB 전용 샘플에 아무런 영향을 미치지 않았다, 이러한 곡선은 명확성을 위해 생략되었다 그래서. QD 비율 : 모든 PMB-CdTe conjugates는 30:1 PMB입니다. (B) 200 분 대 로그 [PMB]의 성장 곡선 값의 음모하고 EQ로 맞출 수 있습니다. (1). cont하기빛의 효과를위한 rol은 곡선은 빛의 노출 30 분과 항생제와 함께 이루어집니다. CdTe QDs를 사용하여 200 분 대 QD 농도,시 (C) 세균의 생존. 일부 독성은 IC 50 값을 결정하는 빛의 노출,하지만 너무 작은과 함께 볼 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> 그림 6. 켤레축 테스트 플레이트에 대한 레이아웃을 제안했습니다. 접시의 파란색 강조 절반 빛에 노출되어야하고, unhighlighted 절반 보호를받습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> 그림 7. 예를 켤레축 테스트 플레이트에 대한 검색 결과. 200 분의 성장 곡선 값은 PL 있었다otted와 EQ에 적합. (1). () CdTe-PMB의 conjugates 혼자 PMB를 통해 독성을 증가 보여줍니다. (B) 골드 nanoparticle AU-PMB의 conjugates 혼자 PMB 아무런 독성 증가를 보여 없습니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> 그림 8. CFU 플레이트의 예. E. 96 - 웰 플레이트에 놓는 대장균은 30 분 조사와 함께 또는없이 QD-PMB로 치료되었다. 다음 4 시간 동안 32 ° C에서 incubated. 각 세균 시료의 시리얼 dilutions은 생리 식염수와 10 7 X의 dilutions ~ 100 X 10 μL로 만들어진이 한천 조각 위에 도금되었다. 플레이트는 37 ° C와 식민지 16 시간 후에 집계되었다 incubated되었다. 플레이트는 지시와 같은 행을 따라 dilutions를 표시, 컬럼은 다음과 같습니다 (A) 0.06 μm의 PMB + 2 NM CdTe, (B) 0.12 μm의 제품 PMB + 4 nm의 CdTe (C) 0.2 μm의 PMB + 6.7 nm의 CdTe, (D) 0.06 μm의 PMB + 2 NM은 반구 (E) 0.12 μm의 PMB + 4 NM CdTe 반구, (F) 0.2 μm의 PMB + 6.7 nm의 CdTe irra를 CdTediated.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Nanoparticles은 새로운 안티 미생물 대리인의 창조에 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 성장 곡선 분석은 성장 저해 세포에서 적극적으로 재배 세포를 구별 세균 세포 밀도를 모니터링하는 방법입니다. 플레이트 카운트와 결합하면 켤레축의 항생제 가능성에 대한 철저한 분석을 위해 수 있습니다. 96 - 웰 형식은 가벼운 노출과 같은 농도의 상대적으로 높은 처리량 변화 및 ​​기타 조건을 허용하고, 후자는 양자 도트와 같은 가벼운 활성 요원들의 중요합니다. 이 기본 접근 방식에 많은 변화가 nanotoxicology을위한 다용도의 방법을 만드는 가능합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 버퍼 구성 요소에게 # 1 Borate </td><td> 어부 </td><td> 붕산 - 74-1 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼 구성 요소 # 2 Borate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 나트륨 테트라 보 레이트 B9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA는 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-9322 </td><td> 가능한 다양한 MWCO </td></tr><tr><td> 유리 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxin B </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> 세균성 GRowth 매체 (LB) 구성 요소 # 1 </td><td> 어부 </td><td> NaCl S271 </td><td></td></tr><tr><td> 세균성 성장 매체 (LB) 구성 요소 # 2 </td><td> BD </td><td> Tryptone 211,705 </td><td></td></tr><tr><td> 세균성 성장 매체 (LB)는 구성 요소 # 3 </td><td> BD </td><td> 효모 엑기스 211,929 </td><td></td></tr><tr><td> 빛의 노출을위한 램프 </td><td> 사용자 정의 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 삭제 - 하단 96 - 웰 플레이트 </td><td> 어부 </td><td> 07-200-567 또는 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 분광계 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 흡광도 플레이트 리더 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 고체 미디어 BactoAgar </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시는 높이 들어라 </td><td> 어부 </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> 직사각형 배양 접시 </td><td> 어부 </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

성장 곡선 및 플레이트 카운트하여 양자 점 및 세균성 독성 assays의 solubilization 및 바이오 활용

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

양자 점 (QDs)은 파장의 폭넓은 선택에 의해 흥분하게 크기에 의존 방출 스펙트럼과 형광 반도체 nanoparticles입니다. QDs는 이미징, 진단 및 그들의 밝고 안정된 형광 1,2 3,4,5으로 인해 치료에 대해 많은 관심을 받고있다. QDs는 박테리아와 포유 동물 세포를 6으로 바인딩을위한 생체 활성 분자의 다양한 복합 될 수 있습니다. QDs도 널리 박테리아 타겟으로 살인에 대한 세포 독성 대리인으로 조사되고있다. 번식 방지 박테리아 변종의 출현은 급속히 특히 그람 음성 병원균 7의 경우, 공중 보건의 위기가되고있다. 때문에 특히 특정 nanomaterials, AG의 잘 알려진 항균 효과, 세균 8 nanoparticles의 독성을 조사 연구 수백가 없습니다. 박테리아 연구 espec뿐만 반도체 nanoparticles 다른 유형으로 수행되었습니다ially 티오이 9,10-11뿐만 아니라, ZnO 12 CuO 13를 포함하여 다른 사람. 박테리아 변종의 일부 비교는 주로 그람 양성과 그람 부정적인 변형을 비교,이 연구에서 수행되었습니다. 입자 또는 산화 독성을 일으킬 수 금속 이온의 직접적인 릴리스에 의한 반응성 산소 종의 photogeneration (ROS) 중 이러한 입자 모두 함께 독성의 메커니즘은 산화에 기인한다. 비록 이러한 자료와 함께, 다른 연구 결과는 크게 다릅니다. 일부 연구에서 그람 양성 시험 변형율은 그람 음성 10 개 보도에 더 민감, 다른 사람에 그것은 반대로 14입니다. 이러한 연구가 잘 15 검토되었습니다. 모든 nanoparticle 연구에서는 입자 성분, 크기, 표면 화학, 샘플 노화 / 고장과 파장, 전력, 가벼운 노출의 기간은 모두 극적으로 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, synthesi에게 있음님의 부산물 및 용제는 16 17로 간주되어야합니다. 하이 스루풋 스크리닝 기술은 효과적인 새로운 nanomedicine 에이전트를 개발 할 수있는 능력이 필요합니다. CdTe의 QDs는 안티 미생물의 효과가 혼자 18 항생제와 함께 있습니다. 이전 연구에서 우리는 CdTe 위해 항생제의 커플링 것은 19 conjugates에서 반응성 산소 종의 감소 생산으로 인해, 박테리아에 독성을 증가하지만, 포유 동물 세포에 독성을 줄일 수있는 것으로 나타났다. 그것이 카드뮴 함유 화합물은 인체에 사용하기 위해 승인되지 않을 수도 있지만, 그러한 준비가 표면이나 물이 살균의 살균에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 mercaptopropionic 산성 (MPA)와 CdTe QDs을 solubilizing에 직접적인 접근 방식을 제공합니다. QDs는 시간 내에 사용할 수 있습니다. 그러면 항균 대리인에게 커플링 보여줍니다. 프로토콜의 두 번째 부분복합 및 unconjugated QDs를 사용하여 96 - 웰 세균 억제 분석을 보여줍니다. 광학 밀도 QD 이외 및 복구 기간이 지나면뿐만 아니라 즉시 평가될 수 있도록 빛의 노출 효과를 허용, 많은 시간 동안 읽을 수 있습니다. 또한 세균의 생존을 quantifying위한 식민지 수를 보여줍니다.

이러한 반도체 양자 점 (QDs)와 같은 Nanoparticles은 안티 미생물이나 안티 암 어플 리케이션을위한 photoactivatable 요원을 만드는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 방법 보여줍 물 solubilize 항생제로 활용하다, 그리고 성장 곡선 및 플레이트 카운트를 기반으로 세균 억제 분석을 수행, 카드뮴 텔라이드에 (CdTe) QDs합니다.

성장 곡선 및 플레이트 카운트하여 양자 점 및 세균성 독성 Assays의 Solubilization 및 바이오 활용

양자점(Quantum dots, QDs)은 크기에 따라 방출 스펙트럼이 달라지는 형광 반도체 나노입자로, 광범위한 파장 선택을 통해 여기시킬 수 있습니다. ...

본 절차의 전반적인 목표는 항생제 결합 여부에 따른 나노입자의 항균 효과를 고처리량 스크리닝하는 것입니다. 여기서는 이를 달성하기 위해 poly mix 및 B가 결합된 카드뮴 텔루라이드 양자점의 항균 효과를 테스트합니다. 양자점은 먼저 me, capto proprionic acid에 용해시킵니다.다음으로, 양자점을 poly mix에 접합시킨 후, 항생제가 도말된 박테리아에 항생제 접합 양자점과 비접합 양자점을 모두 처리합니다. 샘플의 절반은 440 nanometer 청색광으로 30분 동안 조사하며, 이는 양자점이 엑시톤과 활성 산소종을 생성하게 하여 박테리아의 성장 및 생존에 미치는 양자점 처리 효과를 평가하기 위함입니다. 광학 밀도를 측정하고 콜로니 수를 계산합니다. 결과 데이터는 항생제가 접합된 카드뮴 텔루라이드 양자점을 적용한 후 조사를 실시했을 때 테스트한 조건들 중 가장 큰 살균 효과가 나타남을 보여줍니다.이 방법은 카드뮴 텔루라이드 양자점과 polyx in B의 접합이 E coli 성장에 미치는 영향에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한, 다양한 박테리아 균주에 대해 다른 유형의 나노입자와 항생제에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 MPA가 과량 포함되면 양자점이 응집되기 때문이며, 아주 적은 양이라도 toline을 파이펫으로 분주할 경우 필터가 손상될 수 있기 때문입니다.오늘은 항생제가 결합된 KE IDE 양자점의 항균 효과를 평가하는 방법을 시연하겠습니다. 이와 유사한 방법은 인산 인듐, 황산 아연, 그리고 아이오딘화 카드뮴 황산 아연과 같은 다른 유형의 양자점에도 사용할 수 있습니다. 먼저 유리 바이알에 15 µM 농도의 톨루엔 내 텔루라이드 카드뮴 또는 CDTE 양자점 용액을 준비하십시오. 흡광 분광법을 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정한 후, 피펫을 사용하여 이 스톡 용액 200 µL를 유리 바이알로 옮기십시오.플라스틱을 사용하지 마십시오. 그 다음 톨루엔 800 µL, 200 mM 보레이트 완충액 1 mL, 그리고 11.5 M MER 캡토 프로피온산 또는 MPA 2 µL를 추가한 후 바이알의 캡을 닫고 30~60초 동안 강하게 흔들어 줍니다. 흔든 후에는 수성 층과 유기 용매 층이 자연스럽게 분리됩니다.수성층은 퀀텀닷의 색상으로 변하게 됩니다. 층 분리 층을 피하기 위해 이를 제거한 후, 퀀텀닷 층을 제거하여 깨끗한 바이알로 옮깁니다. 가용화된 퀀텀닷을 정제하려면 이를 500 µL 원심분리 필터로 옮기십시오.50 millimolar bore eight buffer 100 microliters를 가하고 3000 times G에서 13분 동안 원심분리합니다. 이 세척 과정을 4회 반복합니다. 마지막 세척 후, 세척된 quantum dot을 500 microliters bore buffer에 현탁하여 4 °C에서 보관합니다.이들은 1~2주 동안 안정적으로 유지됩니다. 양자점의 농도를 추정하기 위해 흡광 및 방출 스펙트럼을 측정합니다. 이 그림은 UV 램프 조명 하의 CDTE 양자점과 수용성화 전후의 방출 스펙트럼을 보여주며, 리간드 교환으로 인한 광학적 특성의 변화가 거의 없음을 나타냅니다.프로토콜의 이 부분은 이끼, 상업용 양자점, 금속 입자 등을 포함하여 음전하를 띠는 모든 수용성 솔라라이즈 나노입자에 적용 가능합니다. 본 예시에서는 항생제 poly mixen B(PMB)를 30:1의 몰비로 양자점에 접합합니다. PMB는 양전하를 띠며 접합 과정 없이도 자체 조립됩니다. 시약은 PMB와 증류수입니다.60 µM 농도로 준비합니다. 웰당 0.3 mL의 박테리아가 들어있는 96웰 플레이트를 4회 반복(quad duplicates)으로 구성할 때, 200 nM 컨쥬게이트 0.5 mL면 충분합니다. 이를 위해 마이크로 원심분리 튜브에 50 mM 보어 완충액(bore buffer)에 희석된 1 µM 퀀텀닷 100 µL를 넣습니다.다음으로, 10 x 또는 60 µM PMB 항생제 수용액 50 µL를 접합 튜브(conjugate tube)에 넣습니다. 대조군 튜브에는 물 50 µL를 넣습니다. 50 mM acetate 버퍼를 사용하여 최종 부피를 0.5 mL로 맞춥니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단한 후, 로테이터에 넣고 1시간 동안 회전시킵니다.응집이 발생하는 경우, 더 낮은 농도의 항생제를 사용하여 접합을 반복하십시오. 입자가 응집되지 않을 때까지 농도를 점진적으로 높여 접합물을 세척하십시오. 대부분의 항생제에는 적합하지만 단백질이나 항체에는 적합하지 않은 10,000 분자량 컷오프 필터에 용액을 부어 여과하십시오.마지막으로, 흡광 또는 형광 분광법, 겔 전기영동 또는 푸리에 변환 적외선 분광법을 통해 퀀텀닷당 항생제 분자 수를 추정하십시오. 이 그림은 PMB 결합 전 퀀텀닷의 전형적인 흡수 및 방출 스펙트럼과 160 몰 당량의 PMB를 첨가한 후의 방출 스펙트럼을 보여줍니다.사각형으로 표시된 PMB와 양자점 방출 강도의 비율 및 삼각형으로 표시된 피크 파장 위치 사이의 관계가 여기에 나타나 있습니다. PMB 농도가 증가함에 따라 QD 방출 강도가 감소하며, 이로 인해 피크 방출 파장의 이동이 발생합니다. 프로토콜의 다음 단계는 접합 실험 이틀 전 저녁에 항생제의 반최대 억제 농도(IC 50)와 양자 독성을 결정하기 위해 수행합니다.신선한 e coli 콜로니를 이용하여 LB 배지 10 milliliters에 접종합니다. 다음 날, 실험 시작 1~2시간 전에 투명한 96 웰 플레이트의 각 웰을 채웁니다. 성장 배지를 사용하여 분석 플레이트를 여기 보이는 것과 같이 배치해야 합니다.샘플은 3반복으로 도말해야 하며, 항생제 농도는 박테리아를 거의 억제하지 않는 농도와 모든 박테리아를 사멸시키는 농도를 포함할 수 있도록 충분히 넓은 범위를 설정해야 합니다. 접합 실험에 사용될 농도의 퀀텀닷이 포함된 모든 웰 또한 3반복으로 포함해야 합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 1~50 µL의 박테리아 배양액을 분주하십시오.농도는 특정 균주의 성장 속도에 따라 달라지며 그에 맞춰 보정해야 합니다. 성장을 모니터링하려면 플레이트를 플레이트 리더기에 넣고 600 nanometers에서 10분 간격으로 2시간 동안 측정하도록 설정하십시오. 모든 세포의 OD가 0.1에서 0.15에 도달하면 플레이트를 플레이트 리더기에서 꺼내고 기록을 중단합니다.다음으로, 양자점(quantum dots)이 포함된 PMB를 해당 웰에 추가하고, 플레이트의 절반을 알루미늄 호일로 3중 차단합니다. 그 후, 2.4 milliwatt LED로 제작된 맞춤형 440 nanometer 램프 아래에 플레이트를 30분 동안 배치하여 플레이트의 조사면을 노출시킵니다. 광노출 후 플레이트를 플레이트 리더기에 넣고, 성장 속도에 따라 5에서 12시간 동안 10분마다 OD 600을 기록합니다. 소프트웨어를 사용하여 배양액의 건조를 방지하기 위해 가능한 한 온도를 32 degrees Celsius 미만으로 유지하십시오.선택한 시점의 성장 곡선을 로그 농도에 대해 도식화하고, 화면에 표시된 Hill 방정식(H는 Hill 계수)을 사용하여 항생제의 IC 50를 결정합니다. Y max는 성장의 최고점이며, Y min은 마찬가지로 가급적 정체기(plateau)에 위치한 제로 포인트입니다. 기록 기간이 끝나면, 투명한 웰은 완전한 세포 사멸을 나타내며, 약물 농도가 증가함에 따라 세포 밀도의 기울기가 나타나야 합니다.박테리아는 여기에 표시된 것과 같은 S자형 성장 곡선을 보여야 합니다. 최대 정체기의 위치는 균주마다 크게 다르며 온도에 따라서도 달라집니다. 특정 시점을 대표 시점으로 선택하고, 해당 값을 항생제 로그 값에 대해 도식화하여 퀀텀 닷을 평가하기 위한 IC 50를 산출할 수 있습니다.양자점 농도의 로그 값 대비 독성 생존율을 그래프로 나타낼 수도 있으나, 사용된 농도에서 양자점만으로 유의미한 박테리아 사멸을 달성하는 경우는 드뭅니다. 양자점과 항생제 각각의 독성이 결정되면, 동일한 프로토콜을 적용하여 항생제의 독성을 결정할 수 있습니다. 결합된 양자점이 표시되어 있습니다.다음은 분석법의 예시 레이아웃입니다. 접합체는 4중 반복(quad duplicate)으로 농도를 높여가며 테스트하며, 박테리아 전용 대조군 스트립, 약물 전용 스트립, 그리고 퀀텀닷 전용 샘플 웰이 포함되어야 합니다. 이후 OD 600 측정값을 사용하여 성장 곡선을 생성하고, 이전과 동일하게 IC50 값을 산출할 수 있습니다.이 그림은 항생제 단독 처리만큼 독성을 나타내는 접합체의 예와 더 높은 독성을 나타내는 접합체의 예를 보여줍니다. 각 조건에 대한 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정하려면, 평판 계수를 수행하기 위해 처리된 96-웰 플레이트에서 하나 이상의 웰을 선택하십시오. 선택한 각 세균 샘플을 생리식염수로 연속 희석하십시오.이를 위해 적절한 컬럼에 생리식염수 180 µL를 피펫으로 분주합니다. 박테리아 용액 20 µL를 옮겨 180 µL의 생리식염수로 희석합니다. 피펫 팁을 교체하고 혼합한 후, 희석된 박테리아 용액 20 µL를 180 µL의 생리식염수로 옮깁니다.이 과정을 6회 반복합니다. 다음으로, 마지막 6개 희석액에서 각각 10 µL씩 취하여 직사각형 어거 플레이트에 스팟 플레이팅합니다. 직사각형 플레이트에는 총 36개의 스팟을 플레이팅할 수 있습니다.플레이트를 벤치 위에서 15분 동안 건조시킨 후, 37°C에서 16시간 동안 배양합니다. 배양 후 콜로니 수를 세어 밀리리터당 콜로니 형성 단위(colony forming units per milliliter)를 결정합니다. 콜로니 수에 희석 배수를 곱하고 도말한 부피로 나누어 처리군이 박테리아 성장에 미치는 영향을 확인합니다.e coli의 세포 밀도는 OD 600에서 측정되었습니다. 여기에는 0부터 완전한 세포 사멸까지 다양한 약물 농도에 따른 대표적인 박테리아 성장 곡선이 나타나 있습니다. 빈 기호는 농도가 표시된 PMB 단독 처리군입니다.채워진 기호는 조사하지 않은 C-D-T-E-P-M-B를 나타내며, 반쯤 채워진 기호는 조사를 수행한 C-D-T-E-P-M-B를 나타냅니다. 조사는 PMB 단독 샘플에 영향을 미치지 않았으므로, 명확한 표시를 위해 해당 곡선들은 생략되었습니다. 여기에는 빛의 영향을 제어하여 IC 50 값을 결정하기 위한 200분 시점의 성장 곡선 값과 log PMB의 관계 그래프 및 해당 방정식에 대한 피팅 결과가 제시되어 있습니다.항생제만을 사용하여 30분 동안 빛에 노출시켜 곡선을 작성하였습니다. 이 도표는 CDTE QD를 사용했을 때, QD 농도에 따른 200분 시점의 박테리아 생존율을 나타냅니다. 빛 노출 시 어느 정도의 독성이 관찰되었으나, IC 50 값을 결정하기에는 너무 미미한 수준이었습니다.이는 접합 실험에 사용된 농도에서 CDTE 단독의 독성이 무시할 수 있는 수준임을 나타내며, 이를 통해 서로 다른 처리가 세포 성장에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다. 200분에서의 성장 곡선 값들을 도식화하고 앞서 제시한 식에 맞춘 결과가 여기와 같습니다. C-D-T-E-P-M-B 접합체는 PMB 단독보다 더 높은 독성을 보였습니다. 이에 비해 금 나노입자 A-U-P-M-B 접합체는 PMB 단독 대비 독성 증가를 보이지 않았으며, 이를 통해 각 처리가 박테리아 생존에 미치는 영향을 결정하였습니다.P-M-B-Q-D-P-M-B 또는 QD 단독으로 처리하고 방사선을 30분 동안 조사하거나 조사하지 않은 상태로 96웰 플레이트에 배양한 E. coli의 콜로니 형성 단위 수를 측정하였으며, 이후 32 °C에서 4시간 동안 배양하였다. 각 박테리아 시료를 식염수로 연속 희석하였으며, 100배에서 10⁷배까지 희석한 용액 10 µL를 agar 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37 °C에서 배양하고 16시간 후에 콜로니 수를 측정하였다.이 예시에서 플레이트의 A열부터 C열까지는 CDTE의 농도를 높여 처리한 박테리아입니다. 조사되지 않은 컨쥬게이트와 D열부터 F열까지는 컨쥬게이트의 농도를 높여 처리한 박테리아입니다. 30분간의 조사와 함께, 행을 따라 희석 배수가 표시되어 있습니다.데이터에 따르면 조사 후의 접합체는 조사하지 않은 접합체에 비해 박테리아 성장에 대해 더 큰 억제 효과를 나타냅니다. ca 시약은 독성이 매우 강하므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑, 실험복 및 고글과 같은 보호 장구를 착용해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 항생제 접합 여부에 따른 나노입자의 항균 효과에 대한 고효율 스크리닝 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 별개의 세트로 염색된 카르복실화 자성 폴리스티렌 미세구를 사용하여 다중화된 정량적 박테리아 검출을 보여줍니다. 이 절차는 비드-박테리아 복합체의 형성, 자기 분리 및 흐름 기반 분석을 포함하여 동일한 반응 웰에서 여러 박테리아를 정확하고 동시에 정량화할 수 있습니다.

Dye-Labeled Magnetic Microspheres를 사용한 Multiplexed Quantitative Bacterial Detection

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

정의된 길이의 포스포로티오에이트 DNA로부터 1가 표적 양자점(mQD)을 준비하기 위한 자세한 지침을 제공합니다. DNA 랩핑은 높은 수율로 이루어지므로 제품은 정제가 필요하지 않습니다. 당사는 SNAP 태그를 사용하여 mQD를 살아있는 세포 이미징 응용 분야에서 세포 표면 수용체로 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다.

생산 및 일가 양자점 타겟팅

생물막 감염은 화학요법에 대한 내성이 높습니다. 단일 분석법으로 생물막의 복잡성을 파악할 수 없습니다. 대신, 보완적인 분석이 필요합니다. 우리는 생존력, 바이오매스 및 생물막 매트릭스에 대한 분석을 결합한 스크리닝 플랫폼(S. aureus를 위해 개발됨)을 제시합니다. 이를 통해 장기적인 화학 요법 효과 평가를 포함한 항생물막 약물 발견을 할 수 있습니다.

천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.

정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

이 원고는 단일 세포 형광 현미경 검사를 사용하여 공동 문화에서 세균 경쟁을 시각화하고 정량화하는 방법을 설명합니다.

단세포 형광 화상 진찰을 사용하여 세균 간 경쟁의 정량화

여기서는 상업적으로 이용 가능한 실시간 ATP 기반 발광 미생물 생존도 분석을 사용하여 예방적 임상 적용을 시뮬레이션하기 위해 항생제 용출 고분자의 항균 효능을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 약물 용출 물질의 종적 활성을 모니터링할 수 있으며 항균 약물 전달 플랫폼을 테스트하는 데 널리 적용할 수 있습니다.

약물 용출 물질의 종방향 항균 활성을 측정하는 새로운 방법

배우세요 항생제 결합 CdTe 양자점의 용해도 및 광활성화를 통한 항균 효과 평가 방법입니다. 이 기법은 나노입자 기반 신규 항균제 개발에 활용됩니다.

성장 곡선 및 플레이트 카운트하여 양자 점 및 세균성 독성 Assays의 Solubilization 및 바이오 활용

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