성장 곡선 및 플레이트 카운트하여 양자 점 및 세균성 독성 Assays의 Solubilization 및 바이오 활용

이 절차의 전반적인 목적은 항생제 접합 여부에 따른 나노입자의 항균 효과를 고속 스크리닝하는 것입니다. 여기서는 이를 달성하기 위해 poly mix 및 B가 접합된 카드뮴 텔루라이드 양자점의 항균 효과를 테스트합니다. 먼저 양자점을 me, capto proprionic acid에 용해시킵니다.

다음으로, 양자점을 poly mix에 접합시키고, 항생제가 도말된 박테리아를 항생제 접합 양자점과 비접합 양자점 모두로 처리합니다. 그 후 샘플의 절반에 440 nanometer 청색광을 30분 동안 조사하여 양자점이 엑시톤과 활성 산소종을 생성하게 함으로써, 양자점 처리가 박테리아의 성장 및 생존에 미치는 영향을 평가합니다. 흡광도 측정과 콜로니 계수를 수행합니다. 결과 데이터에 따르면, 항생제 접합 카드뮴 텔루라이드 양자점을 적용한 후 조사를 실시했을 때 테스트한 조건들 중 가장 큰 살균 효과가 나타났습니다.

이 방법은 카드뮴 텔루라이드 양자점 및 그것의 polyx in B 접합이 E coli 성장에 미치는 영향에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 유형의 나노입자와 항생제를 다양한 박테리아 균주에 적용하는 데에도 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 MPA가 과량으로 포함될 경우 양자점이 응집되며, 아주 적은 양이라도 toline을 피펫팅하면 필터가 손상되기 때문입니다.

오늘은 항생제가 접합된 KE IDE 양자점의 항균 효과를 평가하는 방법을 시연하겠지만, 인듐 인산염, 황산 아연 및 황산 아연-카드뮴 이드와 같은 다른 유형의 양자점에도 유사한 방법을 사용할 수 있습니다. 이 절차는 유리 바이알에 15 µM 농도의 톨루엔 내 카드뮴 텔루라이드 또는 CDTE 양자점 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오. 흡광 분광법을 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정하고, 피펫을 사용하여 이 스톡 용액 200 µL를 유리 바이알로 옮기십시오.

플라스틱을 사용하지 마십시오. 그런 다음 800 µL의 toluene, 1 mL의 200 mM borate buffer, 그리고 2 µL의 11.5 M MER capto proprionic acid 또는 MPA를 추가하고 바이알의 캡을 닫은 뒤 30~60초 동안 격렬하게 흔들어 섞습니다. 흔든 후에는 수성 층과 유기 용매 층이 자연스럽게 분리됩니다.

수성 층은 양자점의 색과 동일하게 변합니다. 틸링 층(tiling layer)을 방지하기 위해 해당 층을 제거한 후, 양자점 층을 분리하여 깨끗한 바이알로 옮깁니다. 가용화된 양자점을 정제하려면 이를 500 µL 원심분리 필터로 옮깁니다.

50 mM Borate 버퍼 100 µL를 첨가하고 3000 ×g에서 13분 동안 원심분리합니다. 이 세척 과정을 네 번 반복합니다. 최종 세척 후, 세척된 양자점을 500 µL의 Borate 버퍼에 현탁하여 4 °C에서 보관합니다.

이들은 1~2주 동안 안정적으로 유지됩니다. 양자점의 농도를 추정하기 위해 흡광 및 방출 스펙트럼을 측정하십시오. 이 그림은 UV 램프 조명 하의 CDTE 양자점과 수용성 가공 전후의 방출 스펙트럼을 보여주며, 리간드 교환으로 인한 광학적 특성 변화가 거의 없음을 나타냅니다.

프로토콜의 이 부분은 이끼, 상업용 양자점, 금속 입자 등을 포함하여 음전하를 띠는 모든 수용성 나노입자에 적용 가능합니다. 이 예시에서는 항생제 poly mixen B 또는 PMB를 30:1의 몰비로 양자점에 접합합니다. PMB는 양전하를 띠며 접합 과정 없이도 자가 조립됩니다. 시약은 PMB와 물을 용해합니다.

60 µM 농도로 준비합니다. 웰당 0.3 mL의 박테리아가 들어있는 96-웰 플레이트를 4회 반복 실험(quad duplicates)으로 구성할 경우, 200 nM 접합체(conjugate) 0.5 mL면 충분합니다. 이를 위해 마이크로 원심분리 튜브에 50 mM 붕산 완충액(borate buffer)에 희석된 1 µM 양자점(quantum dots) 100 µL를 넣습니다.

다음으로, 증류수에 희석된 10 x 또는 60 micromolar PMB 항생제 용액 50 microliters를 접합체 튜브(conjugate tube)에 첨가합니다. 대조군 튜브(control tube)에는 증류수 50 microliters를 첨가합니다. 50 millimolar ate 완충액을 사용하여 전체 부피를 0.5 milliliters로 맞춥니다. 알루미늄 호일로 튜브를 감싸 빛을 차단한 후, 회전 혼합기(rotator)에서 1시간 동안 반응시킵니다.

응집이 발생하는 경우, 더 낮은 농도의 항생제를 사용하여 접합 과정을 반복하십시오. 입자가 응집되지 않을 때까지 농도를 서서히 높여 접합물을 세척하십시오. 대부분의 항생제에는 적합하지만 단백질이나 항체에는 적합하지 않은 10,000 molecular weight cutoff 필터에 용액을 부어 여과하십시오.

마지막으로, 흡광 또는 형광 분광법, 겔 전기영동 또는 푸리에 변환 적외선 분광법을 사용하여 퀀텀닷당 항생제 분자의 수를 추정하십시오. 이 그림은 PMB 접합 전 퀀텀닷의 전형적인 흡광 및 방출 스펙트럼과 160몰 당량의 PMB를 첨가한 후의 방출 스펙트럼을 보여줍니다.

정사각형으로 표시된 PMB 비율과 양자점 방출 강도 사이의 관계, 그리고 삼각형으로 표시된 피크 파장 위치 사이의 관계가 여기에 나타나 있습니다. PMB 농도가 증가함에 따라 QD 방출 강도가 감소하며, 이로 인해 피크 방출 파장의 이동이 발생합니다. 프로토콜의 다음 단계는 접합 실험 2일 전 저녁에 항생제의 반최대 억제 농도(IC 50)와 양자 독성을 결정하기 위해 수행됩니다.

신선한 e coli 콜로니를 사용하여 LB 배지 10 milliliters에 접종합니다. 다음 날, 실험 시작 1~2시간 전에 투명한 96 웰 플레이트의 각 웰을 채웁니다. 성장 배지를 사용하여 여기 표시된 대로 분석 플레이트를 구성해야 합니다.

샘플은 3반복으로 플레이팅해야 하며, 항생제 농도는 박테리아를 거의 억제하지 않는 농도와 모두 사멸시키는 농도를 모두 포함할 수 있도록 충분히 넓은 범위로 설정해야 합니다. 컨쥬게이트 실험에 사용할 농도의 양자점이 포함된 모든 웰 또한 3반복으로 포함해야 합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 적절한 웰에 1~50 µL의 박테리아 배양액을 분주합니다.

농도는 특정 균주의 성장 속도에 따라 달라지며 이에 맞춰 보정해야 합니다. 성장을 모니터링하려면 플레이트를 플레이트 리더에 넣고 600 nanometers에서 10분 간격으로 2시간 동안 측정하도록 설정하십시오. 모든 세포의 OD가 0.1에서 0.15에 도달하면 플레이트 리더에서 플레이트를 꺼내고 기록을 중단합니다.

다음으로, 양자점(quantum dots)이 포함된 PMB를 적절한 웰에 첨가하고, 플레이트의 절반을 알루미늄 호일로 3중 차폐합니다. 그런 다음 2.4 milliwatt LED로 제작된 맞춤형 440 nanometer 램프 아래에 플레이트를 30분 동안 두어 플레이트의 조명 노출 면을 조사합니다. 광노출 후, 플레이트를 플레이트 리더기에 넣고 성장 속도에 따라 5~12시간 동안 10분마다 OD 600을 기록합니다. 소프트웨어를 사용하여 배양이 건조되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 온도를 32 degrees Celsius 미만으로 유지하십시오.

선택한 시점에서의 성장 곡선을 로그 농도에 대해 도식화하고, 화면에 표시된 Hill 방정식을 사용하여 항생제의 IC 50를 결정합니다. 여기서 H는 Hill 계수입니다. Y max는 성장의 최고점이며, Y min은 마찬가지로 이상적으로는 고원 영역에 있는 제로 포인트입니다. 배양 기간이 끝나면, 투명한 웰은 완전한 세포 사멸을 나타내며 약물 농도가 증가함에 따라 세포 밀도의 구배가 나타나야 합니다.

박테리아는 여기에 표시된 것과 같은 S자형 성장 곡선을 보여야 합니다. 최대 정체기(plateau)의 위치는 균주마다 크게 다르며 온도에 따라서도 달라집니다. 특정 시점을 대표값으로 선택하고, 해당 값을 항생제의 로그 값에 대해 도식화하여 퀀텀닷을 평가하기 위한 IC 50를 구할 수 있습니다.

독성 생존율과 양자점 농도의 로그 값을 그래프로 나타낼 수도 있으나, 사용된 농도의 양자점만으로 유의미한 박테리아 사멸을 유도하는 경우는 드뭅니다. 양자점과 항생제 각각의 독성이 결정되면, 동일한 프로토콜을 적용하여 항생제의 독성을 결정할 수 있습니다. 접합된 양자점이 표시되어 있습니다.

다음은 이 분석법의 예시 레이아웃입니다. 컨쥬게이트(conjugate)는 농도를 높여 4중 중복(quad duplicate)으로 테스트하며, 박테리아만 포함된 대조군 스트립, 약물만 포함된 스트립, 그리고 양자점(quantum dot)만 포함된 샘플 웰이 포함되어야 함에 유의하십시오. 이후 OD 600 측정값을 사용하여 성장 곡선을 생성하고, 이전과 같이 IC50 값을 산출할 수 있습니다.

이 그림은 항생제 단독 처리와 독성이 유사한 접합체의 예와 독성이 더 강한 접합체의 예를 보여줍니다. 각 조건에 대한 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 결정하려면, 플레이트 카운팅을 수행할 처리된 96-웰 플레이트에서 하나 이상의 웰을 선택하십시오. 선택한 각 세균 샘플을 식염수로 단계별 희석하십시오.

이를 위해 적절한 컬럼에 180 µL의 식염수를 피펫팅합니다. 세균 용액 20 µL를 취해 180 µL의 식염수로 희석합니다. 피펫 팁을 교체하고 혼합한 후, 희석된 세균 용액 20 µL를 180 µL의 식염수로 옮깁니다.

이 과정을 6회 반복합니다. 그다음, 마지막 6개 희석액에서 각각 10 µL씩 취해 직사각형 오거 플레이트에 스팟 플레이팅합니다. 직사각형 플레이트에는 총 36개의 스팟을 플레이팅할 수 있습니다.

플레이트를 벤치 위에서 15분 동안 건조시킨 후, 37°C에서 16시간 동안 배양합니다. 배양 후 콜로니 수를 측정하여 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)를 결정합니다. 콜로니 수에 희석 배수를 곱하고 도말한 부피로 나누어, 처리가 박테리아 성장에 미치는 영향을 확인합니다.

OD 600에서 E. coli의 세포 밀도를 측정하였습니다. 여기에는 0부터 완전한 세포 사멸까지 서로 다른 약물 농도에 따른 대표적인 박테리아 성장 곡선이 나타나 있습니다. 빈 기호는 농도가 표시된 PMB 단독 처리군입니다.

채워진 기호는 조사 처리하지 않은 C-D-T-E-P-M-B를 나타내며, 반쯤 채워진 기호는 조사 처리한 C-D-T-E-P-M-B를 나타냅니다. 조사는 PMB 단독 샘플에는 영향을 미치지 않았으므로, 명확한 표시를 위해 해당 곡선들은 생략되었습니다. 다음은 빛의 영향을 제어하여 IC 50 값을 결정하기 위해, log PMB에 대한 200분 시점의 성장 곡선 값의 도식과 해당 방정식에 대한 피팅 결과입니다.

항생제만을 사용하여 30분 동안 빛에 노출시킨 곡선을 작성하였습니다. 이 그림은 CDTE QD를 사용했을 때, 200분에서의 세균 생존율과 QD 농도의 관계를 나타냅니다. 빛 노출 시 어느 정도의 독성이 관찰되었으나, IC 50 값을 결정하기에는 그 정도가 너무 낮았습니다.

이는 접합 실험에 사용된 농도에서 CDTE 단독의 독성이 무시할 수 있는 수준임을 나타내며, 서로 다른 처리가 세포 성장에 미치는 영향을 비교할 수 있게 합니다. 200분에서의 성장 곡선 값을 도식화하고 앞서 제시한 방정식에 대입하여 분석한 결과는 다음과 같습니다. CDTE-PMB 접합체는 PMB 단독 처리보다 더 높은 독성을 나타냈습니다. 이와 대조적으로, 금 나노입자 Au-PMB 접합체는 PMB 단독 처리 대비 독성 증가를 보이지 않았으며, 이를 통해 처리가 박테리아 생존에 미치는 영향을 확인하였습니다.

P-M-B-Q-D-P-M-B 또는 QD 단독으로 처리하고 30분 동안 방사선을 조사하거나 조사하지 않은 상태로 96-웰 플레이트에 분주된 E. coli의 콜로니 형성 단위 수를 측정하였으며, 이후 32°C에서 4시간 동안 배양하였습니다. 각 세균 샘플을 식염수로 연속 희석하여 100배에서 10⁷배 희석액 10µL를 agar 플레이트에 도말하였습니다. 플레이트를 37°C에서 배양하고 16시간 후에 콜로니 수를 측정하였습니다.

이 예시에서 플레이트의 A열부터 C열까지는 CDTE의 농도를 높여 처리한 박테리아입니다. 방사선을 조사하지 않은 접합체와 D열부터 F열까지는 접합체의 농도를 높여 처리한 박테리아입니다. 30분간의 방사선 조사와 함께 각 행을 따라 희석 배수가 표시되어 있습니다.

데이터에 따르면, 조사 후의 컨쥬게이트는 조사를 하지 않은 컨쥬게이트에 비해 박테리아 성장을 더 강력하게 억제하는 것으로 나타났습니다. ca 시약은 독성이 매우 강하므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑, 실험복 및 고글 착용과 같은 주의 사항을 준수해야 함을 잊지 마십시오. 이 영상을 시청한 후에는 항생제 컨쥬게이션 여부에 따른 나노입자의 항균 효과에 대한 고속 스크리닝 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.