위한 시스템 예 생체 배양

이 절차의 전반적인 목표는 생체 외에서 마우스 배아 췌장 새싹을 해부하고 배양하여 발달 중인 췌장을 직접 시각화할 수 있도록 하는 것입니다. 이것은 먼저 배아 11.5일 또는 12.5일 마우스 배아를 해부하고 상체와 꼬리 부위를 제거하여 배아의 중간 몸체를 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 십이지장 영역과 위를 노출시켜 위치를 파악한 다음 등쪽 췌장 새싹을 해부하는 것입니다.

다음으로, 새싹은 MacTech 접시의 마이크로 웰로 옮겨져 최대 일주일 동안 배양됩니다. 마지막으로, explan은 라이브 셀 이미징을 위해 분석될 수 있으며, 또는 explan은 고정되고 전체 마운트 염색 및 면역 형광 이미징으로 분석될 수 있습니다. 궁극적으로 췌장 세포 분화, 세포골격 조직, 세포 극성 및 분지 형태 형성을 평가할 수 있습니다.

췌장 외식식물의 생체 외 배양은 분지 형태 형성과 같은 췌장 유기 형성의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 발달 중인 췌장에서 어떻게 발생하며 이 사건이 성장 및 분화와 어떻게 연결되어 있는지 확인하십시오. 실험 전날, 35mm MacTech 페트리 접시의 20mm 직경 유리 바닥 마이크로웰에 약 150마이크로리터의 피브로넥틴이 유리 표면 전체를 덮습니다.

그런 다음 접시를 섭씨 4도의 냉장고에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. 박리 당일에는 피브로넥틴을 흡인합니다. 세포 배양 등급의 물로 마이크로 웰을 헹구고 각 웰에 최소 150마이크로리터의 해부 배지를 추가합니다.

성공적인 해부를 위해서는 배아의 해부학적 구조를 잘 알고 위에서 조명이 비추는 실체 현미경 아래에서 등쪽 췌장 새싹을 찾을 수 있어야 합니다. 듀몬트 겸자를 사용하여 자궁을 개별 배아 분절로 분리합니다. 그런 다음 자궁 근육을 부드럽게 벗겨내고 데시두아로 둘러싸인 개별 배아를 제거합니다.

표준 배아 해부 기술을 사용하여 배아를 노출시키고 난황 자루와 양막을 제거합니다. 그런 다음 간 위의 배아의 꼬리 부분과 상체를 제거합니다. 이제 아래로부터의 트랜스 조명만 사용하여 집게를 사용하여 배아의 몸 중간을 열기 위해 측면을 부드럽게 절개하여 내부 장기의 노출을 용이하게 합니다.

위와 비장을 찾습니다. 등쪽 췌장 새싹은 위의 뒤쪽 부위에 측면으로 부착되어 있습니다. dumont 겸자를 사용하여 위와 비장에서 등쪽 췌장 새싹을 절개하되 이 그림에 표시된 췌장 새싹과 같이 상피 주위에 약간의 중간엽을 남깁니다.

마지막으로, 유리 목초지 피펫을 사용하여 분리된 새싹을 저온 배양 배지가 들어 있는 35mm 페트리 접시로 옮깁니다. 배양 배지를 사전 예열한 후 섬유 닌 코팅 매트 테크 접시의 해부 배지를 약 150마이크로리터의 배양 배지로 교체합니다. 멸균 층류 후드에서는 세포의 부착과 확산을 보장하기 위해 췌장 지수를 매트 플레이트의 중앙에 조심스럽게 배치하는 것이 중요합니다.

그런 다음 유리 목초지 피펫을 사용하여 하나의 췌장 엑스플랜을 코팅된 각 매트 테크 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 배양 중 퍼짐을 보장하려면 미세한 바늘로 엑스플란을 둘러싼 중간엽을 부분적으로 찢습니다. 이제 엑스플란을 조직 배양 인큐베이터에 몇 시간 동안 부드럽게 넣어 마이크로 웰의 유리 바닥에 부착되도록 합니다.

엑스플랜이 부착되면 매트 테크 접시에 1.5-2밀리리터의 예열 배양 배지를 채웁니다. 최대 1주일까지 5일 동안 격일로 배양 배지를 교체하십시오. 먼저 배양 배지를 흡인하고 2ml의 PBS로 엑스플란을 한 번 세척합니다.

그런 다음 PBS를 제거하고 얼음처럼 차가운 2ml, 파라 포름알데히드 4%로 X 임플란트를 고정하고 매트 테크 디쉬를 얼음 위에 20분 동안 놓고 때때로 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 다음으로, 파라폼 알데히드를 제거하고 실온에서 각각 10분 동안 2ml의 PBS로 엑스플란을 3회 세척한 후 실온에서 2ml의 차단 용액으로 30분 이상 세척합니다. 이제 매트 테크 플레이트를 냉장실로 옮기고 습한 챔버 안에 넣으십시오.

증발을 방지하기 위해 차단 용액에 희석된 1차 항체 최소 150마이크로리터를 20mm 마이크로웰 중앙에 직접 첨가합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 배양을 위해 전체 엑스플랜 표면을 덮고 있는 매트 테크 플레이트의 함몰. 다음날, 항체 용액을 제거하고 결합되지 않은 항체를 실온에서 각각 30분 동안 2밀리리터 PBS와 트윈 20으로 3회 세척합니다.

세척 후 PBT를 제거하고 최소 150마이크로리터의 2차 항체 망상으로 전체 엑스플란을 덮고 2차 항체로 염색한 후 실온에서 1-2시간 동안 엑스플란을 배양합니다. 2ml의 PBS 플러스 트윈으로 엑스플랜을 세 번 세척합니다. 실온에서 각각 30분 동안 20개, PBS로 한 번만 20개를 제거합니다.

마지막으로 PBS를 제거하고 매트 테크 플레이트의 20mm 마이크로 웰에 페이딩 방지 기능이 있는 수성 장착 매체를 적반으로 추가합니다. 그런 다음 기포를 피하는 유리 커버 슬립으로 엑스플란을 부드럽게 덮습니다.췌장 엑스플랜이 유리 바닥 접시에 단단히 부착된 후, 장비가 예열되는 동안 이미징하기 최소 1시간 전에 히터 박스를 조립하고 켜고, 엑스플랜 배지를 흡인하고 층류 후드 내부의 신선한 배양 배지로 교체합니다. 그런 다음 임플란트를 현미경실로 부드럽게 옮기고 매트 테크 접시를 컨포칼 현미경의 표본 홀더에 놓습니다.

대물렌즈에 물 매체를 추가합니다. 환경 챔버를 닫은 다음 엑스플랜에서 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 이틀간의 배양 후, 췌장 외식은 상당한 성장을 거쳐 분지된 상피 구조로 조직되기 시작합니다.

분기가 시작된 영역을 기록해 둡니다. 오른쪽 그림에서 빨간색 점선으로 구분되어 있는 이 대표적인 3D 재구성은 췌장 배양 3일차에 전체 마운트 면역 염색을 재현한 것으로, 배양 4일차에 48시간의 배양 외식까지 광범위한 분지를 거친 PDX 1 양성 세포의 세뇨관을 외식이 어떻게 나타내는지를 보여줍니다. EC Ahern에 대한 염색을 빨간색으로 표시하고 phospho histone을 파란색으로 표시하면 카르복시 펩티다아제 1 또는 녹색의 CPA 1이 상피 가지 끝의 전구 세포에 나타나며, 이 역시 점선으로 구분됩니다. 이 대표적인 날에는 췌장에서 내분비 계통 마커에 대한 3개의 전체 면역 염색, explan 인슐린 염색은 녹색으로 표시되며, 글루카곤은 파란색으로, eca herrin은 빨간색으로 표시되며, 노란색 화살표는 인슐린과 글루카곤 양성 세포의 클러스터를 나타냅니다.

삽입 사진에서는 내분비 클러스터 중 하나가 확대되어 있습니다. 또한, 체외 배양에서 췌장 상피는 F 액틴의 정점 국소화와 함께 적절한 세포골격 조직과 세포 극성을 보여주며, 이는 여기에서 녹색으로 나타나고 베타 원 인테그린은 여기에서 빨간색으로 나타나는 기저막에서 나타납니다. 별표로 표시된 중간엽 세포는 P pdx 하나의 양성 상피 세포 사이에 산재되어 있습니다.

이 그림에서는 12분마다 촬영한 멤브레인, 토마토, 췌장 외식식물의 멤브레인, 토마토, 췌장 외식식물을 배양한 타임랩스 영상에서 촬영한 스틸 프레임이 표시됩니다. 점선은 가지의 끝과 상피와 중간엽 사이의 경계를 나타냅니다. 12시간의 타임랩스 실험 후에도 멤브레인 토마토 형광 신호는 강도가 감소하더라도 여전히 실행 가능하고 감지할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 췌장 새싹을 해부하고 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 형태 형성 성장 및 분화를 포함하여 췌장 발달의 다양한 측면을 연구하는 데 도움이 될 것입니다.