Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에

이 절차의 전반적인 목표는 임신 초기 단계에서 전기천공법을 통해 플라스미드 DNA를 도입함으로써 배아 후뇌 전구세포의 유전자 발현을 조작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 임신 11.5일차의 배아를 분리하고, 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS) 내에서 배아의 등 쪽이 위를 향하도록 배치합니다. 두 번째 단계는 0.01% fast green에 희석된 발현 플라스미드 약 50 µL를 주입하는 것입니다.

주입이 성공적으로 이루어지면, 전체 뇌실계가 DNA fast green 혼합물로 채워집니다. 다음으로, 배아에 전기 펄스를 가합니다. 양전하 전극에 더 가까운 쪽의 배아가 플라스미드 DNA를 흡수하게 됩니다.

반대편은 내부 음성 대조군으로 사용됩니다. 마지막 단계는 배아를 조직 배양기에 넣고 최소 24시간 동안 배양하는 것입니다. 최종적으로, 전기천공된 유전자는 24시간 배양 후 발현되며, 이는 면역조직화학염색법으로 평가할 수 있습니다.

기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 장점은 배아 후뇌 progenitor를 더 이른 임신 시점에 조작할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 신경 유전자가 배아 progenitor의 운명에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 해당 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 동봉된 원고에 따라 해부 도구와 층류 후드(lamina flow hood)를 멸균하는 것으로 이 절차를 시작하십시오.

배아를 수확하려면 임신 11.5일(E 11.5) 된 안락사시킨 암컷 생쥐를 후드 내 해부 트레이 위에 놓습니다. 그다음 생쥐의 복부를 70% ethanol로 소독합니다. 복강을 열고 복벽을 해부 트레이에 핀으로 고정합니다.

그 다음 자궁각을 끌어내어 복강 내에 위치하도록 합니다. 핀셋을 사용하여 자궁각의 벽을 조심스럽게 엽니다. 20 millimeter 스푼을 사용하여 난황낭에 있는 배아를 태반에서 부드럽게 제거합니다.

그 후, 10 mL의 멸균된 예열된 1배 PBS가 미리 채워진 100 mm 조직 배양 접시에 배아를 넣습니다. 이 단계에서는 37 °C로 예열된 10 mL의 멸균된 1배 PBS가 미리 채워진 새로운 100 mm 접시로 첫 번째 배아를 옮깁니다.

다음으로, 난황낭을 조심스럽게 제거하여 버립니다. 그런 다음 배아의 등 쪽이 위를 향하도록 배치합니다. 해부 현미경 하에서 7 mm 전극 패들로 배아를 부드럽게 고정합니다.

후뇌 제4뇌실 수준의 신경관 양측에 전극을 각각 배치합니다. 그 후, 1cc 주사기를 사용하여 플라스미드 DNA와 0.01% Fast screen 혼합액을 흡입합니다. 일반적으로 이 혼합액 500 µL면 최소 8~10개의 배아를 전기천공하기에 충분합니다. 다음으로, 1cc 주사기에 연결된 25게이지 5/8인치 투베르쿨린 바늘을 사용하여 제4뇌실 상부의 roof plate를 조심스럽게 천자합니다.

그런 다음 DNA DI 혼합물 약 50 µL를 뇌실에 주입합니다. 주입이 성공적으로 이루어지면 DNA DI 혼합물이 전체 뇌실 시스템을 채우게 됩니다. DNA DI 혼합물을 전달하는 또 다른 방법은 중뇌를 덮고 있는 벨룸(vellum)을 뚫어 뇌실 시스템에 접근하는 것입니다. 펄스 발생기를 켜고, 전극 펄스 발생기와 7 mm 전극 패들을 사용하여 5개의 사각 펄스를 전달하면 양전하 전극과 가장 가까운 조직에 전달됩니다.

라미나 플로우 후드 내에서 플라스미드를 준비하는 동안, 10% fetal bovine serum, 5% equine serum, 1% glutamine, 1% penicillin streptomycin이 첨가되어 37°C로 예열된 DME MF 12 배지 2 mL를 12-well 배양 접시의 각 웰에 채웁니다. 그다음 핀셋으로 배아의 중간 부분을 잡습니다. 배아의 후방 부분을 제거한 후, 전방 부분을 배지가 채워진 배양 접시의 웰 중 하나에 넣습니다.

모든 배아에 대해 동일한 절차를 반복하고, 12-well 플레이트의 바깥쪽 웰만 채웁니다. 배양물의 오염을 방지하기 위해, 전기천공된 플라스미드가 발현될 수 있도록 배아를 5% carbon dioxide 농도의 37 °C 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 더 긴 배양 시간이 필요한 경우, 새로운 12-well 플레이트의 웰에 D-M-E-M-F 12 배지 2 mL를 채웁니다.

멸균된 스푼을 사용하여 배아를 새 플레이트의 웰로 옮깁니다. 그 후 배아를 다시 37 °C 인큐베이터에 넣고 최대 48시간 동안 배양하여 분석을 위해 배아를 고정합니다. 12-웰 플레이트를 1× PBS로 채운 다음, 배아를 옮겨 4 °C에서 5분 동안 헹굽니다.

다음으로, 4°C에서 2시간 동안 1× PBS 내 2% paraformaldehyde로 배아를 고정합니다. 그 다음 4°C의 1× PBS에서 5분 동안 세 번 헹굽니다. 다시, 새로운 12-well 플레이트에 1× PBS 내 30% sucrose를 채웁니다.

배아를 해당 웰로 옮기고 4°C에서 하룻밤 동안 평형화합니다. 그런 다음 드라이아이스 에탄올 배스(bath)를 사용하여 배아를 최적 절편 온도 화합물(optimal cutting temperature compound)에 매립하거나 -20°C에서 보관합니다. 마지막으로 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 배아를 30 µm 두께로 절편화합니다.

슬라이드에 마운트하여 -20°C에서 보관합니다. 이후의 연구에서 여기 제시된 결과는 배양 24시간 후 전기천공법을 적용한 E 11.5 배아 횡단면의 GFP 면역조직화학 염색에 대한 대표적인 결과입니다. 여기에 표시된 화살표는 2차 항체가 포착된 roof plate를 나타냅니다.

결과를 보면 하단 ROIC 립의 전기천공 영역이 제한적이었으며 신경관의 전후축 전체로 확장되지 않았음을 알 수 있습니다. 여기에는 분석된 단백질 중 MASH one과 math one 두 가지의 결과가 나타나 있습니다. 전기천공 및 배양 후 대조군 배아와 비교했을 때, 11.5 단계에서 대부분의 배아가 정상적인 발현 수준을 유지하는 것을 관찰하였습니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 1~2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후, 여러분은 마우스 배아 막의 전구세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해 in vitro 전기천공법 분석법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.