Name: 마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절하는 유전자를 연구하는 Oct4GiP 형광 리포터 분석법을. 유전자 침묵과 유세포 분석을 통해 중간 규모 유전자 스크리닝에 적합한 고감도 방법을 제공합니다.

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우리는 읽고 원고를 편집 브래드 Lackford 감사드립니다. 이 연구는 환경 건강 과학, 건강 교내 연구 프로그램 Z01ES102745 국립 연구소 (GH까지)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. Oct4GiP 마우스 ES 세포 유지 보수 Oct4GiP 전지는 친절 박사 오스틴 스미스에 의해 제공되었다. 그들은 Oct4-GFPiresPac transgene 4,5 들고 129/Ola 마우스에서 파생되었다. 그들은 ESGRO 전체 더하기 clonal 학년 중간 (Millipore), 또는 M15 매체의 젤라틴 코팅 조직 배양 플레이트에 유지됩니다 DMEM (Invitrogen)은 15% FBS, 1000 U / ML ESGRO (Millipore), 1X 비로 보충 필수 아미노산 (Invitrogen), 1X EmbryoMax Nucleasides (Millipore) 및 10 μm의 β-메르 캅 토 에탄올. <ol><li> 30 분간 실온에서 0.1 % 젤라틴 (시그마) (0.1 ML 젤라틴 용액 / cm 2)와 코트 판. </li><li> 플레이트 Oct4GiP의 ~ 2시 젤라틴 코팅 접시에있는 세포 × 10 4 / cm 2. </li><li> 0.05 %의 트립신과 함께 이틀 세포를 분할. </li></ol> 2. Oct4GiP 셀에서 siRNA의 Transfection Oct4GiP 기자 분석은 대부분의 convenien입니다M15 매체 또는 접시 384도 (코닝 또는 BD) - tly 젤라틴 코팅 평평한 바닥에서 96 실시. 전체 절차는 그림 1에 설명되어있다. <ol><li> siRNA - 지질 단지 어셈블리 : <ol><li> 96 - 웰 플레이트에 transfection 들어, U-바닥에 siRNA - 지질 단지 96 - 웰 플레이트를 조립. </li><li> 각 우물로, 10 μl OptiMEM (Invitrogen)와 0.3 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)를 혼합하고 5 분 동안 상온에서 품어. </li><li> 지질 OptiMEM 혼합물에 5 pmol siRNA를 추가하고 또 다른 15 분 동안 품어. siRNA : 6ul : 지질 비율이 100 pmol입니다. </li><li> 멀티 채널 피펫으로 젤라틴 코팅 평면 바닥 판으로 U-맨 아래 판에서 OptiMEM의 siRNA-지질 단지를 전송합니다. </li><li> 384 잘 접시에 transfection 들어, 0.1 μl Lipofectamine 2000 및 10 μl OptiMEM 2 pmol siRNA를 이용하여 siRNA - 지질 단지를 준비합니다. </li></ol></li></ol> 참고 : 최종 siRNA 농도의transfections 50 nm의입니다. 3-4 생물 학적을 수행하면 각 siRNA의 transfection을 위해 복제합니다. 플랫 바닥 젤라틴 코팅 플레이트로 U-바닥 플레이트와 나누어지는의 siRNA-지질 단지의 마스터 섞어 설정합니다. <ol start="2"><li> Oct4GiP 전지 도금 및 transfection : <ol><li> 96 - 웰 플레이트에 transfection 내용 Oct4GiP 세포를 수집 및 9 X 10 4 셀 / ML에 신선한 M15 매체에서 그들을 resuspend. </li><li> 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 세포 현탁액을 100 μl를 추가합니다. </li><li> 3-5 번 아래로 pipeting 및하여 우물에 사전 aliquoted siRNA-lipids의 단지와 세포 현탁액을 섞는다. 다른 siRNA의 transfections 대한 정보를 변경합니다. </li><li> 384 잘 번호판, resuspend의 Oct4GiP 세포의 Transfection을 위해 6 X 10 4 셀 / 각도에 대한 ML 및 나누어지는 30 μl 세포 현탁액. </li></ol></li></ol> 참고 : 최적의 셀 도금 밀도는 일반적으로 3 × 10 5 세포 / ㎝ 2입니다하지만 m불안하다는 크게 세포 성장이나 생존에 영향을 siRNAs에 대한 최적화가 필요합니다. 낮은 도금 밀도는 transfection 동안 가난한 세포 생존으로 이어질 것입니다. 높은 도금 밀도가 높은 세포 합류 유도 차별화에 의한 높은 배경으로 이어질 것입니다. 만약 2-4 × 10 5 세포 / ㎝ 2 사이의 필요한 테스트 도금 밀도. <ol start="3"><li> 매체 변화 : <ol><li> 다중 채널 흡인기 (코닝) 또는 진공 지팡이 (VP-학술)을 사용하여 오래된 매체를 제거합니다. 접시의 바닥에 전지를 긁히지 않게 조심해라. </li><li> 매일 멀티 채널 피펫을 사용하여 신선한 ES 세포 매체 (384 잘 접시 96 - 웰 플레이트에서 30 μl 100 μl)으로 세포를 먹이. </li></ol></li></ol> 3. FACS 분석 <ol><li> 세포 분열 : <ol><li> 나흘 transfection 후, 멀티 채널 흡인기 (코닝) 또는 진공 지팡이 (VP-학술)을 사용하여 매체를 제거합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트 들어, 100μ으로 한 세포를 헹굼리터 PBS. </li><li> 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 25 μl 0.25 %의 트립신을 추가합니다. </li><li> 가끔 교반과 오분 동안 상온에서 부화하고, 시각 세포의 완전한 분리를 보장하기 위해 검사한다. </li><li> 트립신을 inactivate 반복 pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 세포를 떼어 놓다 10 % FBS와 PBS의 90 μl를 추가합니다. </li><li> 384 잘 접시의 경우 10 % FBS와 30 μl PBS 갖춘 10 μl 트립신과 끄지으로 세포를 끊을. </li></ol></li><li> FACS 분석 : <ol><li> HTS 유닛 또는 기타 유사 시설의 FACS 분석기 (예 : Accuri 또는 Intellicyt 등)을 갖춘 BD LSRII FACS 분석기에서 GFP의 형광 분석. </li><li> HTS의 높은 처리량 모드를 사용하여 세포 현탁액의 10 μl를 분석합니다. 1.0 X 10 4 세포로 카운트 임계값을 설정합니다. </li><li> 앞으로 대 사이드 분산형 음모에 세포를 캡처하는 PMT 전압과 임계값을 조정합니다. forw에서 라이브 세포 인구를위한 게이트ARD 대 사이드 분산형 계획. </li><li> GFP 채널에 대한 히스토그램 플롯을 만듭니다. 세포 ~ 10 %는 모방이나 제어 siRNA transfected 세포에 GFP-음수로 표시되도록 GFP 채널의 게이트를 설정합니다. </li><li> % 차별화된 세포 세포 = %의 GFP-음성 : 각 치료에서 % GFP-음성 세포를 결정합니다. 2 꼬리 T-테스트를​​ 사용하여 실험 및 제어 siRNA의 transfections 사이 % 차별화된 세포를 비교하고, P-값 &lt;0.01로 긍정적인 안타를 득점. </li></ol></li></ol> 4. 대표 결과 Oct4, Nanog, 그리고 Sox2는 ES 세포 자기 갱신 6,7,9-11의 유지에 중요한 역할을 세 유전자 있습니다. 그림 Oct4GiP 기자 분석이 쉽게 이러한 요인을 입을으로 인한 차별을 감지할 수있는이 공연 Oct4GiP ES 세포. 그림 2A는 ES로 유지하면 Oct4GiP의 ES 세포는 GFP-양수 보여줍니다<html> . 그림 2B 세포는 앞으로 대 측면 분산형 계획 및 제어 또는 Oct4-siRNAs로 transfected Oct4GiP 세포의 GFP 채널의 히스토그램을 보여줍니다. 죽은 세포와 파편 GFP-음성이며 배경을 증가하므로 그것은 앞으로 대 측면 분산형 플롯에서 라이브 세포에 대한 게이트가 필요합니다. 한편, 가능한 세포 대단히 짧은 시간을 제외하도록 차별을 이중어 항상 필요하지 않습니다. 제어 siRNA transfected 세포에서는 세포의 대부분은 GFP 양성해야합니다. 명백한 GFP - 부정적인 인구가 제어 siRNA transfected 우물에있는 경우, 시작 Oct4GiP 세포 또는 transfection 절차가 손상되었을 수 있으며 결과는 interpretable되지 않을 수 있습니다. 그림 2C는에서 % 차별화된 세포 (% 차별화된 세포 = % GFP-음성 세포)의 막대 그래프를 보여줍니다 제어, Oct4-, Nanog-, 그리고 Sox2-siRNA transfected 세포. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; 1 그림. Oct4GiP 기자 분석의 개요. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> 그림 2. Oct4GiP 기자 분석은 Nanog, Oct4, Sox2 또는 입을 의한 ES 세포 분화를 검색할 수 있습니다. ) E14Tg2a (야생 형, 블랙 라인) 및 Oct4GiP (녹색 라인) 세포는 FACS로 분석되었다. GFP 채널의 히스토그램은 Oct4GiP 세포가 GFP 양성한지 확인하십시오. B) Oct4GiP 세포는 제어 또는 Oct4-siRNA와 96 - 웰 플레이트에 transfected와 FACS는 사일 transfection 후 분석했다 보여줍니다. 앞으로 transfected 세포의 GFP 채널의 측면 분산형 플롯과 histograms 수와 같습니다. C)가 Oct4GiP 전지로 transfected되었다 제어, Nanog -, Oct4-, 또는 Sox2-siRNA. % 차별화된 세포는 % 사일 transfection 후 세포가 GFP-음성으로 결정되었고, + / - 뜻으로 꾸몄다되었다 - 평균의 표준 오차 (N = 4).F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot;대상 = &quot;_blank&quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
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<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
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<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리가 위에서 설명 Oct4GiP 기자 분석은 정량적 자기 갱신 대 분화의 정도를 측정할 수 있습니다. 이러한 형태학 기반의 12 확산 / assays 생존 기반과 같은 다른 가능한 방법, 비교, 그것은 높은 감도 및 처리량뿐만 아니라 ES 세포 상태의 더 직접적인 측정을 제공합니다. 그것은 따라서 잘 대형 스크린 및 유전자 epistasis 분석에 적합합니다. 실제로, 우리는 다른 사람이 성공적으로 게놈 전체의 RNAi 화면 3,8에 대한 Oct4GiP 기자 분석을 사용 하였다. 모든 assays처럼, 그러나 그것은 또한 제한 사항이 있습니다. 그것은 직접 또는 간접적으로 Oct4 프로 모터의 활동을 조절하는 유전자를 공부하고 그것이 거짓으로 사후 transcriptionally GFP 발현, 안정성, 또는 기능에 영향을 미치는 유전자를 식별할 수 사용될 수 있습니다. 따라서 추가적인 assays 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 염색법 13 (Millipore,...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> ESGRO 완전한 플러스 clonal 등급 매체 </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (높은 포도당 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11,965 </td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25,200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1,001,817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (혈청 매체를 줄이기) </td><td> Invitrogen </td><td> 31,985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (비 필수 아미노산) </td><td> Invitrogen </td><td> 11,140 </td></tr><tr><td> ES 세포에 대한 100x Nucleosides </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2 - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-자격 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 10,437 </td></tr><tr><td> Nanog의 siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2의 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> 제어 siRNA : Dharamcon에 의해 합성 반딧불 루시페라제을 (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) 대상으로 s​​iRNA의 이중.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 oct4gip 리포터 분석

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency과 자기 갱신은 배아 줄기 세포의 두 정의 특성 (ES 세포)입니다. 기본적인 분자 메커니즘을 이해하는 것은 크게 발달 생물학 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 의료 (1,2 년 검토)의 ES 세포의 사용을 촉진합니다. ES 세포 유지 및 자기 갱신의 소설 규제의 식별 및 특성을 신속하게하기 위해 우리는 양적 Oct4GiP 세포에게 3을 사용 마우스 ES 세포의 자기 갱신 상태를 측정하는 형광 리포터 기반의 분석을 개발했습니다. Oct4GiP 전지는 4,5 Oct4 유전자 프로 모터 영역의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현. Oct4는 차별 6,7 중에 ES 세포 자기 갱신이 필요합니다, 그리고 고도의 ES 세포에 표현되며, 빠르게 아래쪽 규제. 그 결과, 기자 세포에서 GFP 발현과 형광 성실하게 상호ES 세포 정체성 5 및 형광 - 활성 셀 정렬과 (FACS) 분석 밀접하게 단세포 레벨 3,8에서 세포의 자기 갱신 상태를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. RNAi와 결합, Oct4GiP 기자 분석은 신속 ES 세포 유지 및 자기 갱신 3,8의 규제를 파악하고 공부하는 데 사용할 수 있습니다. 자기 갱신을 시금위한 다른 방법과 비교했을 때, 그것은 더 편리하고 민감한, 양적, 그리고 낮은 비용입니다. 이러한 높은 처리량 화면 또는 유전자 epistasis 분석과 같은 대규모 연구 또는 접시 384 - 잘 - 그것은 96에 실시 할 수 있습니다. 마지막으로, 다른 혈통 특정 기자의 ES 세포 라인을 사용하여, 우리가 여기서 설명하는 분석도 ES 세포 분화 동안 운명 사양을 공부하고 수정할 수 있습니다.

우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

다능성과 자기 재생은 배아 줄기세포(ES 세포)의 두 가지 결정적인 특성입니다. 그 기저에 있는 분자적 기전을 이해하는 것은 ...

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스 배아줄기세포(ES 세포)의 자가 재생 유지에 있어 관심 유전자의 역할을 신속하게 결정하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자를 억제하는 데 사용될 트랜스펙션 마스터 믹스를 조제함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로,트랜스펙션 마스터 믹스를 젤라틴 코팅 플레이트로 옮기고 T 4G IP 세포를 첨가합니다. 그 후 세포를 일반적인 ES 세포 배양 조건에서 배양하여 유전자 억제 효과가 나타나도록 합니다. 4일간의 배양 후, 세포를 플레이트에서 분리하고 유세포 분석법을 통해 자가 재생 상태를 결정합니다. 최종적으로 대조군과 실험군 siRNA가 트랜스펙션된 T 4G IP 세포 간의 GFP 음성 세포 비율 차이를 분석하여 평가할 수 있습니다.세포 형태학이나 계통 마커 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 민감도와 처리량이 더 높다는 점이며, 따라서 중대규모 유전자 스크리닝이나 유전자 상위성 분석에 더 적합합니다. 이 방법은 ESL 유지 및 자기 재생에 중요한 유전자에 대한 연구를 크게 촉진할 수 있습니다. 또한 ESL 분화 과정 중에 발생하는 자기 지정 이벤트에도 적용될 수 있습니다.T 4G IP 세포는 젤라틴 코팅 플레이트에서 배양합니다. 세포를 약 2 × 10⁴/cm² 밀도로 도말하며, 형질전환을 위해 2~3일마다 계대 배양합니다. 96웰 평底 플레이트에 0.1% 젤라틴으로 코팅을 시작한 다음, Optum과 Lipectomy 2000의 마스터 믹스를 조제하여 96웰 U-bottom 플레이트에 분주합니다.플레이트를 상온에서 5분 동안 배양한 후, 지질 최적 혼합물에 5 pmol의 I a를 첨가하고 15분 동안 더 배양합니다. 다음으로, 96웰 평저 플레이트에서 젤라틴을 제거하고 멀티채널 피펫을 사용하여 U자형 바닥 플레이트의 optimum 내 i a 지질 복합체를 평저 플레이트로 옮깁니다. 이제 OC 4G IP 세포를 수집하여 신선한 M 15 배지에 9 × 10⁴ cells/mL 농도로 재현탁합니다.그 후 멀티채널 파이펫을 사용하여 96-well 평저 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 µL를 첨가하고, 세포 현탁액과 pre-formed lipid complexes가 섞이도록 파이펫팅을 3~5회 반복합니다. 서로 다른 siRNA를 트랜스펙션할 때는 팁을 교체합니다. 그런 다음 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣고 세포를 4일 동안 배양합니다. 배양 매일, 멀티채널 흡입기를 사용하여 기존 배지를 제거하되, 플레이트 바닥의 세포가 긁히지 않도록 주의합니다.그 후, transfection 4일 후에 멀티채널 피펫을 사용하여 세포에 100 µL의 신선한 ES 세포 배지를 공급합니다. 멀티채널 흡입기로 배지를 제거하고 100 µL의 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 25 µL의 0.25% trypsin을 첨가합니다.실온에서 가끔 흔들어주며 세포를 5분 동안 배양합니다. 그 후, 플레이트를 육안으로 확인하여 세포가 완전히 떨어졌는지 확인합니다. trypsin을 불활성화하기 위해 10% FBS가 포함된 PBS 90 µL를 첨가하고, 세포 용액을 여러 번 파이펫팅하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다.마지막으로, FACS 분석기의 HTS 유닛에 있는 고처리량 모드를 사용하여 세포 현탁액 10 µL를 분석합니다. 카운트 임계값을 1.0 × 10⁴ cells로 설정하고, 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter) 도표에서 세포가 포착되도록 PMT 전압을 조정합니다. 전방 산란광 대 측방 산란광 도표에서 살아있는 세포 집단에 대한 분석 게이트를 설정한 다음, GFP 채널에 대한 히스토그램 도표를 생성합니다.mock 또는 대조군 SINA transfection 세포에서 약 10%의 세포가 GFP 음성으로 나타나도록 GFP 채널의 게이트를 설정하여, GFP 음성 세포의 비율을 바탕으로 분화된 세포의 백분율을 결정합니다. 각 처리군에 대해 실험군과 대조군 siRNA transfection 간의 분화된 세포 백분율을 비교합니다.첫 번째 그림은 검은색 히스토그램으로 표시된 야생형 E 14 TG two A 세포는 GFP 음성인 반면, 다음 두 그림에서 ES 세포로 유지된 녹색 히스토그램의 T 4G IP 세포는 GFP 양성임을 보여줍니다. 대조군 또는 T four siRNA를 트랜스펙션한 4일 후 T 4G IP 세포의 전방 산란광 대 측방 산란광 도표와 GFP 채널의 히스토그램이 산점도로 표시되어 있습니다. 죽은 세포와 잔해는 GFP 음성이며, 대조군 siRNA 트랜스펙션 세포의 히스토그램 데이터에서 보이는 것처럼 배경 신호가 증가하므로, 먼저 전방 산란광 대 측방 산란광 도표에서 살아있는 세포를 게이팅합니다. 대다수의 세포가 GFP 양성입니다.이 막대 그래프는 transfection 4일 후, 대조군 nano OCT 4 및 SOX 2, siRNA가 transfection된 OCT 4G IP 세포의 분화된 세포 백분율을 보여줍니다. 모든 경우에서 예상한 바와 같이, siRNA가 transfection된 세포는 대조군보다 더 높은 수준의 분화를 나타내는 것으로 확인되었습니다. 이 기술에 숙련되면, 96-well 플레이트 한 장당 1시간의 실습 시간으로 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, Oxford GIP 리포터 어세이를 사용하여 마우스 ESL 유지에서 관심 유전자의 역할을 신속하게 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

oct4gip-reporter-assay-to-study-genes-that-regulate-mouse-embryonic

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이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

SC1 라스 - GAP 및 ERK1의 이중 억제를 통해 기능을 수행합니다. 우리는 난생의 부재에서 마우스 ES 세포 자기 갱신을 지원 SC1의 기능을 테스트하고 SC1은 마우스 ES 세포 배양의 자기 갱신을 유지할 수 있는지 보여주었다.

난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

이 비디오는 마우스 배아에서 레티노산 활성을 평가하는 기술을 보여줍니다. 마우스 배아에서 세포를 분리하면 세포를 레티노산(RA) 리포터 세포와 공동 배양합니다. 배아 세포는 RA를 생성하는데, 이는 리포터 세포에서 베타-갈락토시다아제 발현을 유도하여 배아 세포에서 RA 활성을 나타냅니다.

마우스 배아 세포에 의한 레티노산 생산을 연구하기 위해 공동 배양에서 리포터 세포 사용

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다.

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

이 프로토콜은 악티노마이신 D 처리, RT-qPCR, 비선형 회귀분석을 사용하여 마우스 배아 줄기세포 내 유전자 간 및 유전자 내 강화자 RNA의 안정성과 반감기를 정량적으로 측정합니다. 위치별 정규화 전략이 eRNA 붕괴 역학을 맥락 의존적으로 정확하게 모델링하기 위해 도입됩니다.

마우스 배아 줄기세포에서 증강제 RNA 안정성의 최적화된 정량적 평가

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

배우세요 마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절하는 유전자를 연구하는 Oct4GiP 형광 리포터 분석법을. 유전자 침묵과 유세포 분석을 통해 중간 규모 유전자 스크리닝에 적합한 고감도 방법을 제공합니다.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

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