급성 간염 모델 신청 : 시각화와 간장 Microcirculation의 혈류와 산소 소비 분석

형광 표지된 적혈구를 이용하여 간 미세혈관 순환을 시각화하고, 레이저 보조 인광 이미징(laser assisted phospho imagery)을 통해 미세혈관 내 산소 분압을 측정할 수 있는 광학 시스템이 개발되었습니다. 이 방법은 미세혈관의 구조, 직경, 혈류 속도 및 산소 분압을 분석함으로써 생리학적 및 병리학적 기전을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 간 미세혈관 순환에서 혈액은 문맥 정맥동(portal ES)에서 중심 정맥동(central Es)으로 흐르며, 이 두 지점 사이에 산소 농도 구배가 형성됩니다.

간 내 산소 농도는 효소 발현과 병리 모두에 영향을 미치므로, 혈류 분석 및 산소 측정이 중요한 연구 주제가 됩니다. 본 실험 방법에서는 형광 표지된 적혈구를 정맥 투여합니다.

산소 분압 측정을 위한 형광을 이용하여 미세혈관을 시각화하기 위해, 주변 산소 농도에 따라 레이저에 의해 흥분 시 혈류 내에서 인광을 방출하는 팔라듐 포르피린을 정맥 투여합니다. 이 과정을 통해 산소의 정량적 분석이 가능하며, 간 미세혈관의 분압 측정 결과 문맥 및 중심정맥의 산소 분압이 각각 59.8 및 38.9 mmHg로 나타나 산소 농도가 효과적으로 측정됨을 입증하였습니다. 다음으로, 이 방법론을 간염 모델에 적용하였습니다.

우리는門脈(portal) ES 정현혈관과 중심 정맥(central vein)의 산소 분압이 상승했으나, 門脈과 중심 정맥 사이의 압력 차이는 감소했음을 확인했습니다. 이는 간세포 괴사로 인해 중심 정맥 영역의 산소 소비가 감소했기 때문일 가능성이 큽니다. 이러한 결과는 광학 시스템을 사용하여 간 혈역학 및 산소 소비량을 측정하는 우리의 방법론이 간 미세 순환 내 다양한 간 질환의 메커니즘을 규명할 수 있음을 보여줍니다.

산소 농도 구배는 문맥 주변부(periportal)와 중심정맥 주변부(paracentral) 영역의 효소 발현 및 미세 분포와 관련된 다양한 간 질환에 관여하는 필수적인 파라미터이므로, 혈류량과 산소 소비량을 정량화하는 것이 중요합니다. 이러한 메커니즘을 규명하기 위해, 본 방법의 장점은 비접촉식 및 연속적 광학 측정을 통해 간 미세 순환의 혈류량, 혈관 직경 및 산소 농도 구배를 정량화할 수 있다는 점입니다. 공여자 마우스로부터 전혈을 채취하고, 400 G에서 5분간 원심분리하여 PBS로 적혈구를 2회 세척하였습니다.

다음으로, FITC 2 mg을 100 mM DI 인산수소나트륨 1 mL에 녹인 후 0.2 µm 공극 막으로 여과합니다. 그다음 시험관에 FITC 용액 1 mL, 3 mM 덱스트란 용액 0.15 mL, 180 mM DI 인산수소나트륨 0.25 mL, 그리고 100 mM DI 인산수소나트륨 1.5 mL를 넣고 가볍게 두드려 섞어줍니다. 이를 상온에서 2시간 동안 유지한 후, 염색된 RBC를 PBS로 2회 세척합니다.

다음으로, 적혈구(RBC) 현탁액을 소량 유리 슬라이드에 도포하여 정상적인 RBC 외형과 충분한 형광이 나타나는지 확인합니다. 0.1 milliliter의 RBC를 0.9 milliliter의 PBS에 현탁하여 사용 전까지 4 °C에서 보관합니다. 다음으로, 500 milligrams의 BSA를 10 milliliters의 PBS에 용해합니다. 여기에 30 milligrams의 팔라듐 포르피린을 첨가하고 하룻밤 동안 교반합니다. 용액을 원심분리하여 용해되지 않은 팔라듐 포르피린을 제거하고, 상층액을 0.2 micron 공극의 멤브레인 필터로 여과합니다. 여과액 1 milliliter를 시험관에 분주하여 -20 °C에서 보관하며, 반복적인 냉동 및 해동이 일어나지 않도록 주의합니다.

미세혈관 순환을 현미경으로 관찰하기 위해, 플라스틱 판에 직경 20 millimeter의 구멍을 뚫고 그 구멍을 한 변의 길이가 30 millimeter인 정사각형 커버 글라스로 덮습니다. 꼬리 정맥에 캐뉼라를 삽입한 후, 간의 주엽을 플라스틱 판 위에 엎드린 자세로 펼칩니다. 다음으로, 호흡으로 인한 움직임과 건조를 방지하기 위해 3 millimeter by 8 millimeter 크기로 자른 여러 장의 플라스틱 랩으로 간엽 주변 영역을 덮습니다.

투과 현미경을 사용하여 간 순환을 시각화하고, 시야 내에서 최소 15분 동안 혈류 정체가 없는지 확인합니다. 혈류를 관찰하기 위해 형광 표지된 RBC 0.2 mL를 서서히 주입합니다.

산소 분압을 측정하려면 팔라듐 포르피린 용액 0.2 milliliters를 주입하십시오. 시각화된 영역 내 순환하는 전체 적혈구의 1/50이 FITC 표지 적혈구여야 하며, 450 내지 490 nanometer 밴드 패스 필터를 통과한 수은 램프로 조사하여 FITC를 들뜨게 한 뒤 CCD 카메라로 형광을 기록하십시오. 팔라듐 포르피린의 인광은 상대적으로 약하므로 고감도 검출기와 암실이 필요합니다.

팔라듐 포르피린의 흡수 피크는 약 410 및 532 nm이며, 532 nm의 제2 고조파 파장이 권장됩니다. 이 파장은 네오디뮴 YAG 펄스 레이저에 의해 생성되며, 레이저 빔을 도립 현미경에 연결하고 빔이 초점 평면의 중심을 비추도록 조정합니다. 레이저의 공간 분해능은 스폿 크기에 따라 결정되며, 이는 빔을 핀홀에 통과시켜 조정할 수 있습니다.

인광을 검출하기 위해 현미경에 롱패스 필터(long pass filter)와 광전증배관(photomultiplier tube)을 함께 장착하십시오. PMT는 적색 파장, 특히 700 nanometers 주변의 파장에 민감해야 합니다. 인광 신호를 샘플링하고 지수 함수를 적용하여 감쇠 시간 상수를 계산하십시오.

본 실험에서는 200 kilohertz에서 500개 지점을 샘플링하였습니다. 보정을 위해 산소 분압이 각각 150 mmHg와 0 mmHg인 두 가지 팔라듐 포르피린 용액을 준비하십시오. 0 mmHg 용액의 경우, 보정 중에 산소가 없는 조건을 만들기 위해 샘플에 1% dihi sodium을 첨가하십시오.

시료의 pH를 7.4로, 온도를 37°C로 유지하십시오. 마우스를 현미경 스테이지 위에 놓고, 간 미세혈관 순환을 시각화하려는 미세혈관이 레이저 스팟 지점에 오도록 조정하십시오. 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하룻밤 동안 둔 뒤, 아세트아미노펜 200 mg/kg을 복강 내로 투여하십시오. 투여 24시간 후 마우스를 마취하고 정중선 절개를 통해 간을 노출시킵니다. 간염이 발생했다면, 주변 중심부(paracentral region)의 괴사를 통해 육안으로 쉽게 확인할 수 있습니다.

마우스의 간 미세혈관 내 부분 산소압을 측정한 결과, portal veins, sinusoids, central veins의 평균 산소압은 각각 59.8, 48.2, 38.9 mmHg로 나타났습니다. 즉, portal vein에서 central vein으로 이어지는 산소 농도 구배는 적혈구가 sinusoids를 통과할 때 산소가 충분히 방출됨을 나타냅니다. 간 미세혈관 측정을 위해 아세트아미노펜으로 유도된 간염 마우스 모델을 준비하였습니다.

병리 모델의 예로, 아세트아미노펜 투여군이 정상 마우스에 비해 문맥, 동양혈관 및 중심정맥의 산소 분압이 더 높다는 것을 확인했습니다. 문맥과 중심정맥 사이의 산소 분압 차이는 정상 마우스의 경우 20.9 mmHg였으며, 간염 모델 마우스의 경우 16.9 mmHg였습니다. 문맥과 중심정맥 사이의 산소 분압 차이는 정상 마우스의 경우 20.9 mmHg였으며, 간염 모델 마우스의 경우 16.9 mmHg였습니다.

간 미세혈류의 산소 농도 경사는 주로 간세포에 의해 소비되는 문맥으로부터의 산소 공급으로 인해 발생합니다. 아세트아미노펜으로 인해 중심정맥 구역에서 발생하는 간세포 괴사는 산소 소비량 감소, 하류 미세혈류 및 그에 따른 혈역학적 문제를 초래합니다. 산소 공급과 산소 소비는 다양한 형태의 간 질환과 관련이 있습니다. 본 연구에서는 급성 간염 모델을 제작하였으며, 미세혈관 내 산소 분압의 증가를 확인하였습니다.

당사의 광학 시스템은 미세혈관 구조뿐만 아니라 혈류 분포 및 산소 소비량을 분석함으로써 생리학적 및 병리학적 기전을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.