Name: 신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 배우세요 폴리에틸렌 흡입 피펫을 이용한 형광 및 칼슘 감수성 염료 도입법을 통해 신경 활동을 시각화하는 간단하고 저렴한 기술을 익히세요. 이 방법은 정의된 신경 집단에 염료를 효과적으로 전달하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

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<p class="jove_content"&gt;이 작품은 국립 신경 장애의 연구소와 국립 보건원에서 뇌졸중의 교내 프로그램에 의해 지원되었다. 우리는 또한 메서드와 그림 3의 데이터에 대한 그의 이전 공헌 박사 조지 Mentis 감사드립니다.</p

형광등 dextrans은 해부 학적 도구로 및 이미징의 연결 활동 1-4 위해 사용되었습니다. 필드 외., 2009 년 4 모델 시스템으로 척수에 초점 axonal 책자로 이온 및 전압에 민감한 염료를 적용하기위한 프로토콜을 발표했다. 여기에서-체외 optophysiological 및 형태학의 연구를 위해 컷 복부 뿌리, 지느러미 뿌리 또는 척수의 넓이의 연결로 형광 및 / 또는 이온에 민감한 염료를 적용하기위한 자세한 절차를 설명합니다. 1. 타입 I과 타입 II의 Pipettes 테이퍼 팁과 pipettes를 생성하기 위해 알코올 램프 7 불꽃 위에 폴리에틸렌 튜빙의 두 단편 섹션 (PE90, 클레이 아담스 브랜드)을 벗어서 시작합니다. 한 피펫 (타입 I)은 단단히 대상 루트 또는 넓이를 (:; 내경 0.2-0.4 MM : 0.1-0.3 mm 외경) 저장할 수있는 작은 팁을 함께 (3-7밀리미터) 짧은이어야합니다. 그런 다음 두 번째 피펫 (Type을 끌어-II) 이상 (8~12센티미터) 얇고 축과 아주 좋은 팁 (외경과 : 0.2-0.3 mm, 내경 : 삽입할 수 0.1-0.2 ㎜) 타입 - 난만큼 피펫 그 끝. 두 번째 얇은 피펫은 타입-I 피펫에서 각각 인공 뇌척수 (aCSF)와 염료 솔루션을 대기음하고 소개하는 데 사용됩니다. 2. 의 위치 유형 - 전 피펫 해부 및 척수에게 8,9를 분리하고 로딩 과정 전반에 걸쳐 냉장 aCSF (~ 16 ° C)로 superfused 욕조,에 넣습니다. 타입-I는 다시 오프닝 쉽게 유연한 튜브를 통해 주사기 (1ml U-100 인슐린 주사기, Becton Dickenson 또는 비교)에 연결될 수 있도록 전극 홀더 (H1/12 전극 홀더, Narishige)에 피펫 (PharMed를 배치 BPT, 콜 - Parmer, # AY242002, 10 ㎝) (Fig.1A-B). 3. 염료 신청 <ol><li> 주사기를 사용하여 먼저 그리기유형 - 전 피펫 (Fig.1B, 2A)로 aCSF은 axonal 요로 또는 (그림 2B) 자필 서명하려면 루트로 따라갔다. 플렉시블 튜브 그런 다음 다시 개통에서 제거되어야합니다. 타입-II 피펫은 다른 주사기에 부착된 및 유형 - 전 axonal 요로 또는 루트 개최 피펫에 삽입됩니다. 그래서 잔여 aCSF 방금 axonal 요로 (; 2C-D Fig.1C)를 포함하는 타입-II 피펫, 기음 aCSF에 부착된 주사기를 사용합니다. 그런 타입-I 피펫에서 타입-II 피펫을 철회. axonal 요로이나 신경 좋은 도장을 확인하기 위해 몇 분 동안 aCSF 수준 ( &quot;좋은 씰&quot;에 대한 문제 해결에 제 3 항 참조) 모니터링합니다. </li><li> aCSF의 색소 또는 더블 증류수에 0.2 % 트리톤 X-100를 해산하고 기포를 포함하지 않도록 신경을 쓰는 동안 타입-II 피펫으로 그것을 그립니다. 유형 - 전 피펫으로하고 잔류 aCSF 솔루션 (그림의 2E)로 염료를 포함하는 타입-II 피펫을 넣습니다. 천천히 풀어부드러운 긍정적인 압력 (그림 2F)를 사용 aCSF에 염료. 모든 공기 방울을 소개하거나 팁 안쪽에서 대상 조직의 변위를 발생하지 않도록주의하십시오. 염료 충분한 양의 (염료 용액 3-5 μL) 출시 이후 타입-II 피펫을 철회. </li></ol> 4. 잠복 실험의 종류에 따라 6-20시간 사이 어둠 속에서 조직을 품어. 일단 충분한 시간 충전에 허용되어 부드럽게 영상이나 조직학을위한 조직 준비 떠난 조직에서 전극을 멀리 당기십시오. 문제 해결 <ol><li> 대상 조직의 유형 - 내가 피펫의 일각에 쉽게 입력하거나 한 내부 헐거워되지 않으면 다음 팁 직경은 잘못된 크기입니다. 이런 경우 뽑아 다른 피펫을 사용합니다. </li><li> 타입-I 피펫의 aCSF에 염료를 추가하기 전에 충분한 aCSF는 그것에 도달할 수 있도록 남아 있는지 확인타입-II 피펫 팁 (그림 2D). 염료가 추가되면 그렇지 않으면, 에어 갭이 존재합니다. 이런 경우 염료를 추가하고 피펫에서 axonal 요로를 제거한 다음 유형-II 피펫에 의해 도달할 수있는 충분한 aCSF으로 다시 그려하지 않습니다. </li><li> 타입-I 피펫 증가에 aCSF 수준이 그것이 타입-II 피펫으로 aspirated되자면 조직과 인감이 좋지 않다는 것을 의미합니다. 다른 전극을 사용, 그렇지 않으면 염료가 라벨 과정에서 희석됩니다. </li><li> 염료를 주입하면서 공기 방울이 유형 - 전 피펫으로 도입되면, 풍선에 타입-II 피펫 팁 주변을 발전 부드럽게 연결된 주사기를 사용하여 약한 부정적인 압력을 적용하여 거품을 배수. </li></ol> 5. 대표 결과 방법의 응용을 설명하기 위해서, 우리는 동시에로드 motoneurons, 감각 afferents 세 가지 dext와 척수 interneurons형광 염료 (그림 3A) 복합 조사 했어요. 다른 이름으로 그림 그림. 신경 세포의 3B, 세 강좌로 분류되며, 관능 afferents (적색), 복부 삭조 (녹색)과 motoneurons (파란색)으로 돌출 interneurons. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> 1 그림. 개략도 피펫을 보여주는 타입 I과 타입 II 조립. () 타입 - 나는 그것이 개통이 쉽게 유연한 엘라스토머 튜브 (B)에 연결하고있는로 타입 II 피펫은 (C) 삽입될 수 돌아와요 있도록 피펫 (하늘색)는 전극 홀더에 배치됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> 그림 2. 도식은 형광 염료와 motoneurons의 로딩 과정을 보여주고 있습니다. () 타입-I의 피펫은 자필 서명 복부 루트 근처에 위치합니다. (B) 흡입이 루트 다음에 피펫으로 aCSF을 그릴 수있는 피펫에 적용됩니다. (C-D) 종류 - 내가 피펫의 백엔드에서 유연한 엘라스토머 튜브를 분리하고 타입-II 피펫으로 흡입을 적용하여 aCSF의 양을 줄일 수 있습니다. (E) 타입-I 피펫의 나머지 aCSF에 녹아있는 염료를 포함하는 타입-II 피펫의 팁을 넣습니다. (EF) 천천히 염료와 유형 - 전 피펫을 채울 후 타입-II 피펫을 제거합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> 그림 3. 고립된 마우스 척수로 작성 절차의 응용. () 도식이 보여주는 세 가지 유형 - 전 척수의 연결에서 다른 클래스를 작성하는 데 사용 pipettes.에게 Motoneurons (파란색, 캐스케이드 블루 dextran)와 성례의 감각 afferents (적색, 텍사스 - 빨강 dextran)은 각각 복부와 지느러미 뿌리를 통해 backfilled되었다. 플루오레신 dextran은 누구의 axons 복부 삭조 (VF)를 통해 승천 척추 interneurons를 (녹색)로드하는 데 사용되었습니다. 각 dextran 염료의 1 밀리그램 (10,000 MW, 분자 프로브)6 μL 증류수는 0.2 %를 포함에 녹아되었다 트리톤 X-100 (B). 라벨 감각 afferents 몇 contralateral 전망과 주로 ipsilateral 것을 A. 노트에 설명된대로 뉴런은 백 라벨이 붙지만하는 척수의 성례의 코드에서 섹션 공촛점 이미지입니다. 표시된 interneurons는 채우기의 측면 (화살표 머리)에 contralateral 반면 표시된 motoneurons이 가득한 복부 루트에 ipsilateral 있습니다. 200 μm의 보정 바.

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</ol>

<p class="jove_content"&gt; 우리는 공개 할게 없다.</p

<p class="jove_content"&gt; 여기 뉴런, 신경 및 척수의 책자로 염료를 도입을위한 간단하고 비용 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 로딩 과정의 기간 동안 고도의 농축 염료 용액에 확인된 해부 학적 경로를 노출하는 것입니다. 약간의 배경과 대상 사이트의 역행 라벨이 결과 microinjections, 욕조 응용 프로그램과 electroporation 기술에 비해. 그러나 방법은 axons의 넓이는 격리 수 신경계의 사이트로 제한됩니다. 염료가 세포 기관에 도달 axons 따라 주워 나타나기 때문에 또한,, 로딩 시간의 연결을 somata에 염료 응용 프로그램의 사이트에서 거리에 따라 달라집니다. 이하 이상<em&gt; 체외에서</em&gt; 조건이 axonal 책자의 길이는 몇 mm로 방법을 제한합니다.</p&gt;<p class="jove_content"염료 로딩의이 유형&gt; 응용 motoneurons의 역행 라벨링 및 정상과 돌연변이 생쥐의 감각 afferents의 anterograde 라벨 포함<sup&gt; 10,11</sup&gt...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td colspan="2"<strong&gt; 자재 명칭</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;<td<strong&gt; 코멘트</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="2"&gt; 튜브</td&gt;<td&gt; PE90 (IDxOD : 0.034 &quot;x0.050&quot;; 벽면 Thikness : 0.008 &quot;)</td&gt;<td&gt; 클레이​​ 아담스 브랜드 Intermedic</td&gt;<td&gt; 427,421</td&gt;<td&gt; 타입 I &amp; II 타입 pipettes위한</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NSF-51 (IDxOD : 1/16x1/8, 벽면 Thikness : 1 / 32)</td&gt;<td&gt; PharMed BPT, 콜 - Parmer</td&gt;<td&gt; AY242002</td&gt;<td&gt; 플렉시블 튜빙의 경우</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 주사기</td&gt;<td&gt; 1ml 인슐린 주사기 U-100</td&gt;<td&gt; Becton Dickenson</td&gt;<td&gt; 329,650</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 니들</td&gt;<td&gt; 19G 1 개-1 / 2 &quot;메탈 허브 니들</td&gt;<td&gt; MONOJECT</td&gt;<td&gt; 200,136</td&gt;<td&gt; 주사기로 타입 II 피펫 연결하기</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; 알콜 램프</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 꼭지</td&gt;<td남성 Luer 슬립 어댑터&gt; 세 방향 꼭지</td&gt;<td&gt; 박스터 헬스케어 주식 회사</td&gt;<td&gt; 2C6241</td&gt;<td&gt; 주사기와 함께 사용</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="3"&gt; 홀더</td&gt;<td&gt; H-1 전극 홀더</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; H-1/12</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 자석 스탠드</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; GJ-8</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Micromanipulator</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; M-3333</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 족집게</td&gt;<td&gt; S &amp; T 뒤몽 스위스 00632-11</td&gt;<td&gt; 뒤몽</td&gt;<td&gt; JF-5 TC</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"&gt; *들은 제안 자료입니다. 어떤 호환 제품으로 교체할 수 있습니다</p

신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

뉴런의 역행 라벨은 또한 뉴런 3-6 칼슘 및 전압에 민감한 염료를로드하는 데 사용되었습니다 표준 해부 방법 1,2입니다. 일반적으로 염료는 고체 크리스털이나 유리 pipettes를 사용하여 로컬 압력 주입에 의해 적용됩니다. 그러나 이것은 몇 시간이 염료 확산이 필요합니다 특히 때 염료 및 감소 라벨 강도의 희석이 발생할 수 있습니다. 여기 염료 용액으로 가득 폴리에틸렌 흡입 피펫을 사용하여 뉴런으로 형광등 및 이온에 민감한 염료를 도입을위한 간단하고 저비 용의 기술을 보여줍니다. 이 방법은 로딩 과정 전반에 걸쳐 axons과 접촉 염료의 높은 농도를 유지하는 안정적인 방법을 제공합니다.

우리는 뉴런이나 폴리에틸렌 흡입 피펫을 사용하여 모든의 연결을 요로에 형광등과 칼슘에 민감한 염료의 높은 농도를 도입을위한 간단하고 저렴한 비용으로 기술을 설명합니다.

뉴런의 역행성 표지는 표준적인 해부학적 방법이며1,2, 뉴런 내에 칼슘 및 전압 민감성 염료를 주입하는 데에도 사용되어 왔습니다3-6. ...

본 절차의 전반적인 목표는 간단하고 저렴한 기술을 사용하여 뉴런이나 신경 경로에 고농도의 형광 또는 이온 민감성 염료를 주입하는 것입니다. 이를 위해 먼저 두 가지 유형의 피펫, 즉 유형 1과 유형 2를 제작합니다. 그런 다음 유연한 엘라스토머 튜브를 유형 1 피펫에 연결하고 양압을 가해 대상 신경 경로를 유형 1 피펫 안으로 끌어당긴 후, 밀봉이 제대로 되었는지 확인합니다.다음으로, 타입 1 피펫 안에 타입 2 피펫을 삽입하고, 타입 2 피펫을 사용하여 타입 1 피펫에 남아 있는 A CSF를 흡입합니다. 그런 다음 타입 1 피펫에 염료를 주입하되, 공기 방울이 들어가지 않도록 합니다. 마지막 단계로, 뉴런을 암소에서 6~20시간 동안 배양합니다.최종적으로 타입 1 피펫을 제거하면, 준비된 시료를 in vitro, 전기생리학적 또는 형태학적 연구에 사용할 수 있습니다. 배스 어플리케이션(bath application), BOS 주입 및 전기천공법(electroporation)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 D를 특정 뉴런 집단에 전달할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 특정 뉴런의 활성, 연결성, 형태 및 분포와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로 이 기술은 숙련이 필요하며, 특히 1형 피펫 내부에서 염료가 희석되지 않도록 하고 공기 방울이 유입되지 않도록 주의해야 합니다. 먼저 알코올 램프의 불꽃 위로 폴리에틸렌 튜브를 늘려 끝이 가늘어지는 두 개의 짧은 피펫을 만들어 이 절차를 시작하십시오. 우선 대상 뿌리나 신경로를 단단히 고정할 수 있도록 끝이 작은 짧은 1형 피펫을 하나 만듭니다.다음으로, 더 길고 가느다란 샤프트와 1형 피펫의 끝까지 삽입할 수 있는 매우 미세한 팁을 가진 2형 피펫을 준비합니다. 그 후, 2형 피펫을 EC 클립이 달린 19 gauge 바늘에 연결합니다. 그런 다음 분리된 척수를 배스에 넣습니다.로딩 과정 전반에 걸쳐 냉각된 A CSF로 과융합하십시오. 그 후, 타입 1 피펫의 뒷면 개구부를 유연한 튜빙을 통해 시린지와 쉽게 연결할 수 있도록 전극 홀더에 배치하십시오. 이 절차에서는 먼저 시린지를 사용하여 타입 1 피펫 안으로 CSF를 흡입합니다.다음으로, 채울 축삭로 또는 신경근을 그립니다. 그런 다음 뒷면 개구부에서 유연한 튜브를 제거합니다. 그 후, 2형 피펫을 다른 주사기에 연결합니다.현미경 아래에서 축삭로 또는

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

칼슘은 시냅스 강도 신경 전달 물질 릴리스 및 변경 실행을위한 필수적인 신경 시스템에 유비 쿼터스 메신저입니다. 여기 + - 지표 Drosophila 신경 터미널에 칼슘이 로딩을위한 기술을 보여줍니다. 우리는 또한 필요한 장치의 제조를 설명하고 기술의 성공을위한 중요한 포인트를 강조.

칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

형광 염료의 역행 전송 해부학 적 투사에 따라 신경 세포의 하위 인구 레이블. 레이블 축삭은 시각적 대상이 될 수...

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

출처: Inal, M. A. et. al., Retrograde tracing of Drosophila Embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes(유성필 형광 염료를 사용한 {{}}초파리{{}} 배아 운동 뉴런의 역행 추적. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 친유성 염료를 사용하여 Drosophila 운동 뉴런의 역행 표지 방법을 보여줍니다. 염료는 축삭돌기로 들어가 역행적으로 이동하고 뉴런을 녹색으로 표시하여 컨포칼 현미경 하에서 뉴런의 형태와 투영을 자세히 시각화할 수 있습니다.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes (형광 친유성 염료를 사용한 초파리 운동 뉴런의 역행 라벨링)

출처: Wang, J., et al. 면역형광 및 신경 추적을 통한 쥐 두개골 경막의 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 면역 반응성 신경 분포 시각화.J. Vis. Exp. (2021).   이 영상은 형광 현미경을 사용하여 경막에서 감각 뉴런의 기원을 추적하는 방법을 보여줍니다. 역행 추적자가 마취된 쥐의 노출된 경막에 도입됩니다. 추적자는 감각 신경 축삭돌기에 의해 흡수되어 삼차신경절(trigeminal ganglion)과 경추 등뿌리 신경절(cervical dorsal root ganglia) 내의 세포체로 역행하여 이동합니다. 그런 다음 신경절을 절편화하고, 세포체에서 추적자와 뉴로펩티드를 표시하는 항체로 염색하고, 감각 뉴런의 신경절 기원을 확인하기 위해 형광 현미경을 사용하여 분석합니다.

형광 현미경을 사용한 경막의 감각 뉴런의 기원 조사

우리는 축삭돌기 및 미엘린 손상의 역학을 실시간으로 동시에 시각화하기 위해 이광자 여기 타임 랩스 현미경을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 제안된 프로토콜은 손상 후 중심 수초화된 축삭돌기의 운명에 영향을 미치고 영구적인 임상적 장애에 기여할 수 있는 내적 및 외적 요인에 대한 연구를 가능하게 합니다.

전의 VIVO 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

여기에서는 칼슘에 민감한 염료를 개구리 신경 그루터기를 통해 신경 종말로 삽입하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 말초 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상의 기록과 분석을위한 프로토콜을 제시합니다.

칼슘 염료를 개구부 신경 절편에 삽입하기 : 신경 개구부를 통해 개구리 신경 근육 계통에서 칼슘 과도 등록

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

배우세요 폴리에틸렌 흡입 피펫을 이용한 형광 및 칼슘 감수성 염료 도입법을 통해 신경 활동을 시각화하는 간단하고 저렴한 기술을 익히세요. 이 방법은 정의된 신경 집단에 염료를 효과적으로 전달하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드

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