신경, 책자, 그리고 형광 염료와 척수 뿌리 역행로드

본 절차의 전반적인 목적은 간단하고 저렴한 기술을 사용하여 뉴런 또는 모든 신경 경로에 고농도의 형광 또는 이온 민감성 염료를 도입하는 것입니다. 이는 먼저 타입 1과 타입 2의 두 가지 유형의 피펫을 제작함으로써 달성됩니다. 그런 다음 타입 1 피펫에 유연한 엘라스토머 튜브를 연결하고 양압을 가해 대상 신경 경로를 타입 1 피펫 내부로 끌어당기며, 이때 밀봉이 제대로 되었는지 확인합니다.

다음으로, type one 피펫 안에 type two 피펫을 삽입하고, type two 피펫을 사용하여 type one 피펫에 남아 있는 A CSF를 흡입합니다. 그런 다음 기포가 생기지 않도록 주의하며 type one 피펫에 염료를 주입합니다. 마지막 단계로 뉴런을 암소에서 6~20시간 동안 배양합니다.

최종적으로 타입 1 피펫을 제거하면, 준비된 시료를 사용하여 인비트로(in vitro), 전기생리학적 또는 형태학적 연구를 수행할 수 있습니다. 배스 어플리케이션(bath application), BOS 주입 및 전기천공법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 D를 특정 뉴런 집단에 전달할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 특정 뉴런의 활성, 연결성, 형태 및 분포와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

일반적으로 이 기술은 숙련이 필요하며, 특히 type one 피펫 내부에서 염료가 희석되지 않도록 하고 기포가 유입되지 않도록 주의해야 합니다. 알코올 램프의 불꽃 위로 폴리에틸렌 튜브를 당겨 팁이 테이퍼진 두 개의 짧은 피펫을 제작하여 이 절차를 시작하십시오. 먼저, 대상 뿌리나 신경관을 단단히 고정할 수 있도록 팁이 작은 짧은 type one 피펫을 당겨 만듭니다.

다음으로, 팁 부분까지 타입 1 피펫 내부에 삽입할 수 있을 정도로 샤프트가 더 길고 가늘며 팁이 매우 미세한 타입 2 피펫을 준비합니다. 그 후, 타입 2 피펫을 EC 클립 19 gauge 바늘에 연결합니다. 그런 다음 분리한 척수를 배스(bath)에 넣습니다.

로딩 과정 내내 냉각된 A CSF로 지속적으로 세척하십시오. 그 후, 1형 피펫의 뒷면 개구부를 유연한 튜브를 통해 시린지에 쉽게 연결할 수 있도록 전극 홀더 위에 배치하십시오. 이 과정에서는 먼저 시린지를 사용하여 1형 피펫 안으로 CSF를 흡입합니다.

다음으로, 채워질 축삭 경로 또는 신경근을 그립니다. 그런 다음 후면 개구부에서 유연한 튜브를 제거합니다. 그 후, 2형 피펫을 다른 주사기에 연결합니다.

현미경 하에서 축삭로 또는 신경근을 잡고 있는 1형 피펫에 이를 삽입합니다. 2형 피펫에 연결된 주사기를 사용하여 A CSF를 흡입하여, 잔류 A CSF가 축삭로를 겨우 덮을 정도가 되게 합니다. 그런 다음 1형 피펫에서 2형 피펫을 제거합니다.

축삭 경로 또는 신경의 밀봉 상태가 양호한지 확인하기 위해 몇 분 동안 A CSF 수위를 모니터링하십시오. 그 후, 염료를 A CSF 또는 증류수에 희석한 0.2%Triton X 100에 용해하십시오. 부착된 시린지에 약한 음압을 가하여 이를 2형 피펫으로 흡입하되, 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오.

그 다음, 염료가 들어 있는 2형 피펫을 잔여 A CSF 용액에 삽입합니다. 1형 피펫 내의 A CSF로 염료를 천천히 방출하며, 이때 시린지에 부드럽게 양압을 가합니다. 공기 방울이 유입되거나 팁 내부에서 표적 조직이 밀려나지 않도록 주의하십시오. 염료를 주입하는 동안 1형 피펫에 공기 방울이 유입된 경우, 2형 피펫 팁을 공기 방울 가까이 이동시킨 후 연결된 시린지를 사용하여 약한 음압을 부드럽게 가함으로써 공기 방울을 제거합니다.

충분한 양의 염료가 방출되면, 타입 2 피펫을 제거합니다. 다음으로, 실험 종류에 따라 조직을 암소에서 6~20시간 동안 배양합니다. 충전 시간이 충분히 경과하면, 조직에서 전극을 조심스럽게 뽑아냅니다.

그 후 조직은 이미징 또는 조직학적 분석을 위한 준비가 완료됩니다. 다음은 세 가지 서로 다른 덱스트란 결합 형광 염료를 운동 신경세포, 감각 구심성 신경 및 척수 중간 뉴런에 동시에 주입하는 과정을 나타낸 모식도입니다. 운동 신경세포와 천수 감각 구심성 신경에는 각각 복측 및 배측 신경근을 통해 Cascade blue Dextran과 Texas red dextran을 역행성 주입하였습니다. 녹색 형광 덱스트란은 축삭이 복측 삭을 통해 상행하는 척수 중간 뉴런에 주입되었습니다.

여기에 뉴런이 역방향 표지된 천수 척수 절편의 공초점 이미지가 제시되어 있습니다. 표지된 감각 구심성 뉴런들이 주로 동측에 분포함을 확인하십시오. 몇몇 대측 투사 영역을 제외하고, 표지된 운동 뉴런들은 충전된 전근의 동측에 위치하는 반면, 표지된 중간 뉴런들은 화살표로 표시된 바와 같이 전근의 대측에 위치합니다.

본 절차 이후에, DI 영역 뉴런의 기능적 연결성, 흥분성 및 억제성, sinus 유형, 분포 및 신경전달물질 생성과 같은 주요 질문에 답하기 위해 추가적인 방법이 수행될 수 있습니다. 이 기술은 척수 및 뇌줄기 신경생리학 분야의 연구자들이 이온 민감성 염료를 사용하여 특정 뉴런 집단을 방출시킬 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 분리된 척수의 뉴런과 감각 섬유에 형광 및 이온 민감성 염료를 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.