알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

본 절차의 목적은 마우스에서 Val Boomin으로 유도된 알레르기성 기도 염증 과정 동안 폐 수지상 세포(dendritic cell 또는 DC)의 성숙과 이동을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 Val Boomin으로 마우스를 감작시킨 후, fitsy 표지 Val Boomin으로 기도를 자극함으로써 수행됩니다. 그 다음, 폐와 종격동 림프절을 채취합니다.

마지막으로, 폐와 림프절 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 최종적으로, FITC Val Boomin 자극 후 종격동 림프절에서 발견되는 폐 수지상 세포의 성숙 상태와 절대 세포 수를 유세포 분석법으로 평가할 수 있습니다. 이 방법은 수지상 세포가 항원 노출에 따라 성숙 과정을 거치는지, 그리고 배수 림프절로 이동하는지 등 폐 면역 반응에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그리고 만약 이동한다면, 그 이동 속도가 얼마인지 확인합니다. 볼텍싱을 하며 알루미늄 튜브에 갓 준비한 Val Boomin 용액을 1:1 비율로 한 방울씩 첨가하는 것으로 시작하십시오. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 1 mL 주사기에 혼합물 0.2 mL를 채웁니다.

한쪽 손의 엄지와 검지를 사용하여, 두개골 기저부 근처의 목덜미 부분을 잡아 주입할 마우스를 고정합니다. 그런 다음 다른 손을 사용하여 마우스의 복강 내에 Val Boomin 알럼 용액을 주입합니다. 알럼 내 Val의 두 번째 주입 7일 후, 알럼으로 감작되어 마취된 동물을 똑바로 세운 자세로 잡고, 멸균 피펫 팁을 사용하여 갓 조제한 val in fxi 용액 100 µL를 마우스의 NAS 위에 한 방울씩 떨어뜨려 피펫팅합니다.

먼저 20게이지 카테터를 1mL 주사기에 연결합니다. 그다지 마우스의 안락사가 확인되면, 마우스 기관을 노출시키고 캐뉼라를 삽입하기 위해 동물의 흉강을 목까지 완전히 엽니다. 폐를 세척하고 심장을 관류하여 말초혈액에 존재하는 모든 오염된 폐포 대식세포와 단핵구를 확실히 제거하는 것이 매우 중요합니다.

다음 두 단계는 주의 깊게, 그리고 반드시 손을 안정시킨 상태에서 수행하십시오. 이제 카테터를 통해 얼음처럼 차가운 EDTA 함유 PBS를 세 번 투여하여 하기도를 헹구고 폐포 공간에서 세포를 제거합니다. 그다음, 20 gauge 바늘을 장착한 10 milliliter 주사기를 사용하여 심장의 우심실을 통해 헤파린이 포함된 PBS 10 milliliters로 폐를 관류합니다.

폐 혈관계에서 남아 있는 모든 혈구를 제거하여 폐가 하얗게 변하면 제거가 완료된 것으로 간주합니다. 다음으로, 종격동 림프절을 제거하여 별도의 접시에 담습니다. 조직의 빛 노출을 최소화하여 형광 소광을 방지하십시오.

그 후 관류된 폐를 적출하여 페트리 접시에 넣고 가위로 폐를 잘게 다집니다. 다음으로 37 °C에서 250 units/mL의 collagenase D를 사용하여 폐 조직을 소화시킵니다. 25분간 배양한 후, 혼합물에 EDTA를 첨가하여 5분 동안 collagenase 활성을 정지시킵니다. 마지막으로 소화된 폐 조각들을 100 µm 세포 여과기에 통과시킨 후 저장성 완충액으로 적혈구를 용해시킵니다.

미세 바늘을 사용하여 종격동 림프절을 분리하고, 폐 조직에서 시연한 것과 동일하게 콜라게나아제로 소화시킨 후, 복강 내 투여, 감작 및 기도 내 투여를 거친 조직을 세포 여과기에 걸러줍니다. 염증 세포의 존재 여부는 대조군 및 실험군의 대표적인 폐 절편에서 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통해 평가할 수 있습니다.

식염수를 처리한 동물들의 경우, 상단 이미지에서 확인되는 바와 같이 조직에 염증이 없습니다. 이와 대조적으로, 하단 이미지에서 볼 수 있듯이 감작 및 자극을 준 동물의 Val 폐 절편 전체에 걸쳐 염증 세포가 퍼져 있습니다. 하단 이미지에 나타난 것처럼, 점액 생성을 평가하기 위해 주기산-시프(periodic acid shift) 염색을 사용할 수 있습니다.

Val로 감작된 생쥐에서 Val 도전 후 기도 알레르기성 염증의 유도는 점액의 존재로 확인됩니다. 반대로, 상단 그래픽에 나타난 바와 같이 식염수를 처리한 대조군 생쥐에서는 점액 생성이 완전히 나타나지 않습니다. Val 도전 후 폐의 dcs는 성숙을 거쳐 배출 림프절로 이동합니다.

마우스 종격동 림프절의 대표적인 분석 결과, 식염수 처리군과 비교하여 Val Boomin으로 감작 및 유발된 동물에서 CD 11 C 양성 세포의 비율이 완만하지만 일관되게 증가하는 것이 확인되었습니다. 또한, 감작 및 유발된 마우스의 종격동 림프절에서 CD 11 C 양성, CD 11 B 양성, Val Boomin fits C 양성 세포의 절대 세포 수를 분석한 결과, 식염수 처리군에 비해 유발군에서 수지상 세포(DC) 수가 수 배 더 크게 증가하는 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 폐 수지상 세포의 성숙 및 이동을 분석하는 당사의 기술에 대해 충분히 이해할 수 있을 것입니다.

이 기술을 충분히 숙달하면, 다른 병원체나 기타 실험적 요인에 대한 폐 수지상 세포의 반응을 평가하기 위해 이 방법을 수정하여 적용할 수 있습니다.