Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

다음 실험의 전반적인 목표는 재생 중 생체 내에서 줄기세포 및 자손 행동을 분석하기 위해 혈관 내 줄기세포 절제 조직에 인접한 건강한 줄기세포 집단을 배치하는 것입니다. 이것은 추가 조작을 위해 un irradiod 또는 Leafly irradiated parian을 마취하고 고정시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 고정된 un 방사선 조사된 파리안은 납으로 부분적으로 차폐된 다음 X선에 조사되어 줄기세포가 절제된 조직과 줄기세포가 함유된 상태로 남아 있는 차폐된 조직과 병치된 손상되지 않은 파리안을 생성합니다.

대안적으로, 방사선 조사되지 않은 기증자로부터 채취한 조직 이식편을 이전에 방사선 조사된 숙주에 이식하여 분리된 줄기세포 집단을 가진 파리안을 생산할 수 있습니다. 그렇지 않으면 줄기 세포 내에 존재하는 Fally. 줄기세포 마커 유전자에 대한 whole mount RNA in situ two hybridization에 의해 줄기세포 절제 조직에 인접한 고립된 줄기세포 집단을 보여주는 절제 숙주 결과를 얻습니다.

따라서 여기에 설명된 방법은 이식 패러다임과 부분 방사선 조사 패러다임 모두에서 줄기세포의 거동을 연구하여 재생 플라나리아를 더 잘 이해하는 것을 목표로 하며, 이를 통해 주변 조직과 이러한 줄기세포가 존재하는 지역 환경이 이러한 신세포세포 또는 줄기세포의 행동에 영향을 미치거나 영향을 미치는지 여부를 테스트할 수 있습니다. 재생 과정에서 실험 1-2개월 전에 동봉된 원고에 따라 플린에 먹이를 줍니다. 이 데모에서 원하는 크기를 얻기 위해 길이가 1-2cm이고 너비가 2mm보다 넓은 플린을 선택합니다.

그런 다음 사용하기 3-7일 전에 굶어 죽입니다. 다음으로, 클로로 톤 용액을 파리안 물에 부피 클레온당 0.1-0.2%중량을 용해시켜 가벼운 국소 마취제를 준비합니다. 그런 다음 분젠 버너로 조직 이식을 위해 얼음에 용액을 식히고 이식 조직을 절단하기 위해 끝에서 1-2cm로 내부 직경이 0.75mm인 모세관 튜브를 90도 각도로 구부립니다.

그런 다음 외경이 0.7mm인 다른 모세관 끝을 1-2cm 각도로 90도 각도로 구부려 이식편을 받을 호스트에 구멍을 만듭니다. 다음으로, 검은 여과지를 자릅니다. 셋째, 여과지 김 물티슈와 담배 롤링 페이퍼를 동봉된 원고에 표시된 크기에 따라 작성하십시오.

그 후, 변형 된 Holt Fers 용액과 Caine 포화 Holt Fretter 용액을 준비합니다. 둘 다 섭씨 4도로 식히십시오. 그런 다음 접힌 Kim 물티슈를 Paraform의 사각형에 부착합니다.

해부 현미경 아래의 Peltier 냉각기 플레이트 또는 기타 냉각 장치에 놓습니다. 그런 다음 Kim wipe를 식힌 Holt Fretter 용액으로 포화시킵니다. 그런 다음 Kim wipe에 두 개의 검은색 여과지 사각형을 놓습니다.

이제 Watman 2번 여과지 조각을 페트리 접시에 넣습니다. 여과지를 Holt Fretter 용액으로 적십니다. 그런 다음 부분 방사선을 위해 얼음에 접시를 식힙니다.

조직 이식과 유사한 더 큰 접시에 더 큰 종이 라이너를 놓습니다. 여과지를 Holt Fretter 용액으로 적십니다. 그런 다음 얼음에 접시를 식히십시오.

이 절차에서는 페트리 접시에 식힌 클레온 용액을 채웁니다. 이식을 위해 Planaria를 접시에 피펫으로 넣습니다. 한 번에 하나의 숙주와 한 명의 기증자만 마취하십시오.

부분 방사선 조사의 경우 많은 동물을 한 번에 마취시킬 수 있습니다. 그런 다음 파리아가 움직이지 않을 때까지 5-10분 동안 클레온 용액에 담그십시오. 식힌 Holt Fretter 용액을 채운 접시에 파이펫으로 파리아를 헹굽니다.

그 후, 식힌 Holt 프레터 용액으로 포화된 검은색 여과지에 플린 영역을 피펫으로 삽입하여 고정시킵니다. 그런 다음 한 쌍의 집게로 복부 쪽이 아래를 향하도록 합니다. 이제 이전에 준비한 식힌 페트리 접시를 상단 소스 X선 조사기 안에 들어갈 얼음 양동이에 넣습니다.

검은색 여과지를 움직여 페트리 접시에 마취된 플린 영역을 정렬합니다. 그런 다음 X선 조사기(X-ray irradiator)를 상단 소스로 옮기고 음극관에서 파리아까지의 거리가 최소화되도록 얼음 양동이를 배치합니다. 따라서 효과적인 투여량을 확대합니다.

그런 다음 X-ray 투여를 위해 paria와 cathode tube 사이에 lead shields를 배치합니다. 차폐되지 않은 영역에서 완전한 줄기세포 절제가 필요한 경우 30개 이상의 그레이를 제공합니다. X선 방출 직후, 파리안을 차가운 파리안 물에 옮깁니다.

그런 다음 파리안 물을 실온으로 데우고 동물들이 검은색 여과지에서 벗어나도록 합니다. 이것으로 부분 조사 절차가 완료되었습니다. 해부 현미경에서 이 절차를 시작하려면 마취된 숙주와 공여체 플린 영역을 펠티에 또는 쿨러 플레이트에서 이미 냉각된 Kim wipe의 별도의 직사각형 검은색 필터에 정렬합니다.

0.75mm 내경의 모세관 튜브를 사용하여 기증자로부터 이식편 플러그를 잘라냅니다. 그런 다음 한 쌍의 집게를 사용하여 호스트의 방해가 되지 않는 부분에 놓습니다. 그런 다음 0.7mm 외경의 모세관 튜브를 사용하여 호스트에서 플러그를 제거합니다.

그런 다음 이식편을 구멍에 배치하십시오. 직사각형 검은색 여과지에 이식된 숙주를 이전에 준비한 페트리 접시에 옮깁니다. 롤링 페이퍼 한 장을 Caine이 포화된 Holt Fretter 용액으로 적십니다.

그런 다음 이식된 숙주 위에 놓습니다. 다음으로, 포화 홀터 용액을 감싸는 여과지 4개를 담그고, 이식된 숙주 잠수함이 이후에 4개의 절단 뭉치를 담그는 경우, Kim 닦음 포화 Holt Fretter 용액을 담그십시오. 여과지 위에 놓으십시오.

그런 다음 뚜껑을 닫으십시오. 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 회복과 재생을 위해 기증자 파리안을 파리안 물로 옮깁니다.

모든 이식이 완료되면 이식된 파리안을 섭씨 10도의 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다. 다음 날 아침, 파리안 물을 채운 페트리 접시에 옮깁니다. 파리안이 여과지에서 스스로 떨어지도록 하거나 집게로 부드럽게 제거하고 그 후 2-3일에 한 번씩 파리안 물을 갈아줍니다.

방사선 조사 후 3일 동안 고정된 방사선 조사되었지만 완전히 차폐된 대조군 파리안의 홀 마운트 현장 교잡은 야생형 파리안과 구별할 수 없는 줄기세포 분포를 보여줍니다. 반면에, 부분적으로만 차폐된 파리안의 경우, 노출된 전방 및 후방 부분을 남겨두면 줄기세포가 차폐되지 않은 영역에서 절제된 것으로 보입니다. 다음은 성공적으로 이식된 파리안의 등쪽과 복부 모습을 보여줍니다.

이식 3일 후, 이식편은 등쪽 표면과 복부 표면 모두에서 명확하게 볼 수 있으며 이식편 숙주 경계면에서 특징적인 색소가 없는 조직으로 둘러싸여 있습니다. 그러나 실패한 이식은 이식 부위에 눈에 보이는 이식 조직을 보여주지 않습니다. 전체 마운트 제자리 교잡은 이식 위치 내부 또는 주변에서만 줄기세포의 존재를 드러냈으며, 이는 일단 마스터된 이식의 성공을 나타냅니다.

이식은 각각 5분 이내에 완료할 수 있습니다. 성공률이 90%에서 100%에 육박하고 부분 조사는 크게 확대될 수 있습니다. 조사기의 필드 크기가 충분히 크다고 가정합니다.