Name: 의 분자 메커니즘의 특성 생체에 UVR 유도 백내장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: 배우세요 자외선으로 쥐 백내장을 유도하고 정량적 RT-PCR 및 면역조직화학으로 분자 메커니즘을 분석하는 방법을. 이 실험 모델은 백내장 형성 연구에 활용됩니다.

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S 엉터리 Drottning Viktorias Frimurarstiftelse :이 작품은 Karolinska Institutet 아이에게 자금, 스웨덴어 방사선 보호 기관, Karolinska Institutet 안구 연구 재단, 총 엉터리 Bertil Stohnes Stiftelse, 세인트 에릭의 눈 병원 연구 재단, Ögonfonden, Konung 구스타프 V에 의해 지원되었다.

1. 자외선 방사선에 노출 <ol><li> 15 분 노출되기 전에, 90 밀리그램 / kg Ketalar (케타민)와 intraperitoneal 주사로 10 밀리그램 / kg Rompun (xylazine)의 혼합물 여성 Sprague-Dawley 쥐를 마취. </li><li> 쥐 restrainer에서 동물을 놓고 트렁크 짜 13 발생하지 않고 쥐의 고정까지 벨트를 조이십시오. </li><li> mydriasis를 유도 할 수있는 쥐의 두 눈에 Mydriacyl (tropicamide), 10 MG / ML을 심어. </li><li> 그 한쪽 눈이 절반이 최대 10 nm의 전체 폭이 300 nm의 14 UVR의 좁은 빔에 대해 위치 될 수 있도록 동물을 놓고 검은 색 테이프 contralateral 눈을 보호. </li><li> 15 300 nm의 분 15에서 쥐 일방적으로 하위 임계 복용 한 kJ / m 2 UVR-B을 쉽게받을 수 있습니다. </li></ol> 2. 해부 <ol><li> 미리 정해진 후 노출 간격 (1, 5, 24 및 120 시간) 후, carbo하여 육주 늙은 쥐 (체중 &lt;200g)를 희생N 개의 이산화 질식과 경추의 전위. </li><li> 명백히하다 눈. 이후, 아래 뒤쪽면을 눈 각막을 넣어. 그런 다음, 펀치 27 게이지 캐뉼라를 적용하고 공막에서 매우 가깝습니다 렌즈 손상을 방지하기 위해 공막에 tangentially 밀어로 최소한의 구멍. 그런 다음 공막의 뒤쪽 부분을 들어 올려 수있을 때까지 그냥 limbus 뒤에 원주 잘라 안과 수술 가위를 사용합니다. 그런 다음, 무딘 곡선 포셉으로 렌즈를 올린다. </li><li> 5-10 분보다 더 이상 균형 소금 솔루션에 렌즈를 유지, 현미경 렌즈 적도에서 모양체의 잔해를 제거합니다. </li></ol> 3. 정량 RT-PCR <ol><li> 350 μl RA1 용해 완충액 (NucleoSpin RNA II 총 RNA 분리 키트)와 2 ML Eppendorf 튜브에 3.5 μl β-메르 캅토 에탄올의 혼합에 렌즈를 삽입합니다. </li><li> 실온에서 30 분 동안이 혼합에 렌즈를 보관. </li><li> 로 렌즈를 균질화렌즈 만 하드 핵까지 바늘이 렌즈 (피질과 렌즈의 캡슐이 용해 버퍼에 lysed 아르)에서 남아있다. 믹스에서 핵을 제거합니다. </li><li> 스토어 샘플 즉시 -70시 ° C. </li><li> 샘플을 해동하고 프로토콜 &quot;교양 세포와 조직의 총 RNA 정화&quot;(NucleoSpin RNA II 총 RNA 분리 키트)를 따르십시오. </li><li> 스토어 RNA 샘플 -70에서 ° C. </li><li> 2 분 95 ° C, 40 사이클에 대한 2 단계 : 각 샘플에서 DNA의 충분한 제거를 확인하려면 다음과 같은 조건 (1 단계에서 PCR을 실행 95 ° C 20 초, 55 ° C 20 초에 72 ° 20 초에 C, 3 단계 : 7 분 72 ° C) p53 유전자의 DNA 특정 프리 머와 함께 앞으로 5&#39;-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 &#39;와 역 5&#39;-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3&#39;와 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 (dNTPack), 제조에 따라 프로토콜입니다. 예상 PCR 제품은 243 기본 쌍입니다. </li><li> 243 기본 쌍 DNA 특정 PCR 제품을 감지 1.5 % 아가로 오스 겔 전기 영동을 실행합니다. 준비하기TBE 버퍼에 1.5 % 아가로 오스 겔은 아가로 오스의 3.75 g을 가지고 TBE 버퍼 250 ML에 해결. ethidium 브로마이드 (0.5 MG / ML) 1.5 % 아가로 오스 겔 솔루션 500 ML 500 μl를 추가합니다. 전자 레인지 오웬의 혼합물을 가열하고 아가로 오스를 해결하기 위해 젓는다. </li></ol> 샘플 중 어느 것도 1.5 % 아가로 오스 겔 전기 영동에있는 모든 DNA 특정 PCR 제품을 나타 내기 위해이 없습니다. <ol start="9"><li> RNA 샘플 (1 μl)의 농도와 NanoDrop ND-1000 분광 광도계에서 260 나노 미터 (RNA)와 280 nm의 (단백질)에서 샘플 흡광도의 비율을 측정합니다. RNA 샘플 흡광도의 단백질에 대한 비율 RNA 2.0 이상이면 다음 RNA 샘플은 순수합니다. RNA 샘플 흡광도의 비율이 2.0보다 낮 으면 정화 단계 3.5 RNA 다시 실행. </li><li> 1 μg에 해당하는 RNA 샘플의 볼륨을 타고 프로토콜 1의 스트랜드 cDNA 합성 키트 (RT-PCR을위한 1 차 스트랜드 cDNA 합성 키트)에 따라 cDNA 합성. </li><li> -20 ° C에서 cDNA 샘플을 저장(기간 1과 년 이상, -70에서 저장 ° C). </li><li> iCycler MyiQ 단일 색상 실시간 PCR 검출 시스템에 정량 실시간 PCR을 실행합니다. 로드는 1 μl cDNA 샘플, TaqMan 유전자 표현 마스터 믹스, caspase 3 TaqMan 유전자 발현 분석과 함께 96 - 웰 플레이트에 triplicates 지침을 제조했다. 로드는 1 μl cDNA 샘플, TaqMan 유전자 표현 마스터 믹스, 18에 대한 TaqMan 유전자 발현 분석과 또 다른 96 - 웰 플레이트에 triplicates 안내 (TaqMan 유전자 발현 분석 프로토콜)를 제조했다. 시리즈에서 세 무작위로 선택한 비 노출 렌즈의 cDNA의 일부를 희석. 96 - 웰 플레이트에 샘플의 cDNA와 함께 시리얼 dilutions을 실행합니다. </li><li> 결과의 정량화에 대한 표준 곡선 방법을 사용합니다. 임계 형광의 사이클의 수는 MyiQ 소프트웨어의 측정으로 사용됩니다. 캘리브레이터의 상대적 농도의 함수로 입구에서 사이클의 수를 표현하는 표준 곡선은 에스입니다각 플레이트에 시리얼 dilutions을 위해 tablished. 세 이외의 치료 렌즈 샘플의 cDNA는 보정을 위해 사용되었다. cDNA가 측정 샘플의 상대적인 농도를 얻기 위해 표준 곡선에 각 샘플에 대한 사이클의 임계 번호를 관련. 마지막으로, cDNA 내부 제어 18에 cDNA 대상의 상대적 농도를 관련된하여 대상 유전자의 표현 수준을. </li></ol> 4. Immunohistochemical 착색 <ol><li> 정착 <ol><li> PBS의 눈을 (; 산도 7.4 인산 식염 버퍼링) 해부. </li><li> 20 분을위한 얼음처럼 차가워에 4 % paraformaldehyde (PFA)로 가득 찬 튜브에 눈을 놔. 전날 PFA 4 % 준비합니다. 4시 매장 ° C 사용까지. PFA는 약 1 주일 동안 신선한 것입니다. </li><li> micropipette으로 PFA를 제거합니다. 그런 다음 20 분을위한 얼음 차가운 PBS로 씻어. </li><li> ° C 밤 동안 4에서 자당 30 %가 눈을 놔. </li><li> 최적의 절삭 온도 (OCT) 매체로 가득 찬 컵에 눈을 넣어 (조직- 테크). sectioning에 적합한 위치에 눈을 놔. </li><li> 드라이 아이스를 통해 월 중간에 멈춰 봐. </li><li> -70에서 저장 ° C 사용까지. </li></ol></li><li> Sectioning <ol><li> 해당 비행기에 cryo-sectioning에 눈을 배치합니다. </li><li> 각 렌즈의 중앙 부분에서 세 5 μm 두께의 중간 시상 부분을 잘라 버릴거야. 다른 섹션에 동일한 핵을 얼룩 방지하기 위해 연속 섹션 사이에 최소 6 절을 폐기하십시오. </li><li> 섹션 절단되면 부드럽게 상단에 슬라이드를 놓습니다. 섹션은 다음 슬라이드에 충실해야합니다. </li><li> 사용하기 전에 공기 건조에 슬라이드를 둡니다. 필요 할 때까지 슬라이드는 -20 ° C에서 저장 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 형광 immunohistochemistry <ol><li> 샘플 실온 (5-10 분)을 달성 보자. </li><li> PAP-펜 (Invitrogen)를 표본 주위에 가장자리를 그립니다. </li><li> 잠시 (10 분)에 테두리가 건조 보자. </li><li> 현미경 슬라이드를 붙입니다. </li><li> 1 Rehydrate × P를15 분을위한 BS. </li><li> 30 분에 표준 블록 솔루션 Permeabilize. </li><li> 표준 블록 솔루션에 1:3,000를 희석 (세포 Signalling 기술, Inc의 토끼 polyclonal, 흘리고 caspase-3 항체 Asp175 966​​1)가 기본 항체를 추가합니다. </li><li> 밤 동안 4 ° C에서 humidified 챔버에 저장합니다. </li><li> (3 × 5 분) pipetting 또는 대형 욕조 (&gt; 15 분, 1-2 변경)에 immersing하여 PBS로 씻으십시오. </li><li> 표준 블록 솔루션에 1:300을 희석 보조 항체를 (특정 흡수 / 방출 스펙트럼과 안티 토끼 차 항체)를 추가합니다. </li><li> (3 × 5 분) pipetting 또는 대형 욕조 (&gt; 15 분, 1-2 변경)에 immersing하여 PBS로 씻으십시오. </li><li> PAP-펜 얼룩을 닦아. </li><li> 3 시간 동안 실온에서 humidified 챔버에 저장합니다. 빛에 노출을 피하십시오. </li><li> Vectashield 한 방울을 추가하고 슬라이드 커버 슬립을 배치합니다. 거품을 피하십시오. </li><li> Vectashield 굳어를 (~ 20 분) 보자. </li><li> 섹션 바로 내가 보관분석까지 어둠 습니. </li><li> 모든 제어 섹션은 기본 항체의 부재로 처리됩니다. </li><li> 형광 현미경으로 몇 시간 안에 결과를보세요. </li><li> 한쪽 핵 활에서 각 렌즈의 반대편 핵 활에 상피 세포 &#39;핵을 계산합니다. 파란색의 모든 렌즈 상피 핵 녹색의 caspase-3 긍정적 핵을 보려면 차 항체의 방출에 맞는 표준 필터를 확인하기 위해 표준 청색 필터를 적용 할 수 있습니다. </li><li> 모든 렌즈 상피 핵 및 긍정적 인 핵의 수를 기록합니다. 각 섹션에 대한 세포 세 번 계산합니다. </li></ol></li></ol>

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<li>Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Expression+and+Apoptosis+In+The+Lens+After+Ultraviolet+Radiation+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+of+visual+science%22%5BJournal%5D)">p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure.</a> Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).</li>
<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
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<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

<html> 본 논문은 UVR-B 유발 백내장 동안 발생하는 분자 이벤트를 공부하고 사용 방법을 설명합니다. 생체 UVR 유도 백내장에서 사용할 수 대부분의 정보는 흰둥이 Sprague-Dawley 쥐 7, 16, 17, 18, ​​19에서 실험에서 파생 된 것으로, 고려, 우리는 현재의 연구에 흰둥이 Sprague-Dawley 쥐를 사용하기로 결정했습니다. 쥐의 나이 여섯 일주일 정도했습니다. 남성과 대조적으로, 여성은 덜 알레르기 소변을 가지고 있기 때문에 성별이 여성으로 선정되었습니다. 또한, UVR 유도 백내장 20 정도에 따른 성별에 차이가 없습니다. 모든 동물은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 정책에 따라 보관 및 취급되었다. 윤리 권한은 웁살라 동물 실험 윤리위원회, 프로토콜 번호 C 10분의 29로부터 얻은 것입니다. 쥐가...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Ketalar </td><td> 화이자 </td><td> 150086 </td><td> 50 MG / ML </td></tr><tr><td> Rompun </td><td> 바이엘 </td><td> 022545 </td><td> 20 MG / ML </td></tr><tr><td> Oculentum 단순 </td><td> Apoteket, 스웨덴 </td><td> 336164 </td><td> 5g </td></tr><tr><td> Mydriacyl </td><td> 앨콘 </td><td> 00,352 </td><td> 10 MG / ML </td></tr><tr><td> 균형 소금 솔루션 </td><td> 앨콘 </td><td> 0007950055 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 UL β-메르 캅토 에탄올 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II 총 RNA 분리 키트 </td><td> Macherey-Nagel GmbH의 및 공동, Duren, 독일 </td><td> 740955.50 </td><td></td></tr><tr><td> p53의 DNA의 특정 프리 머 </td><td> biomers.net GmbH의 </td><td> 사용자가 만든 </td><td></td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소, dNTPack </td><td> 로슈 </td><td> 04 728 866 001 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 시그마 </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidium 브로마이드 솔루션 0.5 MG / ML </td><td> 시그마 </td><td> E1385 </td><td></td></tr><tr><td> 나노 드롭 ND-1000 분광 광도계 </td><td> NanoDrop 제품 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RT-PCR을위한 1 차 스트랜드 cDNA 합성 키트 (AMV) </td><td> 로슈 진단 GmbH의 </td><td> 11 483 188 001 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler MyiQ 단일 색상 실시간 PCR 탐지 시스템 </td><td> 바이오 RAD 연구소 </td><td></td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> 96 - 웰 플레이트 </td><td> Sarstedt </td><td> 72.1979.202 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4369016 </td><td></td></tr><tr><td> caspase 3 TaqMan 유전자 발현 분석 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> Rn00563902_m1 </td><td></td></tr><tr><td> 18에 대한 TaqMan 유전자 발현 분석 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> Hs99999901_s1 </td><td></td></tr><tr><td> MyiQ 소프트웨어 </td><td> 바이오 RAD 연구소 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 흘리고 caspase-3 (Asp175) </td><td> 세포 신호 기술 </td><td> 9661 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 토끼 IgG </td><td> Abcam </td><td> Ab6798 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 84,097 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 연구소 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유니버설 현미경 Axioplan이 영상 </td><td> 칼 Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 441244 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE 버퍼 </td><td> Promega </td><td> V4251 </td><td></td></tr></tbody></table>

의 분자 메커니즘의 특성<em&gt; 생체에</em&gt; uvr 유도 백내장

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

백내장은 세계 1 실명의 주요 원인이다. 세계 보건기구 (WHO)는 빛의 전송을 막는 눈의 수정체의 뿌옇게로 백내장 정의합니다. 백내장은 당뇨병, 흡연, 자외선 방사선 (UVR), 알코올, 이온화​​ 방사선, 스테로이드 및 고혈압과 관련된 여러 요소 질병입니다. UVR은 백내장 일으키는 강력한 2-4 실험 및 역학 증거 5,6가 있습니다. 우리는 anesthetized 7 비 anesthetized 동물 팔 모두에 UVR B 유발 백내장에 대한 동물 모델을 개발했습니다. 백내장에 대한 유일한 치료는 수술이지만이 치료는 모든 액세스 할 수 없습니다. 그것은 10 년 동안 백내장의 발병을 지연 50 % 9 백내장 수술에 대한 필요성을 줄일 수있는 것으로 추산되었습니다. 백내장의 발생을 지연하기 위해, 그것은 백내장 형성의 메커니즘을 이해하고 효과적인 예방 strat를 찾을 필요합니다egies. 백내장 개발을위한 메커니즘 중 apoptosis 인간과 동물 10 백내장의 개시에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 우리의 초점은 최근 백내장 개발 8,11,12을위한 메커니즘으로 렌즈의 apoptosis있다. 그것은 apoptosis 경로에 UVR의 효과를 더 잘 이해 백내장 방지 할 수있는 새로운 의약품의 발견에 대한 가능성을 제공 할 것으로 예상된다. 이 문서에서는, 우리는 실험적으로 UVR-B에 생체 노출에 의해 유도 할 수있는 방법 백내장 설명합니다. 또한 RT-PCR 및 immunohistochemistry이 도구 UVR-B 유발 백내장의 분자 메커니즘을 연구하기로 제공됩니다.

측정의 유사 콘텐츠의 다양한 소스는 분산 분석과 예상되었고 그것은 동물 당 3 측정을 고려하면 측정을위한 분산 동물에 대해 해당의 15 %의 순서에 있던 것을 발견했습니다. 따라서, 전체 렌즈 분석을 고려, 그것은 정밀도를 향상 할 수 없습니다. 직교 테스트 120 시간의 대기 시간 대 짧은 지연 시간 간격 사이의 caspase-3 메시지 통계적으로 의미있는 대조를 elucidated. 생체 UVR 노출에서 caspase-3 표현이 유도한다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4016/4016fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4016/4016fig1.jpg" /> 그림 1. 자외선 방사선에 노출의 흐름을 도식. <p class...

백내장은 세계에서 실명의 주요 원인이다. 태양 자외선 방사 (UVR)는 백내장 개발을위한 주요 위험 요소입니다. 지금까지 UVR-B 유발 백내장의 동물 모델은 개발되었습니다. UVR, 정량 RT-PCR 및 immunohistochemistry에 노출 :이 글에서 우리는 백내장 형성에 대한 조사를하는 방법을 설명합니다.

의 분자 메커니즘의 특성<em&gt; 생체에</em&gt; UVR 유도 백내장

백내장은 전 세계 실명 원인 1위입니다 1. 세계보건기구(WHO)는 백내장을 안구 수정체가 혼탁해지는 현상으로 정의하며...

이 영상에서는 쥐의 자외선 조사를 통해 백내장을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이후 정량적 실시간 PCR 및 면역세포화학법을 사용하여 백내장 발달에 관여하는 분자적 기전을 연구합니다. 먼저, 쥐의 눈에 자외선을 조사하여 백내장 형성을 유도합니다.반대편 눈은 대조군으로 사용합니다. 다음으로, 렌즈를 해부하고 처리하여 RNA를 얻은 뒤 정량적 실시간 PCR로 CAS B의 발현 수준을 평가하거나, 절단된 caspase에 대한 항체를 사용하여 활성 단백질의 발현 및 위치를 평가하기 위해 염색합니다.결과적으로, 이러한 분석 결과들은 UVR 노출 후 수정체 세포 핵 내에서 caspase three mRNA의 증가와 활성 단백질의 발현을 확인시켜 줍니다. 기존 방법과 비교하여 이 프로토콜의 주요 장점은 독특한 협대역 UVR 광원과 범용 쥐 고정 장치를 사용하여, 잘 정의된 UV 스펙트럼과 투여량으로 동물을 안전하고 정밀하게 노출시킬 수 있다는 점입니다. 또한, 수정체의 세포 사멸을 연구하기 위해 정량적 R-T-P-C-R 및 면역조직화학법이라는 현대적 생물학적 기법을 적용하였으며, 이 방법은 자외선 조사로 유도된 백내장의 분자적 기전에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.또한 자외선 및 방사선 유발 피부암, 쥐 행동 신경과학, 그리고 세포사멸(apoptosis)에 초점을 맞춘 실험적 안구 연구와 같은 다른 실험 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 마취된 암컷 Sprague Dawley 쥐를 쥐 고정 장치에 넣고, 몸통을 압박하지 않으면서 쥐가 움직이지 않을 때까지 벨트를 조여 고정하십시오. 동공 확대(mydriasis)를 유도하려면 각 눈에 10 mg/mL 농도의 tropicamide 용액을 1~2방울씩 점안하십시오.그다음, 노출되지 않는 쪽의 눈에 연고를 바르고 자외선을 차단하기 위해 검은색 테이프로 가립니다. 이어서, 고압 수은 램프에서 생성된 반치폭 10 nanometer의 300 nanometers 자외선 좁은 빔이 노출된 눈에 조사될 수 있도록 동물을 보정기에 위치시킵니다. 쥐의 한쪽 눈에 sub-threshold dose인 1 kJ/m²의 UVRB를 15분 동안 조사합니다.노출되지 않은 눈에서 테이프를 제거하고 양쪽 눈에 연고를 도포합니다. 동물을 케이지로 돌려보내고 부드러운 종이로 덮어 체온을 유지합니다. 동물이 흉복와위(sternal recumbent) 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분히 의식을 회복할 때까지 모니터링합니다.그 후 회복된 쥐를 다른 쥐들과 함께 케이지에 다시 넣으십시오. 노출 후 1, 5, 24 및 120시간이 경과한 후 진행하십시오.안락사시킨 쥐의 적출된 안구를 각막이 아래로 가고 후면이 위로 향하게 하여 부드러운 종이 티슈 위에 놓습니다. 그 후 해부 현미경 하에서 작업을 수행합니다. 27 gauge 캐뉼라를 사용하여 공막과 매우 가까이 위치한 수정체에 손상을 주지 않도록 공막 방향으로 접선으로 밀어 넣어 작은 구멍을 뚫습니다.다음으로, 안과 수술용 가위를 사용하여 공막각막 경계부(limbus) 바로 뒤쪽을 원형으로 절개하여 공막의 후면부를 들어 올릴 수 있게 합니다. 그런 다음 뭉툭한 곡선 핀셋을 사용하여 수정체를 들어 올린 후, 수정체를 평형염 용액(balanced salt solution)에 넣고 수정체에서 모양체(ciliary body)의 잔해를 제거합니다. 수정체를 평형염 용액에 10분 이상 보관해서는 안 됩니다.해부 후, NucleoSpin RNA Two Total RNA Isolation Kit의 lysis buffer인 RA1 350 µL와 Beamer keto ethanol 3.5 µL가 들어 있는 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수정체를 넣습니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 바늘을 사용하여 딱딱한 핵만 남을 때까지 수정체를 기계적으로 균질화합니다. 수정체의 피질과 낭은 lysis buffer에 의해 용해됩니다.혼합물에서 핵을 제거하여 버립니다. 샘플을 즉시 -70 °C에서 보관하십시오. 준비가 될 때까지 샘플은 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.키트의 배양 세포 및 조직에서의 총 RNA 정제 프로토콜에 따라 샘플을 채취하고 RNA를 정제하십시오. RNA 샘플은 -70 °C에서 보관하십시오. 각 샘플에서 DNA가 충분히 제거되었는지 확인하기 위해, 다음 조건 하에서 P 53 DNA 특이적 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭하십시오.1단계: 95 °C에서 2분 동안 처리합니다. 2단계: 95 °C에서 20초, 55 °C에서 20초 과정을 40회 반복합니다.72 °C에서 20초 동안 유지합니다. 단계 3: 72 °C에서 7분 동안 유지합니다. 반응이 완료되면 생성물을 1.5% agarose 겔에서 전기영동합니다.243 base pair의 DNA 특이적 PCR 산물을 검출하기 위해, 반드시 양성 및 음성 대조군 샘플을 포함하십시오. DNA가 성공적으로 제거되었다면 PCR 산물이 관찰되지 않을 것입니다. NanoDrop 분광광도계를 사용하여 RNA 샘플의 농도를 측정하고 RNA 대 단백질 비율을 결정하며, 양성 대조군 레인에서만 밴드가 관찰되어야 합니다.RNA 샘플의 흡광도 비인 RNA 대 단백질 비율 또는 260/280 비율이 2.0 이상이면 RNA 샘플이 순수한 것입니다. 다음으로, 1 µg의 RNA를 사용하여 RT-PCR용 1차 가닥 cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성하고, cDNA 샘플을 -20 °C에 보관합니다. 이어서 정량적 실시간 PCR을 수행하기 위해 샘플을 96-웰 플레이트에 3반복으로 분주합니다.각 웰에는 CD NNA 샘플 1 µL와 caspase 3에 대한 TAC man 유전자 발현 마스터 믹스를 별도의 플레이트에 혼합하여 넣어야 합니다. 동일한 샘플을 사용하되, 18 s에 대한 TAC man 유전자 발현 분석법을 적용하십시오. 다음으로, 분석을 위한 표준 곡선을 생성하기 위해 무작위로 선택한 비노출 렌즈 3개에서 얻은 cDNA 1 µL를 단계별로 희석하십시오.샘플 유래 cDNA와 함께 연속 희석을 수행합니다. 각 플레이트의 96웰 플레이트에서 진행하십시오. 플레이트를 원심 분리한 다음, iCycler myiQ 단색 실시간 PCR 검출 시스템으로 분석합니다.실행 후, IQ 소프트웨어를 사용하여 각 플레이트의 연속 희석액에 대해 임계값에서의 사이클 수를 보정물(calibrator)의 상대적 농도의 함수로 나타내는 표준 곡선을 설정합니다. 이 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 임계값 사이클 수로 측정된 샘플 cDNA의 상대적 농도를 결정합니다.마지막으로, 표적 cDNA의 상대적 농도를 내부 대조군인 18 s cDNA와 비교하여 표적 유전자의 발현 수준을 결정합니다. 면역조직화학 염색을 수행하기 위해, 안구를 적출한 후 PBS에 넣습니다. 안구를 4% para formaldehyde가 채워진 튜브로 옮겨 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.마이크로 피펫을 사용하여 파라포름알데하이드를 제거합니다. 그런 다음 안구를 1 mL의 ice cold PBS가 들어 있는 2 mL 에펜도르프 튜브로 옮기고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 안구를 30% sucrose가 들어 있는 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 포셉을 사용하여 안구를 OCT(Optimal Cutting Temperature) 배지가 채워진 컵으로 옮깁니다. 섹셔닝을 위해 안구를 직선 방향으로 배치합니다.그 후, 컵을 드라이아이스 위에 올려놓고 -70 °C에서 냉동 보관하며, 형광 현미경 분석을 위해 안구를 절편화할 때까지 보관합니다. 먼저 OCT에 임베딩된 안구를 크라이오스탯(cryostat)의 척(chuck)에 배치하여 동결 절편 제작을 시작합니다. 안구 렌즈의 가장 평평한 면이 칼날의 가장자리와 평행하도록 정렬하십시오.각 수정체의 중심부에서 5 µm 두께의 정중단면 섹션을 3개 절단합니다. 서로 다른 섹션에서 동일한 핵이 염색되는 것을 방지하기 위해, 연속된 섹션 사이에 최소 6개의 섹션을 버립니다. 섹션을 절단한 후, 그 위에 슬라이드를 조심스럽게 놓습니다.그러면 절편이 슬라이드에 밀착됩니다. 사용 전 슬라이드를 공기 중에서 건조시키십시오. 슬라이드는 염색이 필요할 때까지 -70 °C에서 보관할 수 있습니다.슬라이드를 상온으로 되돌립니다. 그 다음, 동봉된 문서에 기술된 대로 몇 시간 내에 cleaved CAS phase three를 식별하기 위해 항체 염색을 수행하고, 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하십시오. 모든 수정체 상피 세포의 핵을 계수하십시오.DAPI 염색된 세포를 세어 모든 수정체 상피핵의 수를 기록하고, 활성 caspase-3 표지 세포를 세어 caspase-3 양성 핵의 수를 기록하십시오. 각 절편당 세포 수를 세 번 측정하십시오.Caspase 3는 세포 사멸의 실행 단계에서 핵심적인 프로테아제입니다. 투과 전자 현미경. 연구 결과들은 UVR이 수정체에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 뒷받침합니다.apoptosis에 관한 실험적 연구들은 caspase three가 apoptosis의 신뢰할 수 있는 마커임을 확인해 줍니다. in vivo UVR 노출이 caspase three 발현을 유도하는지 결정하기 위해, 300 nanometers의 UVR을 m²당 1 kJ로 in vivo 노출시킨 후 1, 5, 24, 120시간 시점에서 수정체의 mRNA 발현을 QPCR로 측정하였습니다. 이후 노출된 수정체와 반대편의 노출되지 않은 수정체 간의 CASP three mRNA 대 18S rRNA의 평균 비율을 각 시간대별로 도식화하였습니다.이 그림은 시간에 따른 caspase three mRNA 발현을 묘사하며 세포사멸의 전사를 보여줍니다. 원거리 UVR 직교 테스트 노출 후 생체 내 수정체에서 marker caspase three를 확인한 결과, 120시간의 잠복기 간격과 더 짧은 잠복기 간격 사이에 caspase three mRNA 신호에서 통계적으로 유의미한 차이가 나타났습니다. 노출된 수정체와 노출되지 않은 수정체의 caspase three 발현 또한 면역형광 현미경으로 비교하였으며, 이 이미지들에 나타난 바와 같이 노출 24시간 후 핵이 표지되어 활성 caspase three의 존재를 나타냅니다.이 면역염색 방법은 렌즈 내에서 세포사멸 마커인 caspase three로 표지된 상피세포의 공간적 분포에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 UV-B 유도 백내장을 실험적으로 유도하는 방법과 quantitative RT-PCR 및 면역조직화학법을 이용하여 UV-B 유도 백내장의 분자적 기전을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

우리는 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 람다 선택 cII 돌연변이 분석 결과 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트 처리에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 접근은 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위한 널리 사용 되었습니다.

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

이 프로토콜은 마우스 안구 표면 세포로부터살아있는 1차 배양에서 반응성 산소 종(ROS), 살아있는 세포 및 죽은 세포의 동시 검출을 입증한다. 2',-7'-디클로로플루오레세테이트, 프로피듐 요오드화물 및 Hoechst 염색은 ROS, 죽은 세포 및 살아있는 세포를 각각 평가하기 위해 사용되며, 이미징 및 분석이 뒤따릅니다.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

이 보고서에서 우리는 조사자가 안내 포도막염의 마우스 모델을 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 더 일반적으로 실험적 자가면역 포도막염(EAU)이라고 하는 이 확립된 모델은 인간 질병의 여러 측면을 포착합니다. 여기에서는 여러 판독값을 사용하여 질병 진행을 유도하고 모니터링하는 방법을 설명합니다.

실험적 자가면역 포도막염: 안구내 염증성 마우스 모델

안구 표면 염증은 안구 표면 조직에 해를 끼치고 눈의 중요한 기능을 손상시킵니다. 본 프로토콜은 마이보미안 샘 기능장애(MGD)의 마우스 모델에서 안구 염증을 유도하고 손상된 조직을 수집하는 방법을 기술한다.

안구 표면 염증의 유도 및 관련 조직의 수집

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

이 방법은 성체 마우스에서 수정체 섬유 세포를 제거하고 수정체 상피 세포(LEC)가 부착된 수정체 주머니를 남겨 생체 내 백내장 수술을 모델링합니다. 그런 다음 부상 반응은 분자 및 형태학적 기준을 사용하여 수술 후 여러 번 평가됩니다.

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상패 생물학의 2 차원 분자 이미징을위한 intravascular 우리는 세부 새로운 가까운 적외선 형광 (NIRF)...

염증성 플라크의 적외선 형광 (NIRF) Intravascular 분자 이미징, Multimodal 접근 가까운 생체내에서 죽상 경화증의 영상을

생체내에</em수축 유도 부상 및 복구의 비침습 모니터링> 쥐 모델

배우세요 자외선으로 쥐 백내장을 유도하고 정량적 RT-PCR 및 면역조직화학으로 분자 메커니즘을 분석하는 방법을. 이 실험 모델은 백내장 형성 연구에 활용됩니다.

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