의 분자 메커니즘의 특성

이 영상에서는 쥐의 자외선 조사를 통해 백내장을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이후 정량적 실시간 PCR 및 면역세포화학법을 사용하여 백내장 발달에 관여하는 분자적 기전을 연구합니다. 먼저, 쥐의 눈에 자외선을 조사하여 백내장 형성을 유도합니다.

반대편 눈은 대조군으로 사용합니다. 다음으로, 렌즈를 해부하고 처리하여 RNA를 얻은 뒤 정량적 실시간 PCR로 CAS B의 발현 수준을 평가하거나, 절단된 caspase에 대한 항체를 사용하여 활성 단백질의 발현 및 위치를 평가하기 위해 염색합니다.

결과적으로, 이러한 분석 결과들은 UVR 노출 후 수정체 세포 핵 내에서 caspase three mRNA의 증가와 활성 단백질의 발현을 확인시켜 줍니다. 기존 방법과 비교하여 이 프로토콜의 주요 장점은 독특한 협대역 UVR 광원과 범용 쥐 고정 장치를 사용하여, 잘 정의된 UV 스펙트럼과 투여량으로 동물을 안전하고 정밀하게 노출시킬 수 있다는 점입니다. 또한, 수정체의 세포 사멸을 연구하기 위해 정량적 R-T-P-C-R 및 면역조직화학법이라는 현대적 생물학적 기법을 적용하였으며, 이 방법은 자외선 조사로 유도된 백내장의 분자적 기전에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.

또한 자외선 및 방사선 유발 피부암, 쥐 행동 신경과학, 그리고 세포사멸(apoptosis)에 초점을 맞춘 실험적 안구 연구와 같은 다른 실험 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 마취된 암컷 Sprague Dawley 쥐를 쥐 고정 장치에 넣고, 몸통을 압박하지 않으면서 쥐가 움직이지 않을 때까지 벨트를 조여 고정하십시오. 동공 확대(mydriasis)를 유도하려면 각 눈에 10 mg/mL 농도의 tropicamide 용액을 1~2방울씩 점안하십시오.

그다음, 노출되지 않는 쪽의 눈에 연고를 바르고 자외선을 차단하기 위해 검은색 테이프로 가립니다. 이어서, 고압 수은 램프에서 생성된 반치폭 10 nanometer의 300 nanometers 자외선 좁은 빔이 노출된 눈에 조사될 수 있도록 동물을 보정기에 위치시킵니다. 쥐의 한쪽 눈에 sub-threshold dose인 1 kJ/m²의 UVRB를 15분 동안 조사합니다.

노출되지 않은 눈에서 테이프를 제거하고 양쪽 눈에 연고를 도포합니다. 동물을 케이지로 돌려보내고 부드러운 종이로 덮어 체온을 유지합니다. 동물이 흉복와위(sternal recumbent) 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분히 의식을 회복할 때까지 모니터링합니다.

그 후 회복된 쥐를 다른 쥐들과 함께 케이지에 다시 넣으십시오. 노출 후 1, 5, 24 및 120시간이 경과한 후 진행하십시오.

안락사시킨 쥐의 적출된 안구를 각막이 아래로 가고 후면이 위로 향하게 하여 부드러운 종이 티슈 위에 놓습니다. 그 후 해부 현미경 하에서 작업을 수행합니다. 27 gauge 캐뉼라를 사용하여 공막과 매우 가까이 위치한 수정체에 손상을 주지 않도록 공막 방향으로 접선으로 밀어 넣어 작은 구멍을 뚫습니다.

다음으로, 안과 수술용 가위를 사용하여 공막각막 경계부(limbus) 바로 뒤쪽을 원형으로 절개하여 공막의 후면부를 들어 올릴 수 있게 합니다. 그런 다음 뭉툭한 곡선 핀셋을 사용하여 수정체를 들어 올린 후, 수정체를 평형염 용액(balanced salt solution)에 넣고 수정체에서 모양체(ciliary body)의 잔해를 제거합니다. 수정체를 평형염 용액에 10분 이상 보관해서는 안 됩니다.

해부 후, NucleoSpin RNA Two Total RNA Isolation Kit의 lysis buffer인 RA1 350 µL와 Beamer keto ethanol 3.5 µL가 들어 있는 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수정체를 넣습니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 바늘을 사용하여 딱딱한 핵만 남을 때까지 수정체를 기계적으로 균질화합니다. 수정체의 피질과 낭은 lysis buffer에 의해 용해됩니다.

혼합물에서 핵을 제거하여 버립니다. 샘플을 즉시 -70 °C에서 보관하십시오. 준비가 될 때까지 샘플은 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.

키트의 배양 세포 및 조직에서의 총 RNA 정제 프로토콜에 따라 샘플을 채취하고 RNA를 정제하십시오. RNA 샘플은 -70 °C에서 보관하십시오. 각 샘플에서 DNA가 충분히 제거되었는지 확인하기 위해, 다음 조건 하에서 P 53 DNA 특이적 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭하십시오.

1단계: 95 °C에서 2분 동안 처리합니다. 2단계: 95 °C에서 20초, 55 °C에서 20초 과정을 40회 반복합니다.

72 °C에서 20초 동안 유지합니다. 단계 3: 72 °C에서 7분 동안 유지합니다. 반응이 완료되면 생성물을 1.5% agarose 겔에서 전기영동합니다.

243 base pair의 DNA 특이적 PCR 산물을 검출하기 위해, 반드시 양성 및 음성 대조군 샘플을 포함하십시오. DNA가 성공적으로 제거되었다면 PCR 산물이 관찰되지 않을 것입니다. NanoDrop 분광광도계를 사용하여 RNA 샘플의 농도를 측정하고 RNA 대 단백질 비율을 결정하며, 양성 대조군 레인에서만 밴드가 관찰되어야 합니다.

RNA 샘플의 흡광도 비인 RNA 대 단백질 비율 또는 260/280 비율이 2.0 이상이면 RNA 샘플이 순수한 것입니다. 다음으로, 1 µg의 RNA를 사용하여 RT-PCR용 1차 가닥 cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성하고, cDNA 샘플을 -20 °C에 보관합니다. 이어서 정량적 실시간 PCR을 수행하기 위해 샘플을 96-웰 플레이트에 3반복으로 분주합니다.

각 웰에는 CD NNA 샘플 1 µL와 caspase 3에 대한 TAC man 유전자 발현 마스터 믹스를 별도의 플레이트에 혼합하여 넣어야 합니다. 동일한 샘플을 사용하되, 18 s에 대한 TAC man 유전자 발현 분석법을 적용하십시오. 다음으로, 분석을 위한 표준 곡선을 생성하기 위해 무작위로 선택한 비노출 렌즈 3개에서 얻은 cDNA 1 µL를 단계별로 희석하십시오.

샘플 유래 cDNA와 함께 연속 희석을 수행합니다. 각 플레이트의 96웰 플레이트에서 진행하십시오. 플레이트를 원심 분리한 다음, iCycler myiQ 단색 실시간 PCR 검출 시스템으로 분석합니다.

실행 후, IQ 소프트웨어를 사용하여 각 플레이트의 연속 희석액에 대해 임계값에서의 사이클 수를 보정물(calibrator)의 상대적 농도의 함수로 나타내는 표준 곡선을 설정합니다. 이 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 임계값 사이클 수로 측정된 샘플 cDNA의 상대적 농도를 결정합니다.

마지막으로, 표적 cDNA의 상대적 농도를 내부 대조군인 18 s cDNA와 비교하여 표적 유전자의 발현 수준을 결정합니다. 면역조직화학 염색을 수행하기 위해, 안구를 적출한 후 PBS에 넣습니다. 안구를 4% para formaldehyde가 채워진 튜브로 옮겨 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.

마이크로 피펫을 사용하여 파라포름알데하이드를 제거합니다. 그런 다음 안구를 1 mL의 ice cold PBS가 들어 있는 2 mL 에펜도르프 튜브로 옮기고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 안구를 30% sucrose가 들어 있는 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.

4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 포셉을 사용하여 안구를 OCT(Optimal Cutting Temperature) 배지가 채워진 컵으로 옮깁니다. 섹셔닝을 위해 안구를 직선 방향으로 배치합니다.

그 후, 컵을 드라이아이스 위에 올려놓고 -70 °C에서 냉동 보관하며, 형광 현미경 분석을 위해 안구를 절편화할 때까지 보관합니다. 먼저 OCT에 임베딩된 안구를 크라이오스탯(cryostat)의 척(chuck)에 배치하여 동결 절편 제작을 시작합니다. 안구 렌즈의 가장 평평한 면이 칼날의 가장자리와 평행하도록 정렬하십시오.

각 수정체의 중심부에서 5 µm 두께의 정중단면 섹션을 3개 절단합니다. 서로 다른 섹션에서 동일한 핵이 염색되는 것을 방지하기 위해, 연속된 섹션 사이에 최소 6개의 섹션을 버립니다. 섹션을 절단한 후, 그 위에 슬라이드를 조심스럽게 놓습니다.

그러면 절편이 슬라이드에 밀착됩니다. 사용 전 슬라이드를 공기 중에서 건조시키십시오. 슬라이드는 염색이 필요할 때까지 -70 °C에서 보관할 수 있습니다.

슬라이드를 상온으로 되돌립니다. 그 다음, 동봉된 문서에 기술된 대로 몇 시간 내에 cleaved CAS phase three를 식별하기 위해 항체 염색을 수행하고, 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하십시오. 모든 수정체 상피 세포의 핵을 계수하십시오.

DAPI 염색된 세포를 세어 모든 수정체 상피핵의 수를 기록하고, 활성 caspase-3 표지 세포를 세어 caspase-3 양성 핵의 수를 기록하십시오. 각 절편당 세포 수를 세 번 측정하십시오.

Caspase 3는 세포 사멸의 실행 단계에서 핵심적인 프로테아제입니다. 투과 전자 현미경. 연구 결과들은 UVR이 수정체에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 뒷받침합니다.

apoptosis에 관한 실험적 연구들은 caspase three가 apoptosis의 신뢰할 수 있는 마커임을 확인해 줍니다. in vivo UVR 노출이 caspase three 발현을 유도하는지 결정하기 위해, 300 nanometers의 UVR을 m²당 1 kJ로 in vivo 노출시킨 후 1, 5, 24, 120시간 시점에서 수정체의 mRNA 발현을 QPCR로 측정하였습니다. 이후 노출된 수정체와 반대편의 노출되지 않은 수정체 간의 CASP three mRNA 대 18S rRNA의 평균 비율을 각 시간대별로 도식화하였습니다.

이 그림은 시간에 따른 caspase three mRNA 발현을 묘사하며 세포사멸의 전사를 보여줍니다. 원거리 UVR 직교 테스트 노출 후 생체 내 수정체에서 marker caspase three를 확인한 결과, 120시간의 잠복기 간격과 더 짧은 잠복기 간격 사이에 caspase three mRNA 신호에서 통계적으로 유의미한 차이가 나타났습니다. 노출된 수정체와 노출되지 않은 수정체의 caspase three 발현 또한 면역형광 현미경으로 비교하였으며, 이 이미지들에 나타난 바와 같이 노출 24시간 후 핵이 표지되어 활성 caspase three의 존재를 나타냅니다.

이 면역염색 방법은 렌즈 내에서 세포사멸 마커인 caspase three로 표지된 상피세포의 공간적 분포에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 UV-B 유도 백내장을 실험적으로 유도하는 방법과 quantitative RT-PCR 및 면역조직화학법을 이용하여 UV-B 유도 백내장의 분자적 기전을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.