Name: Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 학습하세요 병아리 중뇌에서 in ovo 전기영동법을 이용한 도파민성 신경 세포 분화 연구 방법을. 맞춤형 전극으로 유전자를 표적 전달하여 중뇌 발달 및 신경 전구세포 분화 메커니즘을 분석할 수 있습니다.

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우리는 pCAG-mCherry가 만들지 제공해 주셔서 박사 Takahiko 마츠다 감사드립니다. YCM은 Schweppe 재단의 경력 개발 대상과 관청 재단의 교부금에 의해 지원됩니다.

1. (없는 동영상)를 준비를 공급 <ol><li> 1X PBS의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep)의 신선한 1X 희석을 준비합니다. 더 이상 50 ML이 필요합니다. 0.22 μm의 주사기 필터로 필터링합니다. </li><li> 원하는 플라스미드 구조를 결합하여 사출 구조를 준비합니다. 우리는 ~ 10 μL의 최종 볼륨에 맞는 stoichiometry로 pCAG - 국기 벡터의 모든 구조를 넣어. 또한 pCAG-GFP 14 pCAG-mCherry는 추적 electroporation 효율과 electroporated 세포에 추가됩니다. 우리는이 실험 pCAG-mCherry을 사용합니다. 마지막으로, 태아의 여자는 midbrains로 주입 효율을 시각화하는 0.05 %의 최종 농도에서 플라스미드 DNA의 혼합물에 0.22 μm의 - 여과 빠른 그린 염료를 추가합니다. </li></ol> 2. 계란 준비 (비디오) <ol><li> HH 단계가 11 배아를 얻기 위해서는, 계란이 100에서 incubated해야 ° F (37.8 ° C) 25-40% 습도와 배입니다 41 시간 정도입니다. 장소그들의 측면에 계란 연필 대시로 각각의 상단을 표시합니다. 사전 예열, humidified 인큐베이터에서 트레이를 놓습니다. 천천히으로 인큐베이터 플랫폼의 회전 기능을 설정하여 난자를 흔들 &quot;자동.&quot; 습도와 물 수준의 24 시간마다 확인합니다. </li><li> 마우스 실험을 시작하기 전에, 인큐베이터에서 알을 제거하고 실온에 둡니다. 이것은 개발 속도를 느리게하고 개발을 통해 방지하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 70 % 에탄올로 각 계란의 표면을 깨끗이하고 Kimwipe로 아래로 닦으십시오. </li><li> 스카치 테이프의 두 4cm의 조각을 가지고 연필 대쉬 이상의 큰 사각형을 만들기 위해 계란 위에 나란히 붙어 있어라. 계란에 대한 테이프를 부드럽게. 창이 이루어집니다 곳입니다. 테이프 창이 열려있는자를 때 떨어지부터 달걀 껍질의 작은 조각을 방지할 수 있습니다. </li><li> 10 ML의 주사기와 18시 계란의 알부민 밖의 5 ML을 그릴 수있는 게이지 바늘을 사용합니다. 방해하지 않도록로 쉘을 피어싱 후, 노른자에서 떨어져 바늘 각도알부민 제거하는 동안이나 배아가 손상될. 계란 사이에 70 % 에탄올로 바늘을 청소하지만 바늘이 다음 계란을 피어싱하기 전에 건조해야합니다. </li></ol> 3. 유리 사출 니들 준비 (비디오) <ol><li> 주입 바늘이에서 다음 설정을 사용하여 만들어진 브라운 Micropipette 풀러 (셔터의 인스 트루먼트 모델 P-97) / 불타는 : 열량 670, 끌어 오기 120 벨 40 시간 165가. 세계 정밀 계측기 (API) 4 인치 1.0 mm 얇은 벽을 모세관 유리 (API TW100F-4)은 바늘을 만드는 데 사용됩니다. </li><li> P10 피펫과 장기 팁 모세관로드 피펫 팁 (Eppendorf 5242956.003)을 사용하여 가져온 유리 바늘을로드합니다. 주입해야 얼마나 많은 계란에 따라 5-10 μL를로드합니다. 공기 거품의 부재 플라스미드 솔루션의 지속적인 열을 만드는 천천히 유리 바늘을 채웁니다. </li><li> micromanipulator (Narishige MM3)와 Picospritzer III microinjector에 부착된 바늘 홀더에 로드된 바늘을 놓습니다. dissecti 아래 바늘보기현미경에서와 녹색 액체가 중지 지점에서 바늘을 잘라. 그것은 더 바늘을 시각화하기 위해 어두운 배경을 사용하는 데 도움이됩니다. 트리밍 적절한 바늘 연습이 함께 제공됩니다. </li></ol> 4. Midbrain / 신경 튜브 주입 (비디오) <ol><li> 계란의 2-2.5 cm 직경 창을 잘라 봄 가위를 사용하십시오. 알부민을 그릴 때 만든 이전 바늘 구멍에서 윈도우를 시작하고 잘라내으로 손에 계란을 돌린다. 계란 사이에 70 % 에탄올에 포화 Kimwipe으로 가위를 청소해야합니다. </li><li> 해부 현미경 하에서 여자의 배아를 볼 수 있습니다. 그것은 눈을 훈련해야 할 수도 있습니다. 그것은 여자의 배아 아래 PBS에 0.​​22 μm의 - 여과 20% 인도 잉크를 주입함으로써 배아를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 가능하다면 그것이 생존을 감소시키는 경향으로이 조치는, 피해야만 것으로 나타났습니다. </li><li> 태아가 바늘의 경로를 병렬로 배치되는 경우 사출 거리 바늘의 머리와 함께 잘 작동됩니다.천천히 피어스 midbrain-hindbrain 접합에 45도 각도로 신경 튜브. 단지 forebrain 및 hindbrain 지역으로 크게 확산없이 플라스미드 DNA와 빠른 그린 염료로 midbrain을 나타내는 신경 소포를 작성하는 것은 매우 중요합니다. 25 MS에서 Picospritzer microinjector의 기간 세트 주사 시작, 이것은 바늘이 트리밍에 따라 변경해야 할 수도 있습니다. 일반적으로 10-50 MS 사이에 사용하십시오. </li></ol> 5. Electroporation (동영상) <ol><li> 주사 바늘을 검색합니다. 장 소 배아에서 난자의 PBS 용액에서 1X 펜 / Strep의 3 드랍스. </li><li> BTX EMC830의 electroporator의 설정을 확인하십시오 : <table border="1"><tbody><tr><td> 전압 : </td><td> 20 V </td></tr><tr><td> 펄스 길이 : </td><td> 25 MS </td></tr><tr><td> # 펄스 : </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 간격 : </td><td> 500 MS </td></tr><tr><td> 극성 : </td><tD&gt; UNIPOLAR </td></tr></tbody></table></li><li> 둘을 갈라놓 3mm 전극 사이의 중간에 앉아 배아 midbrain과 함께 신경 튜브의 바닥과 같은 수평 레벨에서 2mm L-모양의 긴 백금 전극을 배치합니다. 신경 튜브의 바닥과 함께 전극을 정렬하면 복부 midbrain의 효율적인 electroporation에 중요합니다. midbrain 특정 electroporation을 달성하기 위해, 우리는 짧은 2mm 길이 팁 두 개의 사용자 정의 만든 백금 L-모양의 전극으로 원래 BTX 전극을 대체했습니다. 이러한 백금 전극은 0.5mm 직경 백금 와이어 (알파 Aesar)으로 만들어집니다. 이러한 백금 전극은 충분히 많은 forebrain 또는 hindbrain 지역의 타겟팅을하지 않고 길이 약 0.9 mm이며 무대 11 여자의 배아의 midbrain을 가릴 수 있습니다. BTX footswitch을 한 번 누르십시오. 공기 방울은 각 성공적인 electroporation과 전극 주위에 생성되어야한다. 조심스럽게 난자에서 전극을 제거하고 electr 닦아70 % 에탄올 덮여 Kimwipe 달아 odes. 배아에서 난자의 1X 펜 / Strep 솔루션의 또 다른 3 방울을 넣으십시오. </li><li> 투명 포장 테이프 X 5cm 조각 5cm로 창을 커버. 물론 그 달걀을 봉쇄하라는 계란 내용이 테이프와 접촉하지 않도록하십시오. </li></ol> 6. 부화 및 수확 <ol><li> 인큐베이터에 다시 계란을 넣습니다. 인큐베이터 플랫폼의 모퉁이가 꺼져 있는지 확인하십시오. 원하는 HH 단계 23이 달성될 때까지 알을 품어. </li><li> 추수 생활 배아는 각각의 조건에 관한 일반적인 PBS-채워진 배양 접시에 넣어. 화면 mCherry 표현식에서만 배아를 유지, 형광 해부 현미경 하에서 배아를 수확. </li><li> 24 잘 요리의 개별 우물로 배아를 전송합니다. 갓 만들어진 2 % paraformaldehyde (PFA) 1 ML 각 우물을 입력하고 4에 2~3시간를 해결할 수 있도록 ° C. </li><li> 십분 PBS에 각각 고정 배아 세 번 씻는다. 장소 배아 순차적 IN 15% 및 equilibrated까지 30 % 자당. 태아는 처음 자당에 떠 있지만 평균시 싱크됩니다. </li><li> 각각의 배아에 대한 mCherry 표현 패턴과 수준에 메모를 복용, 형광 해부 현미경 하에서 배아를 확인하십시오. 10월 각 배아를 포함시킵니다. 그것은 제대로 후속 분석 (그림 1)에 대한 최적의 midbrain의 크로스 섹션을 생성하여 동양의 배아에 매우 중요합니다. </li><li> Leica CM3050S의 그라 이오 스탯을 사용하여 18 μm의 두께 midbrain 섹션을 준비합니다. 적절한 셀 타입의 마커로 immunostaining하여 midbrain 개발 및 dopaminergic 신경 세포의 분화를 분석합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 태아의 여자는 midbrain을 electroporating 및 분석 도표 표현은 그림 1에 표시됩니다. 성공적으로 주입하고 electroporated 여자는 배아에서 mCherry 표현은 앞으로의 개발 이후 midbrain 지역에서 볼 수 있어야합니다 ( <stronG&gt; 그림 2A, B, C). mCherry 다른 공동 electroporated 유전자의 표현과 연결합니다라고 가정한다면 적절한 mCherry 표현을 전시 배아 그런 다음 고정 및 진학 (그림 2D)에 midbrain의 cryosections을 준비하기 위해 임베디드 수 있습니다. 일반적으로 복부 midbrain 신경 progenitors의 약 50 %가 효율적으로 위의 프로토콜로 transfected 수 있습니다. electroporated 신경 progenitors의 dopaminergic 운명의 사양 mCherry의 공동 지방화 검사를받을 수 같은 티로신 Hydroxylase (TH) (그림 3)와 같은 dopaminergic 신경 세포 마커와 함께 유전자를 깃발 태그를 지정했습니다. 복부 midbrain의 시조 도메인의 patterning이 다른 시조 도메인 마커와 공동 immnostaining의 cryosections 조사 수 있습니다. 부족 mCherry 표현은 자궁외 유전자 가능성이 효과적으로 표현하지 않는 것이 좋습니다. 이 조건 하에서 태아도 더 공부를 사용할 수 없습니다. 마찬가지로, 배아 그실험 절차의 끝에 생존하지 않은 것은 데이터 수집 및 분석을 위해 사용할 수 없습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig1.jpg" /> 그림 1. 비켜 electroporation 분석의 배아 여자는 midbrain의 일러스트. HH 단계 11 배아 여자는 배아는 () 사출 공정을 시각화하는 빠른 녹색 섞인 관심있는 유전자 함께 pCAG-mCherry으로 주입됩니다. DNA의 구조 가득 후 midbrains는 사각형 웨이브 electroporator로 electroporated있다. 원하는 HH 단계 23에 도달할 때까지 태아도 더 incubated됩니다. 그런 다음 mCherry - 긍정적인 배아는 수확 고정 및 임베디드 (B)됩니다. Midbrain의 cryosections는 그림 1B의 흰색 라인에 표시된 비행기를 절단으로 준비하고, 같은 티로신 Hydroxylase (TH) (C)와 같은 midbrain 표시에 immunostaining으로 분석된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig1large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>큰 그림을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig2.jpg" /> 그림 2. 배아 여자는 midbrain에서 cryosections의 작성. 41시간 보육 후에 mCherry 및 관심있는 유전자를 표현 HH 단계 23 여자의 배아는 PFA로 고정되어 자당로 치료하고, cryosectioning 위해 10월에 박혀 (A, B 및 C) 수확한다. 칙의 배아는 신중 midbrain 섹션의 준비를 보장하기 위해 지향하고 있습니다. midbrain 섹션을 얻기위한 전형적인 배아 형태 및 절단 비행기 (D) 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig3.jpg" /> 그림 3. electroporated midbrain 섹션의 분석. mCherry 표현의 높은 수준과 배아에서 Cryosections은 () antibod 함께 준비하고 묻은 게있다관심의 국기 태그가 추가된 유전자 (B) 및 midbrain dopaminergic 신경 세포 마커 TH (C)를 인식 이거야. pCAG - mCherry 및 pCAG - 국기 빈 벡터 제어의 역할과 electroporated 배아의 midbrains 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> .

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</ol>

저자는 공개하지 잠재적인 충돌 관심이 없습니다.

태아의 여자는 midbrain의 비켜 electroporation의는 낮은 비용과 midbrain dopaminergic 신경 세포 개발의 유전자 기능의 생체내 연구에서 수행하는 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 배아 midbrain 특정 DNA를 주입 함께 짧은 2mm에게 패 모양의 긴 백금 전극을 사용하면 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에 대한 관심의 유전자의 효율적인 표현을 달성하기위한 열쇠입니다. 또한, 올바른 HH 단계 11 여자의 배아를 사용하는 것이 중요합니다. 먼저 HH 단계 11 시에, 여자는 midbrain의 개발 forebrain, midbrain, 그리고 hindbrain가 morphologically 구별할 수있는 것으로 충분 같은 고급되어 있기 때문입니다. 이것은 주사 바늘과 전극 midbrain 지역에서, 따라서 효율적인 DNA를 주입하고 transfection의 정확한 위치를 얻을 수 있습니...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 수정된 닭고기 달걀 </td><td> 찰스 리버 연구소 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 계란 인큐베이터 </td><td> GQF 제조 </td><td> 1502 운동가 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Electroporator </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> 전극 </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td> 45-0162 L-모양의 genetrodes </td><td> ECM830 electroporator 함께 사용하기위한 </td></tr><tr><td> 플래티넘 이리듐 와이어 </td><td> 알파 Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0.5 밀리미터 직경 2mm 긴 전극을 만들기위한 </td></tr><tr><td> 유리 모세관 </td><td> 세계 정밀 악기 </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader 피펫 팁 </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> 먹물 </td><td> 스테이플 </td><td></td><td> 사용하기 전에 20 %를 필터링 </td></tr><tr><td> Microinjector </td><td> 파커 자동화, 파커 Hannifin 협력 </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> 형광등 해부 현미경 </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 풀러 </td><td> 셔터의 악기 </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 midbrain에서 비켜 electroporation에

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

복부 midbrain 제어 운동에 위치 Dopaminergic 뉴런, 정서적 행동, 및 보상 메커니즘 1-3. 복부 midbrain dopaminergic 신경 세포의 기능 장애는 파킨슨병, 정신 분열증, 우울증 및 치매 1-5 연관되어 있습니다. 따라서, midbrain dopaminergic 신경 세포의 분화의 조절을 연구하는 것은 midbrain 개발 및 신경 전구 운명 사양을 조절 메커니즘에 중요한 통찰력을만을 제공할 수 없습니다뿐만 아니라, 인간의 신경 장애의 다양한 치료를위한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이됩니다. Dopaminergic 뉴런은 배아 복부 midbrain의 심실 영역에 즐비한 신경 progenitors에서 차별화. 신경 progenitors의 개발은 유전자 발현 프로그램 6,7에 의해 제어됩니다. 여기 (일 햄버거 해밀턴 (HH) 무대 11 midbrain에서 구체적으로 유전자를 표현하는 electroporation을 활용한 기술을보고irteen somites, 42 시간) 여자는 배아 8,9. 여자는 태아의 외부 개발은 나중에 발달 타임 포인트 10-13에서 결정된 효과를 특정 배아 단계에서의 편리하고 실험적인 조작을 위해 수 있습니다. 이전 HH 스테이지 13 (열아홉 somites 48 시간)보다 칙 배아 신경 튜브는 신경 시스템의 서로 다른 세포 유형으로 구별 능력이있다 multipotent 신경 progenitors로 이루어져 있습니다. CMV 프로 모터와 여자는 β-actin 향상제 모두 포함 pCAG 벡터는 국기 또는 배아 병아리 신경 튜브 14 기타 에피토프 태그가 추가된 구조의 강력한 표현을 허용합니다. 이 보고서에서 우리는 유전자가 배아 midbrain 지역으로 구체적으로 구성하고 어떻게 소규모 맞춤 전극과 electroporation를 정확하게하는 투입 방법을 포함하여 배아 midbrain dopaminergic 신경 세포의 progenitors에서 지역 제한된 유전자 발현을 달성할 수 있도록 특별한 조치를 강조한다. C 분석나중 단계에서 시골 midbrain는 플라스미드 벡터 중재의 이득의 기능 및 midbrain 개발 손실의 기능 연구를위한 생체내 시스템에 탁월한를 제공합니다. 실험 시스템의 변경은 운명 매핑 분석을 수행과 유전자 발현의 규정을 조사하는 신경계의 다른 부분에 검정을 연장할 수 있습니다.

기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을 설명<em&gt; 비켜에서</em배아 병아리 복부 midbrain의 dopaminergic 신경 세포의 progenitors로 플라스미드의 DNA 구조의&gt; electroporation. 이 기술은 midbrain 개발 및 dopaminergic 신경 세포의 분화의 다양한 측면을 연구하는 데 관심있는 유전자의 효율적인 표현을 달성하는 데 사용할 수 있습니다.

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

복측 중뇌에 위치한 도파민성 뉴런은 운동, 정서적 행동 및 보상 기전을 조절한다1-3. 복측 중뇌의 기능 장애는...

본 실험은 중뇌 발달 및 도파민성 뉴런 분화에 미치는 외인성 유전자 발현의 영향을 연구하기 위한 병아리 중뇌의 in ovo 전기천공법을 시연합니다. 먼저, 발달 중인 중뇌 소포에 외인성 DNA를 특이적으로 표적화하기 위해 hamburger Hamilton 단계 11의 병아리 배아 중뇌에 원하는 플라스미드 DNA를 주입합니다. 그 후, 맞춤 제작된 소형 전극을 사용하여 중뇌 소포에 전기천공을 실시함으로써 외인성 DNA를 중뇌 신경 전구세포에 특이적으로 전달합니다.다음으로, 중뇌에서 M cherry 발현이 양호한 23단계 배아를 수확하여 최적의 중뇌 횡단면을 제작합니다. 최종적으로, tyrosine hydroxylase와 같은 도파민성 신경세포 마커에 대한 면역 염색 분석을 통해 관심 유전자의 발현에 의해 유도된 신경 전구세포의 성숙한 도파민성 신경세포로의 분화를 확인할 수 있습니다. 기존의 다른 in ovo 전기천공법 대비 이 기술의 주요 장점은 본 프로토콜을 통해 막 특이적 전기천공을 달성함으로써 도파민성 신경세포 분화를 연구할 수 있다는 점입니다.이 방법은 중뇌 발달에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 신경계의 다른 부위에 적용하여 운명 지도 작성 분석을 수행하거나 유전자 발현 조절을 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다. Hamburger Hamilton stage 11 배아를 얻으려면, 각 수정란을 옆으로 눕히고 윗부분에 연필로 표시를 합니다. 그런 다음 트레이를 예열된 습윤 인큐베이터 내의 로커에 놓습니다.수정 후 41시간에 24시간마다 습도와 수위를 확인합니다. 배양기에서 알을 꺼내 실온에 보관합니다. 각 알의 표면을 70% ethanol로 세척하고 닦아냅니다.이제 4 cm 길이의 스카치테이프 두 조각을 달걀 위에 나란히 붙여 연필 표시 위에 커다란 직사각형을 만듭니다. 테이프를 달걀 표면에 밀착시켜 창을 만든 후, 18 gauge 바늘이 장착된 10 mL 주사기를 준비합니다. 배아를 방해하거나 손상시키지 않도록 바늘을 노른자 반대 방향으로 기울여 달걀 껍질을 뚫습니다.달걀에서 알부민 5 mL를 추출합니다. 바늘을 70% ethanol로 세척합니다. 다음 달걀을 찌르기 전에 바늘의 물기를 말립니다.화염 갈색 마이크로 피펫 풀러(flaming brown micro pipette puller)의 설정을 입력하십시오. 그런 다음 P 10 피펫을 사용하여 박벽 모세관 튜브를 주입용 바늘로 당겨 만듭니다. 롱 팁 모세관 피펫 팁에 5~10 µL의 플라스미드 용액을 흡입하십시오.그 다음, 공기 방울이 없도록 연속적인 기둥 형태로 유리 니들을 천천히 채웁니다. 채워진 니들을 마이크로 매니퓰레이터와 마이크로 인젝터에 연결된 니들 홀더에 장착합니다. 이제 해부 현미경 아래에서, 니들을 더 잘 시각화하기 위해 어두운 배경을 사용하여, 녹색 액체가 멈춘 지점에서 스프링 가위로 니들을 다듬습니다.이전의 바늘 구멍 부위에서 지름 2~2.5cm 크기의 창을 냅니다. 이는 알부민을 추출하기 위함입니다. 절개하는 동안 한 손으로 달걀을 회전시키십시오.알 사이에 가위의 오염물을 70% ethanol을 적신 kim wipe로 닦아내는 것을 잊지 마십시오. 해부 현미경으로 병아리 배아를 관찰합니다. 필요한 경우, 병아리 배아 아래에 0.22 micrometer 필터링된 PBS 내 20% India ink를 주입하여 배아를 시각화합니다. 배아의 머리가 바늘 반대 방향을 향하도록 하여 배아를 바늘의 경로와 평행하게 배치합니다.중뇌와 후뇌의 접합부에서 45도 각도로 신경관을 천천히 찌릅니다. 지속 시간을 25 milliseconds로 설정한 pico spritzer 미세 주입기로 주입을 시작합니다. 바늘의 상태에 따라 시간을 조절하여, Fast Green 염료가 포함된 플라스미드 DNA를 중뇌에 해당하는 신경낭에만 채웁니다.주입 바늘을 회수한 후, 배아 위에 pen strep 용액 세 방울을 떨어뜨립니다. 효율적인 전기천공을 위해 B-T-X-E-M-C eight 30 electro por의 설정을 확인합니다. 복측 중뇌 위치에서, 맞춤 제작된 작은 L자형 백금 전극을 신경관 바닥과 동일한 수평 높이에 배치하여 배아의 중뇌가 두 전극 사이에 중앙에 오도록 합니다.BTX 풋 스위치를 한 번 누르고 전극 주변에 생성되는 기포를 확인하십시오. 전기천공이 성공적으로 이루어질 때마다 전극을 알에서 조심스럽게 제거하고 닦아내십시오. 70% ethanol을 적신 화학 와이프로 닦은 후, 배아 위에 pen strep 용액을 다시 세 방울 떨어뜨리십시오.이제 투명 포장 테이프 5cm x 5cm 조각으로 창을 덮습니다. 달걀 내부 내용물을 건드리지 않고 달걀을 잘 밀봉한 후, 회전 장치를 끈 상태로 달걀을 다시 인큐베이터에 넣습니다. 원하는 단계에 도달하면, 각 조건별로 살아있는 배아를 PBS가 채워진 공용 페트리 접시에 수확합니다.다음으로 형광 해부 현미경을 사용합니다. 수확한 배아에서 m cherry 발현 여부를 스크리닝하고, 양성 배아를 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰에 갓 제조한 2%para formaldehyde 1 mL를 넣고 4 °C에서 3시간 동안 배양합니다.고정된 배아를 PBS로 3회 세척하고, 평형 상태에 도달할 때까지 15% sucrose에 둡니다. 30% sucrose에서 평형 과정을 반복한 후, 각 배아를 OCT에 매립하고 최적의 중뇌 횡단면을 얻을 수 있도록 배아의 방향을 적절히 잡습니다.배아 닭의 중뇌 in ovo 전기천공 분석(electroporation assay)에서 이후 분석을 위해 두꺼운 중뇌 조직의 18 micron 두께 cryostat 절편을 준비합니다. hh 단계 11의 닭 배아에 m cherry 형광 마커와 표적 유전자가 포함된 플라스미드 칵테일 및 주입 과정을 추적하기 위한 fast green 염색 추적자를 주입합니다. 중뇌 전기천공 후 배아를 추가로 배양하고, m cherry 양성 배아를 수확하여 고정 및 포매합니다.그 다음으로 중뇌 동결 절편을 제작합니다. 주입 및 전기천공이 성공적으로 이루어진 병아리 배아에서 tyrosine hydroxylase와 같은 중뇌 마커를 이용한 면역 염색으로 시료를 분석합니다. m cherry 발현을 주입 마커로 사용하여 추가 발달 후 중뇌 영역에서 m cherry 발현을 일반적으로 확인할 수 있습니다.m cherry 발현이 적절하게 나타나는 배아를 고정한 후, 포매하여 중뇌 동결 절편을 준비할 수 있도록 방향을 잡습니다. 여기서는 m cherry 및 flag 태그가 붙은 유전자가 도파민성 뉴런 마커인 tyrosine hydroxylase와 함께 공동 국소화되는지를 통해, 전기천공법이 적용된 신경 전구세포의 도파민성 분화를 확인합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 중뇌 부위에 특이적으로 DNA 구조체를 주입하는 방법과 맞춤 제작된 소형 전극을 사용하여 전기천공 위치를 정밀하게 지정하는 방법을 포함하여, 배아 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포에 유전자 발현을 지역적으로 제한하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.RNI 매개 락다운(lockdown)이나 리포터 유전자에 연결된 인핸서의 발현과 같은 다른 방법들을 통해 신경계의 특정 영역 및 세포 유형에서 유전자 기능과 유전자 조절을 연구할 수 있습니다.

in-ovo-electroporation-chick-midbrain-for-studying-gene-function

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

청각 기관은 청각을 중재합니다. 여기에서는 발달 중인 닭 청각 기관에서 청각 전구 세포 증식 및 분화를 연구하기 위해 최적화된 수정된 in ovo micro-electroporation 방법을 제시합니다.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

학습하세요 병아리 중뇌에서 in ovo 전기영동법을 이용한 도파민성 신경 세포 분화 연구 방법을. 맞춤형 전극으로 유전자를 표적 전달하여 중뇌 발달 및 신경 전구세포 분화 메커니즘을 분석할 수 있습니다.

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