Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

본 실험에서는 외생 유전자 발현이 중뇌 발달 및 도파민성 뉴런 분화에 미치는 영향을 연구하기 위해 닭 배아의 중뇌 내-오보(in ovo) 전기천공법을 시연합니다. 먼저, 외생 DNA를 발달 중인 중뇌 소포에 특이적으로 표적화하기 위해 햄버거-해밀턴(Hamburger-Hamilton) 단계 11의 닭 배아 중뇌에 원하는 플라스미드 DNA를 주입합니다. 그런 다음, 맞춤 제작된 소형 전극을 사용하여 중뇌 소포에 전기천공을 실시함으로써 외생 DNA를 중뇌 신경 전구세포에 특이적으로 전달합니다.

다음으로, 중뇌에서 M cherry 발현이 양호한 23단계 배아를 수확하여 최적의 중뇌 횡단면을 제작합니다. 최종적으로 tyrosine hydroxylase와 같은 도파민성 신경세포 마커에 대한 면역 염색 분석을 통해, 표적 유전자의 발현으로 유도된 신경 전구세포의 성숙한 도파민성 신경세포로의 분화를 확인할 수 있습니다. 기존의 다른 in ovo electroporation 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 본 프로토콜을 통해 막 특이적 electroporation을 구현함으로써 도파민성 신경세포 분화를 연구할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 중뇌 발달에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 신경계의 다른 부위에 적용하여 운명 지도 분석(fate mapping analysis)을 수행하거나 유전자 발현 조절을 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다. hamburger Hamilton 단계 11 배아를 얻으려면, 각 수정란을 옆으로 눕히고 윗부분에 연필로 표시를 합니다. 그런 다음 트레이를 미리 가온된 가습 인큐베이터 내의 로커(rocker) 위에 놓습니다.

수정 후 41시간째에 24시간마다 습도와 수위를 확인하십시오. 인큐베이터에서 알을 꺼내 실온에 보관하십시오. 각 알의 표면을 70% ethanol로 세척하고 닦아냅니다.

이제 4cm 길이의 스카치테이프 두 조각을 달걀 위의 연필 표시 부분에 나란히 붙여 커다란 직사각형을 만듭니다. 테이프를 달걀 표면에 밀착시켜 창을 고정합니다. 18게이지 바늘이 장착된 10mL 주사기를 준비합니다. 배아를 방해하거나 손상시키지 않도록 바늘을 노른내 반대 방향으로 기울여 달걀 껍질을 뚫습니다.

달걀에서 알부민 5 mL를 추출합니다. 바늘을 70% ethanol로 세척합니다. 다음 달걀을 찌르기 전에 바늘을 건조시킵니다.

화염 갈색 마이크로 피펫 풀러(flaming brown micro pipette puller)의 설정을 입력하십시오. 그 다음 P 10 피펫을 사용하여 얇은 벽의 모세관 튜브를 주입용 바늘로 당겨 만듭니다. 긴 팁 모세관 피펫 팁에 5~10 µL의 플라스미드 용액을 취하십시오.

그런 다음 유리 니들을 공기 방울이 없는 연속적인 기둥 형태로 천천히 채웁니다. 채워진 니들을 마이크로 매니퓰레이터와 마이크로 인젝터에 연결된 니들 홀더에 장착합니다. 이제 해부 현미경 아래에서, 니들을 더 잘 시각화하기 위해 어두운 배경을 사용하여 스프링 가위로 녹색 액체가 멈추는 지점에서 니들을 절단합니다.

이전의 바늘 구멍을 중심으로 지름 2~2.5cm 크기의 창을 냅니다. 이는 알부민을 추출하기 위한 것입니다. 절개하는 동안 한 손으로 달걀을 회전시키십시오.

알 사이마다 70% ethanol을 적신 kim wipe로 가위를 닦아내십시오. 해부 현미경으로 병아리 배아를 관찰합니다. 필요한 경우, 병아리 배아 아래에 0.22 micrometer 필터링된 PBS 내 20% India ink를 주입하여 배아를 시각화하십시오. 바늘의 진행 방향과 평행하게 배아를 배치하되, 머리 부분이 바늘 반대 방향을 향하게 합니다.

중뇌와 후뇌의 접합부에서 45도 각도로 신경관을 천천히 찌릅니다. 지속 시간을 25밀리초로 설정한 pico spritzer 마이크로 인젝터로 주입을 시작합니다. 바늘의 다듬기 상태에 따라 시간을 조정하여, fast green 염료가 포함된 플라스미드 DNA를 중뇌에 해당하는 신경낭에만 채웁니다.

주입 바늘을 회수한 후, 배아 위에 펜-스트렙(pen strep) 용액 세 방울을 떨어뜨립니다. 효율적인 전기천공을 위해 B-T-X-E-M-C eight 30 electro por의 설정을 확인하십시오. 배아의 중뇌가 두 전극 사이에 중앙에 오도록, 신경관 바닥과 동일한 수평 높이의 복측 중뇌 위치에 맞춤 제작된 작은 L자형 백금 전극을 배치합니다.

BTX 풋 스위치를 한 번 누르고 전극 주변에 생성되는 공기 방울을 확인하십시오. 전기천공이 성공할 때마다 전극을 알에서 조심스럽게 제거하고 전극을 닦아내십시오. 70% ethanol이 묻은 chem wipe를 사용하여 배아 위에 pen strep 용액 세 방울을 더 떨어뜨립니다.

이제 5 cm x 5 cm 크기의 투명 포장 테이프로 창을 덮습니다. 달걀 내부 물질에 닿지 않도록 주의하며 달걀을 잘 밀봉한 후, 회전판이 꺼진 상태의 배양기에 다시 넣습니다. 원하는 단계에 도달하면, 각 조건별로 살아있는 배아를 PBS가 채워진 공통 페트리 접시에 수확합니다.

다음으로 형광 해부 현미경을 사용합니다. 수확한 배아에서 m cherry 발현 여부를 스크리닝하고, 양성 배아를 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰에 갓 제조한 2% paraformaldehyde 1 mL를 채우고 4 °C에서 3시간 동안 배양합니다.

고정된 배아를 PBS로 3회 세척하고, 평형 상태에 도달할 때까지 15% sucrose에 넣어둡니다. 30% sucrose에서 평형화 과정을 반복한 후, 각 배아를 OCT에 매립합니다. 이후 분석을 위해 최적의 중뇌 횡단면이 생성되도록 배아의 방향을 적절히 맞춥니다.

배아 닭 중뇌-인 오보(in ovo) 전기천공 분석 hh에서 후속 분석을 위해 두꺼운 중뇌의 18 micron 두께 cryostat 절편을 준비합니다. 11단계 닭 배아에 m cherry 형광 마커와 관심 유전자, 그리고 주입 과정을 추적하기 위한 fast green 염색 추적자로 구성된 플라스미드 칵테일이 주입됩니다. 중뇌 전기천공 후, 배아를 추가로 배양하고 m cherry 양성 배아를 수확하여 고정 및 포매합니다.

그 후 중뇌의 동결 절편을 제작합니다. 주입 및 전기천공이 성공적으로 이루어진 병아리 배아의 샘플을 tyrosine hydroxylase와 같은 중뇌 마커를 이용한 면역 염색으로 분석합니다. 추가 발달 후에는 m cherry 발현을 주입 마커로 사용하여 일반적으로 중뇌 영역에서 m cherry 발현을 확인할 수 있습니다.

m cherry가 적절하게 발현되는 배아를 고정하고 포매한 후, 중뇌 cryo 절편을 준비하기 위해 방향을 잡습니다. 여기서는 m cherry 및 flag 태그 유전자와 도파민성 뉴런 마커인 tyrosine hydroxylase의 공국소화를 통해, 전기천공법이 적용된 신경 전구세포의 도파민성 운명 지정 여부를 확인합니다. 이 영상을 시청한 후에는 DNA 구조체를 중뇌 영역에 특이적으로 주입하는 방법과 맞춤형 소형 전극을 사용하여 전기천공 위치를 정확히 지정하는 방법을 포함하여, 배아 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포에 유전자 발현을 지역적으로 제한하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

RNI 매개 락다운(lockdown) 또는 리포터 유전자와 연결된 인핸서의 발현과 같은 다른 방법들을 통해 신경계의 특정 영역 및 세포 유형에서 유전자 기능과 유전자 조절을 연구할 수 있습니다.