랫 Splenocytes에서 T 세포 성장 인자 준비

안녕하세요, 저는 크리스틴 비튼입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스(University of California at Irvine)의 생리학 및 생물물리학과 조지 첸(George Chen) 연구실의 조교수입니다. 그리고 앞으로 이틀 동안 T 세포 성장 인자를 의미하는 TCGF를 준비하는 방법을 보여 드리겠습니다.

따라서 일상적인 세포 배양을 위해 배양 배지의 사이토카인 구성에 대한 정확한 지식이 필요하지 않을 때 사용하는 것은 T 세포 증식을 돕는 데 필요한 사이토카인을 포함하는 spl CY 배양에서 추출한 S 상등액인 T 세포 성장 인자입니다. 그래서 우리가 TCGF를 준비하는 방법은 건강한 루이 쥐를 죽일 때, 그들의 비장을 채취하고, 단세포 현탁액을 준비하고, 적혈구를 제거하고, 그 다음 단핵 세포를 콘 카니발로 자극하여 T 세포가 성장에 필요한 모든 사이토카인을 생성하도록 유도하는 것입니다. TCGF를 생성하려면 세포를 활성화해야 합니다.

그래서 우리가 하는 방법은 세포 배양에 코로나 A로 약칭되는 렉틴 컨벌을 추가하는 것입니다. 따라서 세포 배양에 conc를 추가하면 glycosylated T 세포 수용체 복합체에 결합하고 동시에 여러 복합체에 결합하는 것이 캡핑(capping)이라고 하는 작업을 수행합니다. 그래서 그것은 뭉쳐서 세포 표면에 있는 모든 수용체의 클러스터를 만들고 T 림프구에서 활성화 신호를 유도할 것입니다.

따라서 세포가 활성화되고 나면 폭발할 것입니다. 그래서 그들은 커질 것이고 그 다음에는 사이토카인을 분비하기 시작할 것입니다. 그래서 처음에 우리는 TCGF가 주로 인터루킨 2라고 생각했지만, 이제는 그렇지 않다는 것을 알게 되었습니다.

또한 인터페론, 감마, TNF, 알파 및 아마도 매우 적은 양의 사이토카인을 함유하고 있어 48시간 후에도 세포를 살아 있게 유지하는 데 필요한 배양에서 세포는 우리가 필요로 하는 모든 사이토카인을 생산합니다. 그래서 우리는 세포를 제거할 것이고 세포를 제거하고 상층액만 가지고 있을 때, 우리는 여전히 snat의 a에 약간의 자유 원뿔을 가지고 있습니다. 그리고 그것은 문제가 될 것인데, 왜냐하면 우리는 T 세포 성장 인자를 사용하여 T 세포주가 계속 자라기를 원하기 때문입니다.

그리고 만약 우리가 그 세포를 빈 공간에 남겨둔다면, 우리가 세포가 활성화되는 것을 원하지 않을 때 세포를 활성화시킬 것입니다. 그래서 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 아테의 모든 자유 덩어리에 결합할 설탕을 과도하게 첨가할 것입니다. 따라서 TCGF는 완전히 비활성화되고 TCGF를 배양에 추가할 때 세포의 다른 글리코실화 수용체에 결합하지 않습니다.

시작하겠습니다. 이 실험의 첫 번째 단계는 안락사 직후 쥐의 비장을 제거하는 것입니다. 이것이 제가 멸균 기구를 사용하여 바로 할 일입니다.

그리고 비장을 꺼내면 항생제를 보충한 PBS에 넣고 항생제로 페니실린과 스트렙토마이신을 사용합니다. 시작하겠습니다. 그래서 나는 내 배양에 큰 오염이 없는지 확인하기 위해 쥐에게 70% 에탄올을 뿌립니다.

그런 다음 도구를 사용하여 여기 피부에 작은 상처를 낼 것입니다. 그런 다음 근육층을 제거하면 비장이 바로 여기에 나타납니다. 그래서 다른 핀셋을 사용하여 비장을 손상시키지 않고 부드럽게 잡아 당깁니다.

이렇게 연결 결합 조직을 제거합니다. 그래서 이제 비장이 생겼습니다. 물론, 나는 복강 내부의 다른 어떤 것도 손상시키지 않도록 매우 조심하고 있는데, 왜냐하면 장에 손상이 생기면 내 비장이 즉시 오염될 것이기 때문이다.

그런 다음 PBS와 항생제가 들어 있는 튜브에 비장을 이식할 것입니다. 그리고 이 튜브는 얼음 위에 보관합니다. 그래서 이제 나는 세 마리의 쥐에서 비장을 채취했습니다.

그래서 우리는 그 비장에서 단세포 현탁액을 준비할 준비가 되었습니다. 그래서 이제 비장이 생겼으니 조직 배양실로 가져와서 70미크론 세포 트레이너를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비했습니다. 그래서 저는 비장에서 단세포 현탁액을 만들기 위해 몇 가지가 필요할 것입니다.

멸균 기구, 집게 한 쌍, 가위 한 쌍이 필요합니다. 그런 다음 페트리 접시에 멸균 된 1 밀 주사기의 플런저가 있습니다. 저는 PBS와 항생제를 투여할 것입니다.

그리고 또 다른 페트리 접시에는 PBS 10밀리리터와 항생제에 70미크론 세포 여과기를 넣었습니다. 첫 번째 단계는 비장이 깨끗한지 확인하는 것인데, 여기 보시다시피 아직 작은 결막 조직 조각이 있고 세포 여과기를 정말 빨리 막을 것이기 때문에 제거할 것입니다. 그래서 저는 단순히 원하지 않는 것을 잘라서 페트리 접시 뚜껑에 버립니다.

그래서 이제 제 비장은 대부분 깨끗해졌기 때문에 비장을 하나씩 가져다가 세포 트레이너에 넣고 작은 조각으로 자릅니다. 다음 단계는 단일 세포 현탁액을 만드는 것입니다. 그래서 물론 나는 모든 것을 원하기 때문에 세포 트레이너를 전혀 건드리지 않고 멸균 1 mil 주사기의 플런저를 사용하여 세포 트레이너를 통해 비장 조각을 누릅니다.

그리고 셀 트레이너 외부에서 볼 수 있듯이 단일 세포 현탁액이 만들어지고 있습니다. 그래서 처음으로 저는 여전히 작은 비장 조각이 있지만 이미 단세포 현탁액을 제거할 것입니다. 나는 이미 얼음 위에 보관한 50mil 튜브로 옮겼습니다.

그리고 저는 제 세포 여과기에 PBS와 항생제를 10mil 더 채울 것입니다. 그래서 저는 항생제와 함께 PBS를 10mil 더 복용하는데, 정확히 10분일 필요는 없고 그냥 씻기만 하면 됩니다. 세포 여과기에 넣고 같은 절차를 사용합니다.

나는 다시 주사기 플런저로 돌아가 오시드를 조금 더 누른다. 그러니까 당연히 모든 것을 다 통과할 수는 없겠죠, 왜냐하면 제가 제거할 수 없었던 결막 조직과 작은 지방 조각들이 세포 여과기에 남아 있기 때문입니다. 그러나 비장의 대부분을 세포 여과기로 사용해야 합니다.

그리고 나서 나는 내가 전에 했던 것을 정확히 반복한다. 나는 단세포 현탁액을 채취하여 같은 치아에 첨가할 것입니다. 지금쯤이면 세포 스크리너에 남은 화면에는 거의 아무것도 남아 있지 않고 나오는 PBS는 훨씬 더 선명합니다.그리고 저는 한 번만 더 씻을 것이고 지금쯤이면 대부분의 세포를 꺼낼 것입니다.

이제 PLE cyte의 단일 세포 현탁액이 있고 간단히 팔레트를 만들기 위해 스핀다운할 것입니다. 따라서 8분에서 10분 동안 회전하는 것으로 충분합니다. 이제 PLE cyte를 줄였고 멋진 팔레트를 만들었습니다.

그래서 제가 할 일은 상층액을 제거하고 적혈구를 제거하는 것입니다. 그래서 저는 근세포를 현탁시키고 염화암모늄으로 갈 것입니다. 이것은 SU, 즉 오 포인트 15 몰 염화 암모늄의 용액이며 비장당 5밀리리터를 사용할 것입니다.

그래서 저는 비장이 세 개 있었기 때문에 15ml의 염화암모늄을 사용할 것이고 얼음 위에서 그렇게 할 것입니다. 그래서 적혈구를 놓기 위해 3분 동안 부드럽게 위아래로 파이프를 연결하겠습니다. 좋아요, 여기서는 더 높은 노출로 이 테이크를 사용하겠습니다.

이제 3분 동안 전기세포를 분석했습니다. 튜브에 PBS를 채우거나 매체를 사용할 수도 있습니다. 이는 용액의 삼투압을 세포의 정상 범위로 되돌리

그리고 이전에 했던 것처럼 8분에서 10분 동안 세포를 회전시켜 펠릿으로 만들 것입니다. 그런 다음 항생제와 함께 동일한 PBS를 사용하여 두 번 씻습니다. 이제 우리는 전기세포를 배양한 후 세포를 확장하며 전기세포가 100% 방출되지 않더라도 걱정하지 않아도 됩니다.

따라서 팔레트는 여전히 빨간색이지만 상등액은 더 투명합니다. 이제 상층액을 비우고, 팔레트를 부수고, 최대 50mil의 PBS를 추가하고, 스핀다운하고 해당 단계를 한 번 더 반복하여 두 번의 세척을 한 다음 스스로 셀 수 있습니다. 나는 근세포를 두 번 세척한 다음 배양 배지에 매달아 놓고 세포 분석기를 사용하여 계산했습니다.

예상대로. 세 개의 비장에서 약 6억 개의 세포를 얻었는데, 이는 하나의 비장이 보통 2억에서 2억 5천만 개의 세포를 제공하기 때문에 예상되는 수치입니다. 그래서 제가 지금 할 일은 10%의 태아 칼 혈청이 보충된 배지에 밀당 200만 개의 세포를 파종

그리고 그 매질에 세포를 자극하기 위해 conc A 1밀당 2마이크로그램을 추가할 것입니다. 그 후 세포를 48시간 동안 인큐베이터에 넣기만 하면 됩니다. 세포는 이제 48시간 동안 인큐베이터에 있었고 제가 보여드리겠지만 꽤 잘 자랐습니다.

매체가 주황색으로 변했습니다. 이제 TCGF를 위한 준비를 마칠 준비가 되었습니다. 기억하시다시피, 저는 세포를 활성화하기 위해 세포 현탁액에 콘 카니발을 추가했습니다.

그래서 a의 con carnaval은 lectin입니다. 그것은 T 세포의 모든 수용체에 있는 당과 결합하여 모든 세포를 인위적으로 활성화시킬 것입니다. 우리가 지금 가지고 있는 문제는 세포 S 상등액에 여전히 일부 카니발이 있다는 것입니다.

그리고 우리는 세포를 확장하기 위해 다른 T 세포 배양에서 스내트를 사용할 것이기 때문에 이러한 세포 배양에 존재하는 콘 카니발을 원하지 않습니다. 그래서 그것을 없애기 위해, 제가 할 일은 바인드의 해군이 결합하는 설탕을 과도하게 첨가하는 것인데, 이것이 바로 여기에 표시된 메틸 알파 D 세포입니다. 그리고 이 설탕을 과도하게 첨가하여 완전히 녹일 것입니다.

그것은 남아있는 모든 conc naval을 묶을 것입니다.그리고 그것이 완료되면, 저는 세포 상층액을 멸균 여과하고 앞으로 몇 주 또는 몇 달 안에 사용하기 위해 Ali 액체를 동결 할 것입니다. 이제 이 마지막 단계를 시작하겠습니다. 그래서 저는 세포 배양 상등액을 50mil 튜브에 첨가하여 세포를 제거하기 위해 회전시킬 수 있습니다.

그래서 저는 단순히 필요한 만큼의 튜브를 채우고 배양 후드에서는 그렇게 하지 않습니다, 할 수 있지만, 멸균되지 않은 설탕을 첨가하기 때문에 결국 용액을 여과할 방법이 필요하기 때문에 벤치에서 간단히 합니다. 더 쉽습니다. 나는 이제 50mil falcon 튜브에 모든 세포와 상층액을 부었습니다.

그래서 저는 그것들을 원심분리기로 가져와서 약 10분 동안 돌릴 것입니다. 그리고 그것들을 회전시키는 유일한 이유는 세포를 펠릿화하여 투명한 상층액을 갖도록 하기 위함입니다. 이제 세포가 아래로 뻗어 있으므로 상층액이 투명하고 그것이 제가 수집하고 싶었던 것입니다.

그래서 저는 모든 상층액을 깨끗한 150제곱센티미터 플라스크에 모을 것입니다. 그리고 이 플라스크에 설탕을 넣겠습니다. 그래서 세포가 빙빙 돌고 있는 동안, 나는 상등액 ml당 15mg을 추가할 수 있을 만큼의 설탕을 잰다.

나는 완전히 놔두고, 녹게 놔두고, 그 후에 상층액을 살균 여과할 것입니다. 이제 상등액 ml당 설탕 15mg을 추가하겠습니다. 뚜껑을 다시 끼우고 멸균 상태에서 작업하지 않기 때문에 뚜껑에 먹은 음식이 들어가도 상관없어서 설탕이 모두 녹을 때까지 섞습니다.

그것은 꽤 빠를 것입니다. 예, 이제 모든 설탕이 녹았습니다. 그래서 제가 해야 할 일은 멸균 필터가 상층액이고 그 다음에 분취

그래서 보통 저는 영하 20도에서 보관하는 10-15 mil 부분 표본을 합니다. 이와 같은 부분 표본은 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. TCGF를 냉장고에 보관할 수도 있지만 앞으로 10일에서 15일 이내에 사용할 것입니다.

지난 이틀 동안 T 세포 성장 인자를 준비하는 방법을 보여 드렸는데,이 상등액은 만들기가 매우 간단하고 준비하는 데 매우 저렴합니다. 그래서 우리는 값비싼 사이토카인 칵테일을 구입할 필요 없이 배양에서 T 세포주를 유지하기 위해 실험실에서 매우 자주 사용합니다. 그러니 당신의 실험에 행운을 빕니다.