로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성

이 절차의 전반적인 목적은 균질화된 불멸화 뇌 혈관 내피 세포 배양물을 얻는 것입니다. 이는 먼저 신생 생쥐에서 뇌를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 polyoma middle T antigen을 사용하여 세포를 불멸화하는 것입니다.

다음으로, 균질한 혈관 내피 세포 단층이 형성될 때까지 약 4주 동안 세포를 배양합니다. 마지막 단계는 면역 염색, Western blot 및 Q-Q-P-C-R과 같은 기술을 사용하여 새로운 세포주를 특성 분석하는 것입니다. 이 기술은 전임상 치료 평가와 병태생리학적 통찰력을 얻을 수 있으므로, 신경 염증성 또는 허혈성 뇌 질환 치료에까지 응용될 수 있습니다.

실험 절차 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Elaine Salvador 박사가 맡아 진행하겠습니다. 버퍼 A가 담긴 페트리 접시로 옮긴 생후 3~5일 된 신생 마우스에서 뇌를 적출한 후, 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 작업하며 매 조제 시 마우스 5~10마리 분량의 뇌를 준비합니다. 각 뇌에서 소뇌, 뇌줄기, 뇌수막 및 모세혈관 파편을 제거합니다.

그 다음 대뇌를 buffer A가 들어있는 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균된 메스로 대뇌를 작은 조각으로 자른 후, 10 milliliter 피펫을 사용하여 덩어리가 보이지 않을 때까지 조직과 버퍼를 흡입하고 배출합니다. 이 단계에서, 뇌 조직을 실온에서 250 times G로 5분 동안 원심분리한 후 현탁액을 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 1.5 milliliters의 0.75%weight per volume이 포함된 4.5 milliliters의 buffer A에 녹입니다.

콜라게나아제를 첨가합니다. 조직과 콜라게나아제 용액을 37 °C 항온수조에서 가끔씩 흔들어주며 45분 동안 배양합니다. 그동안 12-웰 플레이트의 웰 4개에 0.1 mg/mL 멸균 용액을 코팅하여 조직 배양 플레이트를 준비합니다.

콜라겐 4와 50 millimolar 아세트산은 상온에서 1시간 동안 콜라겐이 웰에 부착되도록 합니다. 45분간의 배양 시간이 지나면, 15 milliliters의 buffer A를 첨가하여 뇌 조직의 소화를 중단시키고 펠릿을 이 용액에 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 250 ×g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

다음으로, 준비물에서 미엘린을 제거하기 위해 멸균된 25% w/v B, s, A 및 PBS 10 milliliters를 조직에 첨가하고 4°C에서 1000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 버리고, 펠렛을 buffer A 15 milliliters에 녹여 새로운 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮긴 후 상온에서 250 ×g로 5분 동안 다시 원심분리합니다. 그동안 collagen IV 코팅 플레이트를 PBS로 2회 세척합니다.

두 번째 세척 후, 두 개의 웰은 비워두고 나머지 두 개의 웰에 2 mL의 성장 배지를 추가합니다. 상층액을 제거한 후, 주로 혈관 내피세포로 구성된 세포 펠렛을 4 µg/mL의 puromycin이 포함된 성장 배지 4 mL에 재현탁하고, 세포 현탁액 2 mL씩을 비어 있는 콜라겐 코팅 웰 두 곳에 각각 분주합니다. 빠르게 부착되는 비내피세포를 제거하기 위해 37 °C에서 45분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포가 들어있지 않은 두 개의 웰에서 성장 배지를 흡입하여 제거합니다.

그 다음, 내피세포 분획이 포함된 비부착 세포 함유 배지를 이 두 웰로 옮깁니다. 이전 웰에는 2 mL의 신선한 배지를 다시 채웁니다. 이 웰들에는 섬유아세포 및 성상교세포와 같은 다른 세포 유형들이 포함되어 있으며, 이를 병행 배양하여 형태학적 비교에 사용할 수 있습니다.

세포를 조직 배양 인큐베이터에서 다음 날까지 하룻밤 동안 배양하십시오. 폴리오마 middle T 온코진(polyoma middle T oncogene)을 가진 복제 결핍 바이러스를 분비하는 GPE neo 섬유아세포를 GPE neo 배지가 포함된 젤라틴 코팅 플라스크에서 배양하고 신선한 배지로 교체하십시오. 폴리오마 middle T 온코진의 형질전환은 비내피세포에 비해 내피세포의 성장 우위를 유도하여 내피세포 형태를 가진 균일한 세포 단일층을 형성하게 합니다. 4~6주간의 배양 후, GPE neo 세포는 시중에서 판매되지 않으므로 공공 공유 자료로 구할 수 있습니다.

GPE Neo Fiberblast를 24시간 동안 배양한 후, 배지 10 mL를 제거하고 멸균된 poly brain 용액을 최종 농도가 8 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 상층액 혼합물을 0.45 µm 필터로 여과하여 세포 파편을 제거합니다. 이제 혈관 내피세포 배양액의 배지를 흡입하여 제거하고, 하룻밤 동안 배양한 후 웰에 상층액 poly brain 혼합물 2 mL를 첨가합니다.

다음 날, 새로운 상층액 poly brain 혼합물 분량을 사용하여 이 절차를 반복하십시오. 상층액 poly brain 혼합물을 제거합니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 신선한 성장 배지를 추가하십시오.

세포가 합류(confluent) 상태가 될 때까지 3일마다 배양액을 계속 교체하고, 콜라겐 IV 코팅 플레이트에 세포를 1~2회 계대 배양합니다. 안정적인 뇌혈관 내피세포 라인은 일반적으로 4~5주간의 연속 배양 후 얻어집니다.

균질한 내피 세포 단층이 웰 전체를 채웠을 때입니다. 안정적인 세포주가 확보되면, collagen IV가 코팅된 조직 배양 플라스크로 옮겨 심고, 3 mL의 trypsin EDTA를 사용하여 37 °C에서 세포층이 분산될 때까지 5~15분 동안 배양함으로써 일주일에 한 번 이하로 세포를 계대 배양하십시오. 5 mL의 배지를 추가한 후 새 플라스크에 분주하며, 분할 비율이 1:4를 초과하지 않도록 하십시오.

T 75 플라스크가 합류(confluent)될 정도로 충분한 세포가 확보되면, 추후 사용을 위해 세포의 동결 보존분(cryo quats)을 준비할 수 있습니다. 이를 위해 이전과 같이 트립신으로 세포를 회수한 다음, 세포 현탁액을 250 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 실온에서 세포 펠렛을 6 mL의 동결 배지에 재현탁한 후, 세포 현탁액 1.5 mL를 4개의 동결 보존 튜브에 나누어 분주합니다.

크라이오 바이알을 이소프로판올이 채워진 Nalgene 냉동 컨테이너에 넣고 영하 80°C에서 하루 동안 보관하십시오. 마지막으로, 크라이오 바이알을 액체 질소에 보관하십시오. 수조에서 세포가 담긴 크라이오 쿼드를 해동한 다음, 10mL의 성장 배지가 들어 있는 15mL 원심 분리 튜브로 옮기십시오.

배지를 37 °C로 예열하고, 튜브를 상온에서 250 ×g로 5분간 원심분리합니다. 배지를 흡입하여 제거한 후, 펠렛을 적절한 부피의 성장 배지로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 예열된 성장 배지가 담긴 collagen IV 코팅 T 25 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.

분주 시 세포 밀도는 최소 1 × 10⁴ cells/mL여야 합니다. 다음 날 배지를 교체하고, 약 5일 후 세포가 confluent 상태에 도달할 때까지 이전과 동일하게 계대 배양을 계속하십시오. 이후 다음 실험을 위해 원하는 밀도로 세포를 분주합니다. CEN 세포는 내피 및 혈뇌장벽(blood-brain barrier) 마커의 면역 염색을 통해 특성을 분석하였습니다.

이 이미지는 clain five에 대해 면역 염색된 C and 세포의 형태를 보여줍니다. C and 세포는 성장 억제가 나타나는 조밀하게 채워진 신장된 세포의 단층을 형성하는 뇌 ECS의 1차 배양과 유사한 형태를 보입니다. 완전한 합류 상태에서, 세포는 검출 가능한 수준의 clain을 발현했습니다.

여기에서는 C CN 세포를 occludin 항체로 면역 염색하였습니다. 또한, 면역형광 염색을 통해 세포 간 접합부에 국소화된 VE cadherin 단백질의 발현을 확인할 수 있습니다. 경내피 전기 저항은 전류 통과 전극과 전압 측정 전극이 포함된 장치를 사용하여 측정하였습니다.

이 그림을 통해 C end 세포의 경내피 전기 저항이 배양 후 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 마우스 모델에서 뇌혈관 질환을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.