Name: 로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성 체외에서 혈액 뇌 장벽 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 배우세요 생쥐 뇌 미세혈관 내피 세포를 불후화하여 혈액뇌장벽 모델을 구축하는 방법을. 이 기술은 신경염증성 및 허혈성 뇌질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 보조금 번호 FO 315/4-1 및 DFG SFB 688에서 독일 Forschungsgemeinschaft DFG의 지원을했습니다.

1. 뇌 Microvessels의 절연 <ol><li> 각 준비 중 여성의 5-10 신생아 마우스 (3-5일 이전)을 사용합니다. </li><li> 지역 IACUC / 수의사 추천에 따라 마우스를 안락사시켜야 즉시 뇌를 제거하고 다음과 같은 솔루션을 포함하는 페트리 접시에 전송 : 15 밀리미터 Hepes (산도 7.4), 153 MM NaCl, 5.6 MM KCl, 2.3 MM CaCl 2 X 2H 2 O, 2.6 MM MgCl 2 X 6H 2 O, 1 % (w / V) BSA (이하와 같은 A를 버퍼링 참조). </li><li> 특별히 명시하지 않는 한, 모든 절연 절차는 층류의 후드 아래에 실내 온도 (RT) (22-24 ° C)에서 수행해야합니다. 버퍼에, meninges 및 모세관 조각을 제거 후, ​​머리를 (소뇌와 뇌간이없는 꿈) 잘라 멸균 메스를 사용하여. 조직가 조각 피펫 아래로 더 clumps가 나타나지 때까지 10 ML의 피펫을 사용합니다. RT에서 5 분 250 XG에서 50 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 정지 전송합니다. </li></ol> 참고 : Meninges는 뇌 세포의 표면에 얇은 투명 멤브레인으로 식별 할 수 있습니다. 그들은 조심스럽게 무균 집게로 제거 할 수 있습니다. <ol start="4"><li> 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 4.5 ML 버퍼에있는 펠릿을 분해 0.75 %의 1.5 ML (w / V)와 collagenase / dispase (로슈)와 37 번 45 분 ° 물 욕조에서 C (가끔 흔들어)에 품다. </li><li> 한편, 콜라겐 IV (0.1 밀리그램 / 50 MM 아세트산에 용해 ML)로 코팅 네 우물을하여 12 잘 접시를 준비합니다. 1 시간에 준수 할 수 있습니다. </li><li> 15 ML 얼음처럼 차가운 버퍼 A. Resuspend 철저하게 펠릿의 추가하여 소화를 중지합니다. </li><li> RT에서 10 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> myelin을 제거하려면, 4 ° C.에 20 분 1,000 XG에서 10 ML 25% (w / V) BSA (시그마, 순도&gt; 98%)와 원심 분리기를 추가 25 % BSA는 1X PBS (PAA Laboratories의)에 용해 및 0.2 μm의 F를 통해 필터링해야합니다ilter). </li><li> 표면에 뜨는을주의 깊게을 삭제, 10 ML 버퍼에있는 펠릿을 분해하고 새로운 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. 그 결과 펠렛은 내피 세포가 포함되어 있습니다. </li><li> PBS로 두 번 콜라겐 IV-코팅 12도 판을 씻으십시오. </li><li> 이 우물, 각도 2 ML에 4 성장 매체의 ML (DMEM 10 % FCS, 50U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민을 포함)와 플레이트 세포 현탁액에서 펠렛을 Resuspend. 37 번 45 분 4 μg / ML 및 배양의 최종 농도 ° 세포 문화 인큐베이터에서 C로 puromycin을 추가합니다. 이 단계는 급속하게 준수 세포의 제거를 할 수 있습니다. 참고 : Puromycin는 24 시간에 추가됩니다. 만 뇌 ECS는 다른 세포 유형에 puromycin 14 독성이며,이를 흡수 할 수 있습니다. </li><li> 이 새로운 우물 (이 우물은 EC 분획을 포함)에 단계 1.14에서 비 준수 세포를 포함하는 2 ML 매체를 전송합니다. STE의 준수 세포로 우물을 작성P 2 ML 신선한 매체 (이 우물은 다른 세포 유형, 예를 들어 섬유 아세포, astrocytes을 포함하고 병렬로 성장하고 형태의 비교에 사용할 수 있습니다)에 1.14. </li><li> 다음 날 매체를 변경합니다. </li></ol> 2. 브레인 Microvascular 내피 세포를 Immortalizing <ol><li> GP + E-86 네오 (GPENeo) 15 섬유 아세포, 분비 10% 열 inactivated FCS, 50U/ml 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 MG / ML G418을 (포함 DMEM 매체에 polyoma 중 T의 종양 유전자와 복제 - 결함 바이러스를 배양 . 젤라틴 코팅 플라스크에 PAA Laboratories의) 참고 : Polyoma 중 T의 종양 유전자의 transfection은 4~6주 문화의 내피 형태로 세포의 동질적인 monolayer로 이어지는 비 ECS를 통해 ECS의 성장 우위가 발생합니다. GPENeo가 상업적으로 사용할 수 없으며 (원본 출판물에 4,16을 참조하시기 바랍니다) 공유 공공 소재로 얻을 수 있습니다. </li><li> 에 대한 바이러스 함유 미디어를 사용하려면<html> 불멸화, 24 H에 G418 무료 매체에 GPENeo 세포를 배양. </li><li> GPEneo 표면에 뜨는 10 ML을 제거 및 8 μg / ML의 최종 농도에 Polybrene (hexadimethrine 브롬화) (시그마)를 추가, 세포 파편을 제거하는 필터 0.45 μm을 통해 소독. </li><li> 1 부에서 준비 EC 문화에서 성장 매체를 제거하고 우​​물에 GPEneo 표면에 뜨는 / Polybrene 혼합물의 2 ML를 추가합니다. 신선한 GPEneo Polybrene / 표면에 뜨는 혼합물을 사용하여 다음 날을 반복 참고 :. Polybrene는 바이러스 입자)으로 감염을 촉진하기 셀 벽에 구멍을하는 데 사용됩니다. </li><li> GPEneo 표면에 뜨는 / Polybrene 혼합에게 다음 날 제거 PBS로 두 번 세포를 씻고 그것에게 매 3 일마다 변경의 성장 매체에있는 세포를 유지하고 있습니다. 합류 후, 콜라겐 IV - 코팅 접시에 세포에게 1시 2분을 분할. </li><li> 일반적으로, 안정적 뇌성 내피 (cEND) 셀 라인 4~5주 나중에 취득해야합니다. </li></ol>E &quot;&gt; 3. 뇌 Microvascular 내피 세포 육성 <ol><li> 10 ML 미리 예열 매체 15 ML-팔콘의 물을 욕조 및 전송에 cryoaliquot에서 세포를 해동. </li><li> RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. </li><li> 매체를 제거합니다 (도금에 대한 세포 밀도가 적어도 1 회 10 4 셀 / ML이어야 함) 사전 예열 성장 매체와 콜라겐 IV 코팅 T 25cm 2 세포 배양 플라스크에서 펠렛을 전송합니다. </li><li> 다음 날 매체를 변경하고 세포가 합류에 도달 한 후 (보통 후 5 일) 셀을 분할. </li></ol> 4. cEND - 세포의 분리 (참고 : 분할 만 일주일에 한 번씩 수행 할 경우, 1시 4분보다 높은 분리하지 마십시오). <ol><li> , 중간을 제거 PBS로 세포를 씻어. </li><li> 37 품다 따뜻한 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 (PAA Laboratories의) (T 75cm 2 플라스크), 3 ML을 추가 ° C 및 셀 레이어가 (보통 5-15 분 이내) 분산 될 때까지 기다리십시오. </li><li> 5 ML O를 추가합니다F 성장 매체는 최대 피펫 아래로, 그리고 IV-코팅 플라스크 새로운 콜라겐으로 전송됩니다. </li></ol> 5. cEND - 세포의 동결 <ol><li> 4 단계에서 설명 된대로 세포 현탁액을 확보 </li><li> RT에서 5 분 250 XG에서 정지 원심 분리기. </li><li> 6 ML 냉동 매체 (95 % 성장 매체, 5 % DMSO)에 세포 펠릿 (1 T 75cm 2 플라스크로부터 얻은) Resuspend. </li><li> . 한 cryo-나누어지는이 T 25cm 2 플라스크에 놓는 할 수 있습니다 : 네 개의 1.5 ML cryo-aliquots 참고로 세포 현탁액을 나눈다. </li><li> 액체 질소 증기 온도에서 cryo-aliquots를 저장합니다. </li></ol> 450 ML DMEM, 10 % FCS, 10 ML L-글루타민, 2% 가상 - 키트, 2퍼센트 NEAA, 10 ML의 나트륨의 pyruvate, 50 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 : 성장 매체를 cEND 6. 대표 결과 cEND 및 cerebEND 세포가 내피의 immunostainings을 특징으로 한차 BBB는 transendothelial 전기 저항 (티에르)와 투자율의 측정에 의해뿐만 아니라 마커. cEND과 cerebEND이 합류에서 성장 억제를 전시 단단히 포장 길쭉한 세포 monolayers과 뇌 ECS의 주요 문화와 비슷한 형태했다. 세포는 immunofluorescence (그림 3) 4,5으로 표시된 셀 셀 접합에서 지역화 된 claudin-5, occludin 및 VE-cadherin 단백질 잘 감지 레벨을 표명했다. 혈청 - 감소 미디어에서 배양의 cEND 전지는 티에르의 증가 (Ωcm 2 150 2퍼센트 혈청의 존재 500 Ωcm 2 혈청 10 %의 존재에서) 하이드로 코티손의 추가에 의해 potentiated되었습니다 (800 Ωcm으로 이어 2) 혹은 인슐린 (1,000 Ωcm 2) 4. 21일에 대한 혈청 - 할인 매체에 배양 cEND의 Monolayers이있어서 900 Ωcm 2 (그림 4)의 티에르. 티에르는 어셈블리를 사용하여 측정되었다포함하는 전류 전달 및 전압 측정 전극 (세계 정밀 계측기). 비교를 들어, 1 차 microvascular 뇌 ECS는 Ωcm 2, 상업적으로 이용 가능한 마우스 세포주 bEnd.3는 스님 2005 년과 토스 동부 표준시를 참조 최근 검토 100-140 Ωcm 2 (중 티에르 값을 가지고 200-600의 티에르 값을 가지고보고되었습니다 알., 2011 년 17,18). 또한, 4 시간 이상 같은 비 충전 분자 질량 4, 10, 70, 500 kDa의 FITC-dextrans, 또는 2퍼센트 FCS 차별화 매체에 cEND의 monolayer에서 fluorescein (300 다)와 같은 고분자의 통로가 감소되었다 10% FCS를 포함하는 성장 매체에 유지 관리 전지와 비교 : paracellular 플럭스는 FITC-dextrans 10 70 kDa에 26%까지 fluorescein의 제어 세포의 30 %로 축소되었고, 플럭스는 FITC에 대한 제어 세포의 4.5 %로 감소되었다 - dextrtan 500 kDa. 값을 티에르와 마찬가지로 투자율은 gluc의 면전에서 배양 세포에서 낮은 수준에 있었어요ocorticoids (GC) 4. 더 연구에서, 우리는 글루코 코르티코이드 대상 유전자, occludin, claudin-5 및 뇌 혈관 내피 4,7,9에서 VE-cadherin을 확인. GC 치료는 이러한 단백질의 표현의 증가와 세포 골격에 대한 VE-cadherin의 다시 정리하기로 하였다. 꼭 접합 단백질 occludin과 claudin-5의 직접 GC로 인한 규정은 발기인 지역 4,7,19에서 GC 응답 요소를 통해 나타납니다. 또한, claudin-5는 혈관 내피 10 소설 에스트로겐 대상으로 확인되었다. 내피 부전 underlies 여러 가지 질병을. 우리는 산소 / 포도당 박탈 (OGD) 조건 하에서 cEND을 배양. OGD는 GC와 proteasome 억제제를 bortezomib 12 결합 치료 후 재구성 할 수있는 BBB 기능의 중단에되었다. OGD 조건은 포도당 통풍 관에서 강한 인상을 이끌어 포도당 transpor의 표현에MK801, NMDA 수용체 - 13 비 경쟁적 억제제를 추가로 감소 될 수 cerebEND의 감마선. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> 1 그림. 뇌 microvascular 내피 세포 (cEND) 절연을 차례로 일주일 정도. 가벼운 현미경 사진의 형태는 6x (A)와 15x (B) 확대에 따라 촬영 된 것입니다. 내피 세포의 섬 형성 식민지가 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> 그림 2. 절연 및 불멸화 후 뇌 microvascular 내피 세포 (cEND)의 형태 일개월. 가벼운 현미경 사진은 15x 배율에서 촬영 된 것입니다. 합류, 동질적인 내피 세포 monolayer를 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> 그림 3. 불후의 뇌 microvasculAR 내피 세포 특급 claudin-5, occludin 및 VE-cadherin. CEND 세포는 콜라겐 IV-코팅 coverslips에 성장과 claudin-5에 대한 항체 (A), occludin (B)와 VE-cadherin (C) 물들되었습니다. 이미지는 40x 확대에 따라 Zeiss Axioscop2 현미경을 사용하여 촬영 된 것입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> 4 그림. cEND monolayer. CEND의 transendothelial 전기 저항 측정 (티에르)는 콜라겐 IV-코팅 transwell 필터 (기공 크기 0.4 μm)에서 성장했다. 합류에 도달 한 후 셀 2% FCS를 포함하는 매체에 유지되었다. 티에르는 전류 전달 및 전압 측정 전극을 포함하는 어셈블리를 사용하여 7, 14, 21 일 후에 측정되었다.

<ol><li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113(2011).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937(2008).</li>
<li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872(2005).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475(2005).</li>
<li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37(2006).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413(2006).</li>
<li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19(2009).</li>
<li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937(2007).</li>
<li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139(2008).</li>
<li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298(2010).</li>
<li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293(2010).</li>
<li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081(2011).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen%2Fglucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44(2012).</li>
<li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279(2005).</li>
<li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203(2002).</li>
<li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+of+the+blood-brain+barrier%3A+incomplete+presentation+of+protein+%28auto-%29antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757(1990).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5(2005).</li>
<li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+CNS+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107(2011).</li>
<li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39(2008).</li>
<li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125(1994).</li>
<li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100(1994).</li>
<li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327(2001).</li>
<li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521(1990).</li>
<li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101(1994).</li>
<li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435(1990).</li>
<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315(2010).</li>
<li>Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkaper%2C+SD+%22Methods+in+Neurosciences%22">Methods in Neurosciences</a>. Conn, M. 2, 1303(1990).</li>
<li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin%2C+an+endothelial+anticoagulant+protein%2C+is+absent+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362(1986).</li>
<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

설명 절차는 혈관 내피 기능의 특정 변경 사항을 공부하고 다른 마우스 종자에서뿐만 아니라 다른 똑 아웃 마우스 종자에서 ECS microvascular의 분리에 사용될 수 있습니다. 불멸화의 방법으로 우리는 손쥐 polyomavirus, Polyoma 중간 T 항원의 oncoprotein과 변환을 사용했습니다. 이 생체과 체외 20,21,22에 빠르게 미숙 한 내피 세포를 변환합니다. 문학에 설명 된 ECS의 불멸화의 다른 방법은 예를 들어 SV40 대형 유인원 Vacuolating 바이러스의 T 항원 40 23 아데노 바이러스 유전자 산물 E1A 24 또는 인간의 telomerase 3 촉매 subunit의 overexpression와 불멸화가 포함되어 있습니다. PymT있는 불멸화는 짧은 시간에 신생아 쥐에서 동질 EC 문화를 취득 할 수 있습니다 손쥐 미숙 한 ECS, 대한 구체적인 있습니다. 불멸화는 세포와 일의 속성을 변경불후의 세포 라인으로 얻은 전자 결과는 기본 셀이나 마우스와 생체 내 실험과 중 비교해야합니다. PymT 불후의 EC는 urokinase 형 plasminogen 활성화의 증가 생산으로 인한 fibrinolytic 활동의 높은 수준을 표현하는 설명과 plasminogen 활성 억제제 25 생산을 감소되었습니다. PymT의 직접 비교 체외 BBB 모델에 모두 잘 T 세포 부착 연구 26에 적합 것으로 밝혀 기본으로 bEND5 세포주 ECS을 불후의. 설명 절차에 따라 설립 셀 라인 세포가 노화하는 동안 이러한 속성을 잃게로, BBB 및 EC junctional 단백질의 높은 표현으로 장벽 속성을 유지하기 위해 낮은 통로 번호 사용할 수 있습니다. 따라서 장벽 특성의 손실 후, 새로운 세포 라인의 준비가 고려되어야한다. 셀 도금 밀도는이 세포 증식에​​ 중요하므로, ECS 높은해야합니다. 이것은뿐만 아니라 불후의 ECS의 유지와 격리 절차를 수행하는 동안 고려되어야합니다. 각각의 새 셀 라인은 그 장벽 속성 및 다른 세포 유형 가능한 오염 물질에 대한 테스트해야합니다. EC의 monolayers는 oligodendrocytes, astrocytes 및 pericytes 4,27으로 오염을 제외 할 기본 항체와 같은 안티 galactocerebroside, 안티 glial fibrillary 산성 단백질과 항 평활근 항원 물들 할 수 있습니다. meningal의 vasculature에 의해 오염을 배제하기 위해 thrombomodulin의 표현은 뇌 28를 제외한 모든 혈관 침대로 표현되는, 테스트 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 다른 뇌 영역에서 격리 불후의 microvascular 내피 세포 라인 프로 염증성 자극에 자신의 장벽 속성과 민감도에 차이가 있습니다. 예를 들어, 뇌성 cEND과 소뇌 cerebEND 셀 라인 4,5 언급 할 수 있습니다. CerebEND는 비교에서 보여주요 긴밀한 연결 구성 요소 claudin-1과 occludin의 낮은 표현 수준을 cEND합니다. 그러나, claudin-3 -12의 수준 cerebEND의 상위 있었다. cerebEND 세포의 장벽 기능은 cEND 세포의 장벽 속성은 5 것보다 TNFα 염증 중재자과 치료, 아래 훨씬 더 고통. 염증 자극에 높은 소뇌 취약점은 다발성 경화증 환자와 뇌척수염 29 면역의 동물 모델 실험에서 생체에서 관찰 할 수 있습니다. 이러한 흥미로운 연구 결과는 뇌에 타겟 미래의 약물을 개선하기 위해, 생성하고 다른 뇌 영역에 대한 체외 모델에서 개인을 특징의 필요성을 보여줍니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A7906 </td><td> 순도&gt; 98% </td></tr><tr><td> 콜라겐 IV </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C5533 </td><td> 50 ㎜ 아세트산 50 μg / ML </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> 로슈 </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide (DMSO) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 혈청 (FCS) </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> A15110-1333 </td><td> 최종 농도 10 %, 열 inactivated (56시 30 분 ° C) </td></tR&gt; <tr><td> L-글루타민 </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> 저장 용량 : ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> 가상 Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> 저장 용량 : ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> NA-pyruvate </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomycin (G418) </td><td> PAA Laboratories의 </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / 스트렙토 마이신 </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> 저장 용량 : ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> 인산염은 염분 (PBS)를 버퍼 </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine 브롬화) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 107689 </td><td> PBS의 0.8 MG / ML, -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0.05 %, PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr></tbody></table>

로 불후의 손쥐 뇌 microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

상피 및 내피 세포 (EC)는 외부 및 내부 환경에서 조직을 보호 paracellular 장벽을 구축하고있다. EC의 구성하는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB), astrocyte 최종 피트, pericytes 및 기초 멤브레인은 뇌 실질의 보호와 항상성에 대한 책임을지고 있습니다. 체외 BBB 모델에서 BBB의 구조와 기능을 공부하는 일반적인 도구가 세포 수준에서. 체외 BBB 모델에서 다른의 상당한 숫자는 지금까지 다른 실험실에서 연구에 설립되었습니다. 일반적으로 세포는 소, 돼지, 쥐 또는 마우스 뇌 조직 (빌헬름 외하여 검토 상세하게 설명 1.)에서 얻을 수 있습니다. 인간 조직 샘플은 실험실 또는 기업 2,3의 제한된 숫자 만 사용할 수 있습니다. 기본 셀 준비가 시간이 많이 걸릴 수 있으며 EC의 문화가 일괄 배치로 다를 수 있지만,의 설립은 EC 린에게 불후의에스 과학 관심의 초점이다. 여기, 우리는 신생아 마우스 뇌에서 불후의 두뇌 microvascular EC 라인을 수립하는 방법을 제시한다. 우리는 시약 및 솔루션에 사용 된 절차의 단계별 정보를 설명합니다. 우리 연구소에 의해 설립 방법에 4 내지 5 주 내에 균일 한 불후의 내피 세포 라인의 절연을 할 수 있습니다. 뇌 microvascular 내피 세포 라인 cEND 4 칭했다 (대뇌 피질에서)와 5 (소뇌 피질에서) cerebEND, 포스터의 실험실에서이 절차에 따라 격리 된 효과적으로 BBB의 다양한 생리 학적 및 병리학 과정의 설명에 사용되었습니다. cEND 및 cerebEND를 사용하여 이러한 세포가 글루코 코르티코이드 - 4,6-9에 응답하고 같은 TNFalpha 5,8 등 프로 선동적인 질문입니다 중재자에뿐만 아니라 에스트로겐 치료 10 명 보여주고 있습니다. 또한, 우리는 여러 SC의 병리학을 공부했습니다lerosis 11 EC 수준에서 hypoxia 12,13. cEND 및 cerebEND 라인 림프구 나 암 세포와 EC의 다른 자극 또는 상호 작용에 ECS의 BBB, 세포 응답의 구조와 기능을 공부하기에 좋은 도구로 간주 될 수 있습니다.

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

상피세포와 내피세포(EC)는 외부 및 내부 환경으로부터 조직을 보호하는 세포 간 장벽을 형성합니다.

이 절차의 전반적인 목적은 균질화된 불멸화 뇌 혈관 내피 세포 배양물을 얻는 것입니다. 이는 먼저 신생 생쥐에서 뇌를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 polyoma middle T antigen을 사용하여 세포를 불멸화하는 것입니다.다음으로, 균질한 혈관 내피 세포 단층이 형성될 때까지 약 4주 동안 세포를 배양합니다. 마지막 단계는 면역 염색, Western blot 및 Q-Q-P-C-R과 같은 기술을 사용하여 새로운 세포주를 특성 분석하는 것입니다. 이 기술은 전임상 치료 평가와 병태생리학적 통찰력을 얻을 수 있으므로, 신경 염증성 또는 허혈성 뇌 질환 치료에까지 응용될 수 있습니다.실험 절차 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Elaine Salvador 박사가 맡아 진행하겠습니다. 버퍼 A가 담긴 페트리 접시로 옮긴 생후 3~5일 된 신생 마우스에서 뇌를 적출한 후, 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 작업하며 매 조제 시 마우스 5~10마리 분량의 뇌를 준비합니다. 각 뇌에서 소뇌, 뇌줄기, 뇌수막 및 모세혈관 파편을 제거합니다.그 다음 대뇌를 buffer A가 들어있는 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균된 메스로 대뇌를 작은 조각으로 자른 후, 10 milliliter 피펫을 사용하여 덩어리가 보이지 않을 때까지 조직과 버퍼를 흡입하고 배출합니다. 이 단계에서, 뇌 조직을 실온에서 250 times G로 5분 동안 원심분리한 후 현탁액을 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 1.5 milliliters의 0.75%weight per volume이 포함된 4.5 milliliters의 buffer A에 녹입니다.콜라게나아제를 첨가합니다. 조직과 콜라게나아제 용액을 37 °C 항온수조에서 가끔씩 흔들어주며 45분 동안 배양합니다. 그동안 12-웰 플레이트의 웰 4개에 0.1 mg/mL 멸균 용액을 코팅하여 조직 배양 플레이트를 준비합니다.콜라겐 4와 50 millimolar 아세트산은 상온에서 1시간 동안 콜라겐이 웰에 부착되도록 합니다. 45분간의 배양 시간이 지나면, 15 milliliters의 buffer A를 첨가하여 뇌 조직의 소화를 중단시키고 펠릿을 이 용액에 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 250 ×g에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.다음으로, 준비물에서 미엘린을 제거하기 위해 멸균된 25% w/v B, s, A 및 PBS 10 milliliters를 조직에 첨가하고 4°C에서 1000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 버리고, 펠렛을 buffer A 15 milliliters에 녹여 새로운 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮긴 후 상온에서 250 ×g로 5분 동안 다시 원심분리합니다. 그동안 collagen IV 코팅 플레이트를 PBS로 2회 세척합니다.두 번째 세척 후, 두 개의 웰은 비워두고 나머지 두 개의 웰에 2 mL의 성장 배지를 추가합니다. 상층액을 제거한 후, 주로 혈관 내피세포로 구성된 세포 펠렛을 4 µg/mL의 puromycin이 포함된 성장 배지 4 mL에 재현탁하고, 세포 현탁액 2 mL씩을 비어 있는 콜라겐 코팅 웰 두 곳에 각각 분주합니다. 빠르게 부착되는 비내피세포를 제거하기 위해 37 °C에서 45분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포가 들어있지 않은 두 개의 웰에서 성장 배지를 흡입하여 제거합니다.그 다음, 내피세포 분획이 포함된 비부착 세포 함유 배지를 이 두 웰로 옮깁니다. 이전 웰에는 2 mL의 신선한 배지를 다시 채웁니다. 이 웰들에는 섬유아세포 및 성상교세포와 같은 다른 세포 유형들이 포함되어 있으며, 이를 병행 배양하여 형태학적 비교에 사용할 수 있습니다.세포를 조직 배양 인큐베이터에서 다음 날까지 하룻밤 동안 배양하십시오. 폴리오마 middle T 온코진(polyoma middle T oncogene)을 가진 복제 결핍 바이러스를 분비하는 GPE neo 섬유아세포를 GPE neo 배지가 포함된 젤라틴 코팅 플라스크에서 배양하고 신선한 배지로 교체하십시오. 폴리오마 middle T 온코진의 형질전환은 비내피세포에 비해 내피세포의 성장 우위를 유도하여 내피세포 형태를 가진 균일한 세포 단일층을 형성하게 합니다. 4~6주간의 배양 후, GPE neo 세포는 시중에서 판매되지 않으므로 공공 공유 자료로 구할 수 있습니다.GPE Neo Fiberblast를 24시간 동안 배양한 후, 배지 10 mL를 제거하고 멸균된 poly brain 용액을 최종 농도가 8 µg/mL가 되도록 첨가합니다. 상층액 혼합물을 0.45 µm 필터로 여과하여 세포 파편을 제거합니다. 이제 혈관 내피세포 배양액의 배지를 흡입하여 제거하고, 하룻밤 동안 배양한 후 웰에 상층액 poly brain 혼합물 2 mL를 첨가합니다.다음 날, 새로운 상층액 poly brain 혼합물 분량을 사용하여 이 절차를 반복하십시오. 상층액 poly brain 혼합물을 제거합니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 신선한 성장 배지를 추가하십시오.세포가 합류(confluent) 상태가 될 때까지 3일마다 배양액을 계속 교체하고, 콜라겐 IV 코팅 플레이트에 세포를 1~2회 계대 배양합니다. 안정적인 뇌혈관 내피세포 라인은 일반적으로 4~5주간의 연속 배양 후 얻어집니다.균질한 내피 세포 단층이 웰 전체를 채웠을 때입니다. 안정적인 세포주가 확보되면, collagen IV가 코팅된 조직 배양 플라스크로 옮겨 심고, 3 mL의 trypsin EDTA를 사용하여 37 °C에서 세포층이 분산될 때까지 5~15분 동안 배양함으로써 일주일에 한 번 이하로 세포를 계대 배양하십시오. 5 mL의 배지를 추가한 후 새 플라스크에 분주하며, 분할 비율이 1:4를 초과하지 않도록 하십시오.T 75 플라스크가 합류(confluent)될 정도로 충분한 세포가 확보되면, 추후 사용을 위해 세포의 동결 보존분(cryo quats)을 준비할 수 있습니다. 이를 위해 이전과 같이 트립신으로 세포를 회수한 다음, 세포 현탁액을 250 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 실온에서 세포 펠렛을 6 mL의 동결 배지에 재현탁한 후, 세포 현탁액 1.5 mL를 4개의 동결 보존 튜브에 나누어 분주합니다.크라이오 바이알을 이소프로판올이 채워진 Nalgene 냉동 컨테이너에 넣고 영하 80°C에서 하루 동안 보관하십시오. 마지막으로, 크라이오 바이알을 액체 질소에 보관하십시오. 수조에서 세포가 담긴 크라이오 쿼드를 해동한 다음, 10mL의 성장 배지가 들어 있는 15mL 원심 분리 튜브로 옮기십시오.배지를 37 °C로 예열하고, 튜브를 상온에서 250 ×g로 5분간 원심분리합니다. 배지를 흡입하여 제거한 후, 펠렛을 적절한 부피의 성장 배지로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 예열된 성장 배지가 담긴 collagen IV 코팅 T 25 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.분주 시 세포 밀도는 최소 1 × 10⁴ cells/mL여야 합니다. 다음 날 배지를 교체하고, 약 5일 후 세포가 confluent 상태에 도달할 때까지 이전과 동일하게 계대 배양을 계속하십시오. 이후 다음 실험을 위해 원하는 밀도로 세포를 분주합니다. CEN 세포는 내피 및 혈뇌장벽(blood-brain barrier) 마커의 면역 염색을 통해 특성을 분석하였습니다.이 이미지는 clain five에 대해 면역 염색된 C and 세포의 형태를 보여줍니다. C and 세포는 성장 억제가 나타나는 조밀하게 채워진 신장된 세포의 단층을 형성하는 뇌 ECS의 1차 배양과 유사한 형태를 보입니다. 완전한 합류 상태에서, 세포는 검출 가능한 수준의 clain을 발현했습니다.여기에서는 C CN 세포를 occludin 항체로 면역 염색하였습니다. 또한, 면역형광 염색을 통해 세포 간 접합부에 국소화된 VE cadherin 단백질의 발현을 확인할 수 있습니다. 경내피 전기 저항은 전류 통과 전극과 전압 측정 전극이 포함된 장치를 사용하여 측정하였습니다.이 그림을 통해 C end 세포의 경내피 전기 저항이 배양 후 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 마우스 모델에서 뇌혈관 질환을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 - 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

인간의 혈액-뇌 장벽은 선택적으로 친수성 분자와 병원체가 뇌에 침투하는 것을 방지합니다. 수막염과 수술 후 정신 착란을 포함한 여러 가지 병리는 혈액 - 뇌 장벽의 침투성 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 우리는 미생물 통과에 의한 장벽 투과성을 시험하기 위해 내피 세포 배양 모델을 기술한다.

미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포를 분화하여 얻은 뇌 미생물 내피 세포를 도출, 확장 및 냉동 보존하고, 전 생체 모델에서 혈액 뇌 장벽 특성을 연구하는 적응된 방법을 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

여기에서는 만능 줄기 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 유사 세포로 분화할 수 있는 프로토콜인 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)에 대해 설명합니다. 이들 세포는 내피 세포 부착 분자 발현을 보여주므로 시험관 내에서 면역 세포 상호작용을 연구하기에 적합한 인간 혈액-뇌 장벽 모델입니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화

배우세요 생쥐 뇌 미세혈관 내피 세포를 불후화하여 혈액뇌장벽 모델을 구축하는 방법을. 이 기술은 신경염증성 및 허혈성 뇌질환 연구에 활용됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성

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