Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리 체외에서 mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

이 프로시저의 전체적인 목표는 무세포 번역 시스템에서 번역되는 mRNA의 주요 번역 일시 정지 부위를 식별하고 위치를 찾는 것입니다. 이는 먼저 T7 전사 프로모터의 제어 하에 관심 유전자를 클로닝함으로써 수행됩니다. 다음으로 mRNA를 전사하고 정제합니다.

그런 다음 mRNA와 방사성 아미노산이 존재하는 상태에서 시험관 내 번역(in vitro translation)을 수행하여 합성된 단백질과 신생 폴리펩타이드를 표지합니다. 마지막으로, 침강 속도 원심분리법을 사용하여 폴리솜을 분리하고, 분리된 신생 사슬을 겔 전기영동으로 분석합니다. 최종적으로 Tristine SDS page와 자동 방사선 촬영(autoradiography)을 통해 서로 다른 길이의 신생 폴리펩타이드를 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이를 통해 관심 있는 mRNA를 따라 일시 정지 부위(pause sites)가 존재함을 확인할 수 있습니다.

micro cocal nucleus protection assay와 같은 기존 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 매우 단순하고 빠르며 효율적이라는 점이며, 주어진 세포 내 리보솜 시스템에서 임의의 mRNA를 따라 주요 번역 후 부위의 결정 및 식별이 가능하다는 것입니다. 이 방법은 코돈 사용량, tRNA 풍부도 또는 mRNA 2차 구조와 같은 요인들이 번역 속도론에 어떻게 영향을 미치는지와 같이 번역 및 번역 후 단백질 접힘 분야의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 번역 속도론과 공동 번역 단백질 접힘 경로의 핵심 단계 사이의 관계에 대한 이해를 넓히는 데 기여할 수 있습니다.

이 기술의 함의는 생체 내(in vivo) 단백질 접힘 과정의 이해로 확장됩니다. 단백질 접힘은 주로 리보솜에서 번역이 일어나는 동안 공동 번역적으로 발생한다고 믿어지지만, 본 연구에서는 상용으로 판매되는 세포 추출물을 사용하여 gamma bi crystalline의 무세포 번역을 수행했습니다. 이 기술은 또한 모든 세포원으로부터 준비된 번역 가능 추출물을 사용하여 잠재적으로 모든 단백질의 번역 IDE를 식별하는 데 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 프로토콜의 두 가지 핵심 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다.

첫 번째는 번역 반응에 필요한 전체 시간을 설정하는 것으로, 이를 통해 생성 중인 폴리펩타이드의 대부분이 리보솜에 결합된 상태를 유지하도록 합니다. 두 번째는 생성 중인 폴리펩타이드의 대부분을 분리하기 위한 적절한 정제 시스템을 찾는 것이며, 정제 시스템의 선택은 연구 대상 단백질의 크기에 따라 달라집니다. 저희는 80년대 중반, 글로빈의 공번역 접힘(co-translational folding) 제안 모델과 관련하여 글로빈 분자의 번역 속도론을 살펴보기로 결정했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.

글로빈 번역의 불균일성은 1974년 PRO와 Maurice가 글로빈 NAS 및 사슬의 크기 배제 CLO 크로마토그래피를 사용했을 때 처음 발견되었습니다. 그러나 그들의 분석은 원하는 정밀도를 갖추지 못했으며, Pro와 more는 글로빈 번역 과정 중 4개의 주요 번역 정체 부위(power sites)를 관찰하였습니다. 이후 우리의 분석을 통해 약 10개의 추가적인 정체 부위를 밝혀냈으며, 글로빈의 번역 중 접힘에 대한 세부 모델을 구축할 수 있었습니다. 여기에 설명된 기술은 폴리솜의 분리와 Tri S Ds page gel을 이용한 신생 폴리펩타이드 분석을 포함하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

이 두 단계는 고품질의 재현 가능한 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 시연자는 Myelo 실험실의 대학원생 Sujata입니다. 메신저 RNA의 인비트로(in vitro) 전사를 위해, 적절한 제한 효소를 사용하여 T7 및/또는 SP6 프로모터 하단에 클로닝된 관심 유전자에서 시작하십시오. DNA 템플릿을 스탑 코돈 하단 및/또는 mRNA 3' 말단에서 선형화하십시오.

DNA가 완전히 선형화되었는지 확인하기 위해 제한 효소 처리된 샘플을 아가로스 겔 전기영동으로 분석합니다. 최적의 DNA 템플릿 농도를 결정한 후, 제조사의 지침에 따라 전사 키트를 사용하여 messenger RNA를 시험관 내(in vitro) 전사합니다. 그다음, 염화리튬 침전법을 사용하여 mRNA를 정제합니다.

그런 다음 acrylamide 또는 agarose 겔 전기영동을 사용하여 순도를 확인합니다. nuclease free water에 1 mM amino acid mixture(methionine 제외), 10 units의 RNA inhibitor, 20 µCi의 radioactive 35S methionine 및 rabbit reticulocyte lysate를 첨가하여 100 µL 규모의 in vitro translation 반응액을 준비합니다. 다음으로 반응액을 30 °C에서 5분 동안 배양하여 예열합니다.

그 다음 2 µg의 mRNA를 첨가하고 30 °C에서 5분 동안 배양하여 반응을 중단시킨 후, 얼음에 두어 리보솜에 결합된 신생 폴리펩타이드를 분리합니다. 번역 반응액을 KCl과 MgCl₂가 포함된 4.5 mL의 30% glycerol Tris-HCl (pH 7.6) 층 위에 층분리하고, TLA 110 로터 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 100,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다. 이어서 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 신생 폴리펩타이드가 포함된 폴리솜 펠릿을 0.5 mg/mL의 ribonuclease A가 포함된 소량의 1 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.6)에 재현탁하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

펩타이드-tRNA 에스테르 결합의 가수분해를 촉진하기 위해, 최종 농도가 10 millimolar가 되도록 수산화나트륨을 반응액에 첨가하고 30분 동안 추가로 배양합니다. 생성된 폴리펩타이드를 tris-tris-SDS PAGE로 분리한 후, 겔을 고정 및 건조합니다. 이후 겔을 자동방사법으로 처리하고, 생성된 폴리펩타이드를 검출하기 위해 인광 이미징을 수행합니다.

tRNA 풀의 변화로 인해 유도된 리보솜 이동의 변화는 번역 중에 축적되는 신생 폴리펩타이드의 크기 분포뿐만 아니라, 해당 지점에서의 정지 시간을 반영하는 상대적 강도의 변화로 이어져야 합니다. 감마 B 크리스탈린 단백질의 신생 폴리펩타이드를 분리하여 Tristine SDS page로 분석하였습니다. RRL 및 E. coli 시스템에서 폴리펩타이드의 길이와 강도가 서로 다르다는 것은, 이 두 시스템에서 mRNA를 따라 이동하는 리보솜의 움직임이 서로 다른 번역 역학을 따른다는 것을 나타냅니다.

예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물 시스템에는 없고 E. coli 용해물에서만 나타나는 두드러진 17.7 kilodalton 밴드를 확인하십시오. Gamma B crystalline은 포유류 시스템에서는 빈번하지만 E. coli에서는 매우 드물고 번역 속도가 느린 것으로 알려진 탠덤 아르기닌 코돈을 포함하고 있으며, 이는 여기서 보여주는 바와 같이 해당 밴드가 이 탠덤 희귀 코돈에서의 리보솜 일시 정지로 인해 발생했음을 시사합니다.

mRNA가 없는 경우에는 밴드가 관찰되지 않으며, 퓨로마이신(puromycin) 처리 시 폴리솜(polysome)에서 대부분의 신생 사슬(nascent chains)이 제거됩니다. 또한, 퓨로마이신을 장시간 처리하면 모든 신생 사슬이 제거되는데, 이는 관찰된 폴리펩타이드 생성물이 폴리솜과 함께 침강하는 MRP가 아니라 리보솜 결합 신생 사슬임을 확인시켜 줍니다. 이 기술을 숙달하면 1~2일 내에 완료할 수 있습니다. 전체 소요 시간은 주로 원심분리 단계와 신생 펩타이드 겔 전기영동 단계의 시간에 따라 달라집니다.

이 절차를 수행할 때, 배양 시간이 종료된 직후에 번역 반응을 즉시 중단시키는 것이 중요합니다. 리보솜으로부터 신생 폴리펩타이드가 방출되는 것을 방지하기 위해, 모든 단계에서 RNA가 유입되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. RNA 오염은 추출물의 번역 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 본 절차를 따르는 과정에서 리보솜으로부터 신생 폴리펩타이드가 방출되는 결과를 초래할 수 있습니다.

특정 메시지에서 리보솜 이동 효율에 mRNA 결합 단백질이 미치는 영향과 같은 다른 목표들 또한 이 기술의 개발 이후 테스트될 수 있습니다. 이 기술은 단백질 접힘 분야의 연구자들이 번역 단백질 접힘 과정에서 희귀 코돈의 존재로 인해 발생하는 번역 일시 정지의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 기술은 이전에 메시지 상의 리보솜 이동 및 번역 단백질 접힘에 있어 코돈 치환의 역할을 테스트하는 데 사용되었습니다.

이 영상을 시청한 후, 리보솜에 결합된 nascent polypeptide를 분리하여 mRNA에 제시된 번역 활성 부위를 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. $^{35}\text{S}$-methionine와 같은 방사성 동위원소 및 표지된 아미노산을 다룰 때는 특별한 주의가 필요하며, 이 절차를 수행하는 동안 항상 이를 고려해야 함을 잊지 마십시오.