Name: Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리 체외에서 mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 배우세요 체외 번역 시스템에서 리보솜에 결합된 초기 폴리펩타이드를 분리하여 mRNA의 번역 일시 중지 부위를 식별하는 방법입니다. SDS-PAGE와 방사성 자동영상법으로 다양한 길이의 신생 폴리펩타이드를 분석하여 단백질 합성 동역학을 이해할 수 있습니다.

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1. DNA를 템플릿 준비 및 시험 관내 스크립트 작성에 <ol><li> 관심있는 유전자는 T7 및 / 또는 예 SP6 transcriptional 발기인 아래에 복제됩니다. </li><li> 시험 관내 전사의 내용은 템플릿 DNA가 ORF 정류장 코돈 및 / 또는 mRNA 3 &#39;끝에 스트림 절삭 적절한 제한 효소로 선형있다. 하나는 아가로 오스 겔 전기 영동에 제한 소화 제품을 실행하여 플라스미드 DNA의 완전한 선형화를 확인해야합니다. </li><li> 선형 플라스미드는 시험 관내 전사 반응에 사용됩니다. 템플릿 DNA의 서로 다른 농도는 시험 관내 전사에 필요한 최적의 DNA 농도를 확인하는 테스트를 할 수 있습니다. 일반적으로 Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)로, 1 μg 선형 DNA는 mRNA의 40-60 μg를 얻을. 시험 관내 전사에는 제조 업체의 지침 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 Islan에 따라 이루어집니다D, NY). </li><li> 시험 관내 전사에 따라 mRNA는 제조 업체의 지침 (Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트)에 따라 염화 리튬의 석출에 의해 정화된다. </li><li> mRNA 무결성이 더욱 아크릴 아미드 또는 아가로 오스 젤에서 전기 영동으로 확인됩니다. </li></ol> 2.에서는 체외 세포 무료 번역 다음 단계를 따르십 R abbit R eticulocyte Lysate, RRL을 (Promega, 매디슨, WI)를 사용하여 체외 번역의 경우 : <ol><li> 체외 번역 반응 다음과 같은 제조 업체의 지침에 100 μl를 준비합니다. 간단히, nuclease 무료 물에 2 μl 아미노산 혼합물 마이너스 메티오닌 (1 ㎜), RNase 억제제 (Invitrogen / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), 방사성의 20 μCi [35 S]-메티오닌 (MP의 Biomedicals 10 단위를 추가, ) 오, 솔론, 토끼 Reticulocyte Lysate (Promega, 매디슨, 위스콘신) 70 μl. </li><li> 일 품어따뜻한 번역 반응을 미리하는 5 분 30 ° C에서 전자 반응. 5 분 30 ° C에서 번역 반응과 부화 mRNA의 2 μg을 추가합니다. </li><li> 얼음 번역 반응을 배치하여 반응을 중지합니다. </li></ol> 3. 체외 번역 반응의 초기 Polypeptides의 분리 <ol><li> 리보솜 (polysome)에 바인딩 초기 폴리펩티드를 분리하려면 번역 반응이 100 밀리미터 KCl, 10 MM MgCI 2를 포함하는, 10 MM 트리스-HCL 버퍼 산도 7.6에서 30 % 글리세롤 4.5 ML 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가, 그리고 100,000 X g에서 centrifuged합니다 4 ° C.에 1 시간을위한 TLA-110 로터 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, Inc의 어딘지, CA)에서 </li><li> 뜨는는 더욱 신중하게 제거됩니다. </li><li> 어렸을때 polypeptides를 포함 polysom​​al 펠릿에는 0.5 MG / ML의 ribonuclease (Invitrogen / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), 그리고위한 incubated를 포함, 1 ㎜ 트리스-HCL 버퍼 산도 7.6의 작은 부피 (10-15 μl)에 resuspended 있습니다 37 30 분 ° C. 순서대로peptidyl-tRNA 에스테르 결합의 가수 분해를 향상시키기 위해, NaOH는 10 mm의 최종 농도에 추가되고, 그리고 부화가 추가로 30 분 동안 계속됩니다. </li></ol> 체외에서 번역 반응 mRNA없이 조립과 동일한 조건 (설명되었습니다대로 초기 펩티드의 분리에 의해 다음) 하에서 수행이 중요한 컨트롤 역할을합니다. 밀도 기울기 원심 분리로 추출한 쓰는 전에 puromycin으로 변환 반응 (들)의 치료는 추가적인 제어 될 수있다. 4. 트리스 - tricine SDS 페이지의 초기 폴리펩티드를 해결 <ol><li> 격리된 초기 polypeptides가 해결 및 트리스 - tricine SDS-PAGE를 분석하고 있습니다. 물질의 양의 단백질 라벨, 단백질 번역과 많은 다른 파라미터에 대한 효율의 효율성에 관한 것이다 의존 겔에로드합니다. 로드된 물질의 양은 bes 수 있도록 경험적으로 조정되어야합니다t 시각화 및 개별 초기 폴리펩티드 사슬의 분리. </li><li> 전기 영동 장치 젤류가 해결된 후, 진공 젤 다이어를 사용하고 autoradiography를 받게 건조. 어렸을때 polypeptides의 분포는 phosphoimaging를 사용하여 관찰하고 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 소의 감마-B Crystallin은 잘 E.와 같은 토끼 Reticulocyte의 Lysate로 번역되었다 대장균 S30 추출 시스템 (Promega, 매디슨, 위스콘신) 초기 폴리펩티드 사슬의 고립으로 따라갔다. 그림 1은 ribosome 바운드 초기 체인의 분리에 관여 단계를 묘사. tRNAs (때문에 생물 사이의 코돈 바이어스의 차이로 실질적으로 포유 동물의 다른 (RRL)와 prokaryotic (E. 대장균) 시스템으로 알려져 있음) 수의 번역 즉 레퍼토리의 환경을 변경하는 경우에는 현재의 연구에서는 목표, 테스트하는 것이었다 mRNA 따라 ribosome 운동을 변경하고 번역을 일시 중지 사이트의 분포에 영향을.변경된 ribosome 운동은 번역뿐만 아니라 그들의 상대적인 농도 동안 축적 초기 polypeptides의 크기 분포의 변화로 연결되어야합니다. 밴드의 상대 농도는 일시 정지 기간을 반영합니다. 어렸을때 polypeptides은 고립과 16.5 % T, 6퍼센트 C 트리스-tricine SDS 페이지 (그림 2)에서 해결이되었습니다. 감마-B Crystallin는 20 kDa 단백질이다. RRL와 E가 아닌 동일한 길이와 농도의 초기 polypeptides의 관찰 대장균 시스템은이 두 시스템의 mRNA를 따라 리보솜의 움직임이 다른 번역 속도론을 따른다는 것을 나타냅니다. 예를 들어, E.에 17.7 kDa의 유명 밴드를 관찰 그것은 E.로 번역되었을 때 mRNA의 3&#39; 엔드 지역 (감마 B Crystallin의 인코딩의 C-말단 지역)에서 추가 translational 일시 사이트가있다는 것을 암시 RRL 시스템에서 대장균의 lysate가 아닌, 대장균 시스템. 우리는 참고 감마-B Crystallin 항만 탠덤 아르헨티나 codons (AGG 일포유류 시스템에서 자주 있지만, E. 극히 드문 천천히 번역된 것으로 알려져 53과 AGA 154) 대장균. E.에 축적 소설 초기 펩타이드 대장균 시스템 (~ 17.7 kDa 그림 2.2) 가능성이 탠덤 희귀 codons에서 일시 중지 ribosome로 인해 발생합니다. 어떤 밴드는 mRNA의 부재 (그림 2.3)에서 관찰되지 않으며 그 puromycin 치료가 polysomes (그림 2.3)에서 초기 사슬의 대부분을 제거 할 수있는 점에 유의하십시오. puromycin (&gt; 15 분)와 장기간 치료는 초기 체인 (데이터가 보이지 않음)를 제거합니다. 이것은 관찰된 폴리펩티드 제품이 오히려 polysom​​es로 cosedimenting mRNPs 이상의 ribosome 관련 초기 체인,한지 확인합니다. 위에서 언급한 바와 같이 코돈 바이어스는 유기체뿐만 아니라 조직마다 다릅니다. 대표적인 예제는 여기에 설명된 분명 tRNAs / 코돈의 번역 즉 레퍼토리의 환경을 변경함을 나타냅니다바이어스는 mRNA 따라 ribosome의 개조 운동으로 이어질 수 있습니다. 결국,이 간단한 방법은 mRNA를 따라 translational 일시 중지 사이트의 신분을 허락할 수 없다뿐만 아니라, 서로 다른 시스템 간의 번역을 일시 중지 사이트의 빠른 비교를 허용합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" /> 1 그림. 도식은 ribosome 바운드 초기 polypeptides를 격리에 관련된 단계를 설명. 소의 감마-B Crystallin는 ORF 시퀀스 (528 기본 쌍) pBSKS에서 하류 T7 프로 모터의 복제되었습니다 +. 시험 관내 전사의 내용은 템플릿 DNA가 EcoRI으로 치료하여 선형되었다. 선형화된 템플릿은 시험 관내 전사에 사용되었습니다. DNA를 템플릿 T7 프로 모터는 하류 감마-B Crystallin 유전자를 transcribes T7 RNA 중합 효소에 의해 인정되고 있습니다. mRNA는 염화 리튬의 석출 방법을 사용하여 정화하고 있습니다. 정화 mRNA는 체외 변환에 사용됩니다. 다음의인큐베이션, 번역 반응은 30 % 글리세롤 용액 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가, 4에서 1 시간 동안 centrifuged되고 ribosome 바운드 초기 polypeptides 격리시킬 100,000 X g에서 ° C에서. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" /> 그림 2. 래빗 Reticulocyte Lysate (RRL)와 E로 번역 소의 감마-B Crystallin 초기 polypeptides의 분리 대장균의 Lysate가. 2 μg의 mRNA는 RRL 또는 E를 포함하는 100 μl 반응에 혼합되었다 5 분 20 μCi [35 S]-메티오닌 30시 incubated ° C와 제조 업체의 지시에 따라 대장균 S30 추출 시스템 (Promega, 매디슨, 위스콘신). 아래 부화는 번역 반응이 100 밀리미터 KCl, 10 MM MgCI 2를 포함하는, 10 MM 트리스-HCL 버퍼 산도 7.6에서 30 % 글리세롤 4.5 ML 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가, 그리고에서 4 ° C와 100,000 X g에서 1 시간 동안 centrifuged되었다 TLA-110 로터 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, Inc의 어딘지, CA). 격리된 polyribosome 펠렛은 열매가 나타나고이었다은 (Invitrogen / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕) NaOH (같은 프로토콜 섹션에서 설명)가있는 치료이어서 0.5 MG / ML의 ribonuclease를 포함, 1 ㎜ 트리스-HCL pH는 7.6 20 μl에 spended. 어렸을때 polypeptides은 16.5 % T, 6퍼센트 C 트리스-Tricine SDS PAGE 젤에 해결이되었습니다. 겔은 건조하고 autoradiography에 대해 접했습니다. 노출에 이어 젤은 GE 헬스케어의 태풍 이미징 스캐너를 사용하여 스캔했습니다. 그림 2.1은 번역 반응은 두 가지 다른 시스템 (RRL와 E 대장균)에 완료 이후 격리 및 해결 어렸을때 polypeptides로 젤을 보여줍니다. 그림 2.2는 겔은 이미지 양의 TL에 의해 분석되었다 . 번역 후 SDS 페이지를 격리 및 해결 어렸을때 polypeptides : v2005 소프트웨어와 두 시스템에 축적 초기 polypeptides의 분자량과 강도를 쉽게 분석하고 비교할 수 있도록 표시하는 예제로 여기에 사용되는 그림 2.3 컨트롤의 두 세트를 보여줍니다 반응이 모였습반응은 원심 분리에 노출되기 전에 mRNA 및 / 또는 후에없이 번역 반응 puromycin (5 분, 마지막 conc. 1 ㎜)로 치료되었다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

시험 관내 전사 및 번역 반응에 사용되는 부품의 재현성 결과, 품질과 집중이 중요하십시오. 현재의 연구에서 우리는 주의깊게 처리하는 경우, 높은 재현성 데이터를 제공 상용 키트와 추출물을 사용했다. 필요한 경우에는 번역 - 관할 추출물은 하나의 선택의 세포에서 작성하실 수 있습니다. mRNA의 품질이 번역에 영향을 미칠 수 있으므로, 그것은 시험 관내 번역하는 동안 그것을 사용하기 전에 mRNAs의 무결성을 테스트하기 위해 가장 중요합니다. 또한, 체외 변환 반응의 기간은 각각의 단백질을 위해 최적화되어야한다. 이것은 초기 polypeptides의 절연을위한 중요한 단계입니다. 연장 보육은 전체 길이 단백질의 합성과 리보솜에서 초기 polypeptides의 대다수의 출시로 연결. 배양 시간이 체외 번역 수행하여 최적화할 수 R다른 시간 포인트 eactions. 장편 단백질의 번역을 위해 필요한 최...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 키트의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 높은 항복 전사 키트 </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonuclease 억제제 </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> 트랜스 [35 S]-라벨 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 0,151,006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease - </td><td> Invitrogen </td><td> 12,091 </td></tr><tr><td> 래빗 Reticulocyte Lysate 시스템, Nuclease는 치료 </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> 선형 템플릿에 대한 E. 대장균 S30 추출 시스템 </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> 원심 분리 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> Optima TLX의 Ultracentrifuge </td></tr><tr><td> 저장 형광체 autoradiographY </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 태풍 9,410 가변 모드 영상기 </td></tr><tr><td> 초기 폴리펩티드 분석을위한 소프트웨어 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 이미지 양의 TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

ribosome 바운드 초기 polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mrna 함께 translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

translational 신장의 속도가 아닌 교복이다. 이차 구조, 코돈 사용을 mRNA와 1 참조 관련 단백질 검토를 위해 메시지에 ribosome 운동을 변경할 수도 있습니다 mRNA. 그러나 이제는 널리 동의어 코돈 사용하는 비 균일한 translational 신장 속도 1 차 원인임을 인정있어. 동의어 codons는 동일한 주파수로 사용되지 않습니다. 바이어스가 다른이보다 더 자주 사용하는 일부 codons와 동의어 codons의 사용에 있습니다. 코돈 바이어스는 유기체뿐만 아니라 2,3 구체적인 조직이다. 또한 코돈 사용 빈도가 기원 tRNAs 4의 농도에 직접 비례합니다. 따라서 자주 사용하는 코돈은 더 자주 코돈이 빠르게 드문보다 번역된다는 것을 의미합니다 해당 tRNAs 높은 무리를 가질 것입니다. 따라서, 희귀 codons (잠재 일시 사이트)에 풍부 mRNA의 지역은 원칙적으로 messa에 ribosome 움직임이 느려지며각각의 크기는 5-8의 초기 펩티드의 GE와 명분 축적. 이러한 일시 사이트가 단백질 발현에 대한 기능적 영향을 미칠 수 mRNA 안정성 및 검토를위한 단백질 폴딩 9를 참조하십시오. 실제로, 그것은 같은 일시 중지 사이트의 완화는 mRNA에 ribosome 운동을 변경할 수 있으며, 이후 공동 translational (생체내)을 단백질 폴딩 1,7,10,11의 효율성에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 궁극적으로 그것이 translational 연신율 동안 mRNA를 따라 리보솜의 움직임에 대한 코돈 사용 / tRNA 콘텐츠의 영향으로 종합적인 통찰력을 얻기 위해 필수적인 단백질 합성의 과정에 결합되어 세포에서 생체내의 단백질 접힘의 과정을 이해하려면 . 여기에서 우리는 다양한 세포없는 시스템을 6-8로 번역 주어진 mRNA에 대한 주요 번역 일시 사이트를 찾는 데 사용할 수있는 간단한 기술을 설명합니다. 이 절차는 초기 polypeptides accumulati의 고립을 기반으로합니다대상 mRNA의 체외 번역의 도중 리보솜에 NG. 근거는 낮은 주파수 codons에서 해당 규모의 초기 펩티드의 증가 금액 리보솜 결과의 체류 시간 증가. 체외 베꼈는데 mRNA에서 radioactively 라벨이 아미노산의 존재에 체외에서 translational 반응에 사용되고있다는 것입니다 초기 체인의 검출을 허용합니다. ribosome 바운드 초기 폴리펩티드 단지를 분리하기 위해서는 번역 반응은 원심 분리에 의해 다음에 30 % 글리세롤 용액 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다. polysom​​al 펠렛의 초기 polypeptides은 더욱 ribonuclease로 치료와 SDS 페이지에 의해 해결된다. 이 기술은 잠재적으로 어떤 단백질에 사용되며 ribosome mRNA를 따라 움직임과 주요 일시 중지 사이트의 검출 분석을 허용 할 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 ribosome 운동을 변경할 수 있으며 따라서 잠재적으로 또 일을 변경할 수있는 요인과 조건을 연구하는 데 적용할 수 있습니다전자 기능 / 단백질의 형태.

mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

번역 연장 속도는 일정하지 않습니다. mRNA 2차 구조, 코돈 사용 및 mRNA 결합 단백질은 ... 위에서의 리보솜 이동을 변화시킬 수 있습니다.

본 절차의 전반적인 목표는 무세포 번역 시스템(cell-free translation system)에서 번역되는 mRNA의 주요 번역 일시정지 부위(translational pause sites)를 식별하고 위치를 파악하는 것입니다. 이는 먼저 T7 전사 프로모터의 제어 하에 관심 유전자를 클로닝함으로써 수행됩니다. 그 후 mRNA를 전사하고 정제합니다.그런 다음 mRNA와 방사성 아미노산 존재 하에 인비트로(in vitro) 번역을 수행하여 합성된 단백질과 신생 폴리펩타이드를 표지합니다. 마지막으로, 침강 속도 원심분리를 사용하여 폴리솜을 분리하고, 분리된 신생 사슬을 겔 전기영동으로 분리합니다. 궁극적으로 Tristine SDS page와 자기 방사법을 통해 서로 다른 길이의 신생 폴리펩타이드를 보여주는 결과를 얻을 수 있으며, 이를 통해 관심 있는 mRNA를 따라 일시 정지 부위가 존재함을 나타낼 수 있습니다.기존의 마이크로 코칼 핵 보호 분석(micro cocal nucleus protection assay)과 같은 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 매우 단순하고 빠르며 효율적이라는 것이며, 특정 세포 리보솜 시스템 내의 모든 mRNA를 따라 주요 번역 후 지점을 결정하고 식별할 수 있게 해준다는 점입니다. 이 방법은 코돈 사용량, tRNA 풍부도 또는 mRNA 2차 구조와 같은 요인들이 번역 속도론에 어떻게 영향을 미치는지와 같이 번역 및 번역 후 단백질 접힘 분야의 몇 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한, 이 방법은 번역 속도론과 공번역 단백질 접힘 경로의 핵심 단계 사이의 관계에 대한 이해를 더욱 높이는 데 기여할 수 있습니다.이 기술의 함의는 생체 내 단백질 접힘 과정의 이해로 확장되며, 이는 주로 리보솜에서 번역이 일어나는 동안 공동 번역적으로 발생하는 것으로 믿어지고 있습니다. 비록 본 연구에서는 상용화된 세포 추출물을 사용하여 gamma bicrystalline의 무세포 번역을 수행하였습니다. 또한 이 기술은 모든 세포원에서 준비된 번역 가능 추출물을 사용하여 잠재적으로 모든 단백질의 번역 IDE를 식별하는 데 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 프로토콜의 두 가지 핵심 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다.첫 번째는 번역 반응을 수행하는 데 필요한 전체 시간을 설정하는 것으로, 이를 통해 대부분의 생성 중인 폴리펩타이드가 리보솜에 결합된 상태를 유지하도록 합니다. 두 번째는 생성 중인 폴리펩타이드의 대부분을 분리하기 위한 적절한 정제 시스템을 찾는 것이며, 정제 시스템의 선택은 연구 대상 단백질의 크기에 따라 달라집니다. 저희는 80년대 중반, 글로빈의 공번역 접힘(co-translational folding) 제안 모델과 관련하여 글로빈 분자의 번역 역학을 살펴보기로 결정했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.글로빈 번역의 불균일성은 1974년 PRO와 Maurice가 글로빈 NAS 및 사슬의 크기 배제 CLO 크로마토그래피를 사용했을 때 처음 발견되었습니다. 하지만 그들의 분석은 만족스러운 정밀도를 갖추지 못했으며, Pro와 more는 글로빈 번역 과정 중 4개의 주요 번역 일시 정지 지점을 관찰하였습니다. 이후 당사의 분석을 통해 약 10개의 추가적인 일시 정지 지점을 밝혀냈으며, 번역 중 글로빈 접힘의 상세 모델을 구축할 수 있었습니다. 여기에 설명된 기술은 폴리솜의 분리와 Tris-SDS page gel을 이용한 생성 중인 폴리펩타이드의 분석을 포함하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.이 두 단계 모두 고품질의 재현 가능한 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 시연은 Myelo 연구실의 대학원생 Sujata가 진행합니다. 메신저 RNA의 인비트로(in vitro) 전사를 위해, 적절한 제한 효소를 사용하여 T7 및/또는 SP6 프로모터 하위에 클로닝된 목적 유전자로 시작하십시오. DNA 템플릿을 종결 코돈 하단 및/또는 mRNA 3' 말단에서 선형화하십시오.DNA가 완전히 선형화되었는지 확인하기 위해 제한효소 처리된 샘플을 아가로스 겔 전기영동으로 분석합니다. 최적의 DNA 템플릿 농도를 결정한 후, 제조사의 지침에 따라 전사 키트를 사용하여 messenger RNA를 인비트로(in vitro) 전사합니다. 그다음, 염화리튬 침전법을 사용하여 mRNA를 정제합니다.그 후 아크릴아마이드 또는 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 순도를 확인합니다. 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)에 메티오닌이 제외된 1 mM 아미노산 혼합물, 10 unit의 RNA 억제제, 20 µCi의 방사성 35 S 메티오닌 및 토끼 망상적혈구 용해물을 첨가하여 100 µL의 인 비트로(in vitro) 번역 반응액을 준비합니다. 다음으로, 반응액을 30 °C에서 5분 동안 배양하여 예열합니다.그 다음 2 µg의 mRNA를 첨가하고 30 °C에서 5분 동안 배양하여 반응을 중단시킨 후, 얼음에 놓아 리보솜에 결합된 신생 폴리펩타이드를 분리합니다. TLA 110 로터 원심분리기를 사용하여 potassium chloride와 magnesium chloride가 포함된 4.5 mL의 30% glycerol Tris-HCl(pH 7.6) 위에 번역 반응물을 층으로 쌓고, 4 °C에서 100,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다. 다음으로 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 신생 폴리펩타이드가 포함된 폴리솜 펠릿을 0.5 mg/mL의 ribonuclease A가 포함된 1 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.6) 소량에 재현탁하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.펩타이드의 tRNA 에스테르 결합 가수분해를 촉진하기 위해, 최종 농도가 10 millimolar가 되도록 수산화나트륨을 반응액에 첨가하고 30분 동안 추가로 배양합니다. 생성된 폴리펩타이드를 tris-tris SDS-PAGE로 분리한 후, 겔을 고정 및 건조합니다. 겔을 자동방사법으로 처리한 다음, 인광 이미징을 통해 생성된 폴리펩타이드를 검출합니다.tRNA 풀의 변화로 인해 유도된 리보솜 이동의 변화는 번역 과정 중 축적되는 신생 폴리펩타이드의 크기 분포뿐만 아니라, 해당 지점에서의 일시 정지 시간을 반영하는 상대적 강도의 변화로 이어져야 합니다. 감마 B 결정 단백질(gamma B crystalline protein)의 신생 폴리펩타이드를 분리하여 Tristine SDS page로 분석하였습니다. RRL 및 e coli 시스템에서 폴리펩타이드의 길이와 강도가 서로 다르게 나타난 것은, 이 두 시스템에서 mRNA를 따라 이동하는 리보솜의 움직임이 서로 다른 번역 역학을 따른다는 것을 나타냅니다.예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물 시스템에는 존재하지 않고 E. coli 용해물에서만 나타나는 뚜렷한 17.7 kilodalton 밴드를 확인하십시오. Gamma B crystalline은 포유류 시스템에서는 빈번하게 나타나지만 E. coli에서는 매우 드물고 번역 속도가 느린 것으로 알려진 탠덤 아르기닌 코돈을 포함하고 있으며, 이는 여기서 보여지는 것처럼 해당 밴드가 이러한 탠덤 희귀 코돈에서의 리보솜 일시 정지로 인해 발생했음을 시사합니다.mRNA가 없는 경우에는 밴드가 관찰되지 않으며, puromycin 처리 시 폴리솜에서 대부분의 신생 사슬이 제거됩니다. 또한, puromycin을 장시간 처리하면 모든 신생 사슬이 제거되는데, 이는 관찰된 폴리펩타이드 생성물이 폴리솜과 함께 침강하는 MRP가 아니라 리보솜 결합 신생 사슬임을 확인시켜 줍니다. 이 기술을 숙달하면 1~2일 만에 완료할 수 있습니다. 절차의 소요 시간은 주로 원심분리 단계와 신생 펩타이드 겔 전기영동 단계의 시간에 따라 달라집니다.이 절차를 수행할 때, 배양 시간이 끝난 직후에 번역 반응을 즉시 중단하는 것이 중요합니다. 리보솜으로부터 신생 폴리펩타이드가 방출되는 것을 방지하기 위해서는 모든 단계에서 RNA가 유입되지 않도록 하는 것이 매우 결정적입니다. RNA 오염은 추출물의 번역 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 본 절차를 따르는 과정에서 리보솜으로부터 신생 폴리펩타이드가 방출되는 결과를 초래할 수 있습니다.특정 메세지상에서 리보솜 이동 효율에 미치는 mRNA 결합 단백질의 영향과 같은 다른 목표들 또한 개발 이후에 테스트될 수 있습니다. 이 기술은 단백질 접힘 분야의 연구자들이 번역 단백질 접힘 과정 중 희귀 코돈의 존재로 인해 발생하는 번역 일시 정지의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 기술은 이전에 메세지상의 리보솜 이동과 번역 단백질 접힘에서 코돈 치환의 역할을 테스트하는 데 사용되었습니다.이 영상을 시청한 후, 리보솜에 결합된 신생 폴리펩타이드를 분리하여 mRNA에 제시된 번역 활성 부위를 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. [35S] methionine과 같은 방사성 동위원소 및 표지된 아미노산을 사용할 때는 특별한 주의가 필요하며, 본 절차를 수행하는 동안 항상 이를 고려해야 함을 잊지 마십시오.

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연구

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Biology

생물학

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