Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 in vitro cell-free 시스템에서 번역 중에 생성된 SEC TED 70 s 리보솜 결합, 초기 사슬 복합체 또는 RNC를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 17 아미노산 long SEC M stalling sequence를 관심 유전자의 C 말단 말단에 도입하고 T 7 transcriptional promoter의 다운스트림으로 클로닝함으로써 달성됩니다. 다음으로, in vitro transcription reaction을 사용하여 mRNA를 전사한 다음 정제합니다.

그런 다음 정제된 mRNA를 S 30 E 대장균 추출물 시스템에서 방사성 아미노산과 함께 번역하여 합성된 단백질 또는 초기 폴리펩티드를 표지합니다. 마지막으로, 두 번째 Mr.Ed 리보솜 결합 초기 사슬 복합체는 자당, 구배, 원심분리 및 분획에 의해 분리됩니다. 궁극적으로, 초기 사슬이 구배 분획에서 분리된 표지된 폴리펩티드의 겔 전기영동 분석을 통해 70초 리보솜에 안정적으로 결합되어 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

스톡 코돈이 결여된 mRNA의 사용과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 번역 및 후속 원심분리 단계 동안 70초 리보솜에 초기 폴리펩티드 사슬의 부착을 고효율로 보장한다는 것입니다. 또한, 무중단 차단 기술과 대조적으로, 이 방법은 시험관 내 및 생체 내 시스템 모두에서 거의 동일한 효율로 사용할 수 있습니다. 이 방법은 번역 중 다양한 tranlational folding 중간체가 얼마나 일찍 형성될 수 있는지와 같은 tranlational protein folding 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 직접 또는 간접 구조를 사용하여 구조를 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로빙 및 결정 접근법 이 기술은 리보솜에서 단백질 접힘 경로를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 70 s 리보솜 결합 전체 길이 빈 감마 B 결정질 초기 사슬의 분리를 설명했습니다. 그러나 이 기술은 거의 모든 관심 단백질의 변이 질환을 분리하는 데 사용할 수 있습니다.

이 전략은 또한 자당 기온변화도 분리기 단계 도중 고전할지도 모른다 derm Es.Generally의 잘린 natin 폴리펩티드 사슬을 고립시키기 위하여 채택될 수 있다. 그러나 경험 1의 경우 이것이 문제가 되지 않습니다. 우리는 70에 결합된 감마 B 결정질 초기 폴리펩티드를 리보솜으로 분리하기 위해 두 번째 스톨링 서열을 활용하기로 결정했는데, 이는 mRNA가 결여된 차단 차단을 포함하는 초기의 덜 성공적인 시도 이후였습니다.

나중의 기술은 SECM 정지 시퀀스의 사용과 관련된 기술과 동일한 효율성으로 후속 원심분리 단계에서 RNC의 안정성을 보장할 수 없었습니다. RNC의 기울기 준비 및 분리와 관련된 단계는 배우기 어려울 수 있고 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 일정 수준의 전문 지식이 필요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 자세를 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생이 체외 전사 및 번역을 수행할 것입니다. T 7 및 또는 SP 6 기반 플라스미드에 복제된 관심 유전자로 시작하여 리보솜 초기 사슬 복합체 또는 RNC를 생성합니다.

폴리펩티드 단편이 리보솜 터널 밖으로 돌출되도록 하기 위해 M에서 정지 유도 서열을 추가하여 표적 폴리펩티드의 C 말단을 확장합니다. 단백질과 SEC M 정지 염기서열 사이에 유연한 글리신 시리아 리치 링커(flexible glycine Syrian rich linker)를 추가하여 체외 전사(in vitro transcription)를 준비하고, 개방형 판독 프레임의 다운스트림을 절단하여 템플릿 DNA를 선형화하는 사용자 제한 효소를 AROS 겔 전기영동을 통해 샘플의 완전한 분해를 검증합니다. 최적의 DNA 농도를 확인한 후 제조업체의 지침에 따라 고수율 전사 키트를 사용하여 메신저 RNA를 합성합니다.

염화리튬 침전을 사용하여 mRNA를 정제합니다. 그런 다음 아크릴아마이드 또는 aros gel에 샘플을 실행하여 순도를 확인합니다. 체외 번역용.

뉴클레아제가 없는 물에서 대장균 시스템을 사용하여 메티오닌 10 단위의 리보뉴클레아제 억제제 20, 35 s 메티오닌의 마이크로 큐리, 20 마이크로리터의 반응 혼합물 24 마이크로리터의 재구성 완충액 및 24 마이크로리터의 대장균을 첨가합니다. 용해물. 반응을 섭씨 30도에서 5분 동안 배양하여 예열합니다. 그런 다음 1-2마이크로그램의 mRNA를 추가하고 섭씨 30도에서 10-15분 동안 추가로 배양합니다.

70 s 리보솜 결합 초기 사슬 복합체 또는 NC를 분리하기 위해 얼음에 올려 놓아 반응을 중지합니다. 20 밀리몰 힙에서 5-30% 자당 구배의 4.5 밀리리터 위에 번역 반응을 층층이 이룹니다. 수산화칼륨 pH 7.5 15 밀리몰 마그네슘, 100 밀리몰 아세트산칼륨 및 1 밀리몰 DTT 원심 분리기 41, 000 RPM에서 원심 분리 후 섭씨 4도에서 2 시간 동안 프로그래밍 가능한 밀도 구배 시스템과 254 나노 미터로 설정된 흡광도 검출기를 사용하여 자당 구배를 분별합니다.

SEC M 확장 단백질이 70s 리보솜에 부착된 상태로 남아 있는지 확인하기 위한 추가 분석을 위해 70s 리보솜을 포함하는 분획을 수집합니다. 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 첨가하여 각 구배 분획에 단백질을 침전시킵니다. 다음날 4 섭씨 온도에 밤새 표본을 배양하고, 14, 단백질을 펠릿으로 만들기 위하여 15 분 동안 000 시간 G에 표본을 원심 분리하고, 1개의 millimolar tris, HCL PH 7.6에 아세톤의 4 대 1 비율에 있는 펠릿을 세척하십시오.

펠릿을 자연 건조시킨 다음 SDS 페이지 로딩 버퍼에 다시 매달아 놓습니다. tris Trice SDS 페이지로 샘플을 해결한 다음 젤을 고정 및 건조시키고 여기에 표시된 대로 자동 방사선 촬영 및 포스포 이미징을 실시합니다. in vitro 번역에 이어 70 S 리보솜은 감마 B 결정질 단백질이 리보솜에 안정적으로 결합된 상태를 유지하도록 하기 위해 자당, 구배, 원심분리 및 분획에 의해 분리되었습니다.

분획을 함유하는 70 s를 풀링, 탈염 완충액을 교환하고 추가 수크로스 구배 원심분리를 실시하였다. 여기에 제시된 결과는 SEC M이 감마 B 결정질 RNC의 번역 정지를 효율적으로 유도할 수 있음을 시사합니다. 일단 마스터되면 이 기술은 일반적으로 하룻밤 TCA 침전 단계를 포함하는 초기 사슬의 겔 전기영동 분석을 제외하고 하루 만에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 모든 단계에서 RNA 오염을 방지하는 것이 분명히 중요합니다. RNS 오염은 추출물의 번역 효율에 영향을 미칠 수 있으며 70번째 리보솜에서 초기 폴리펩티드가 방출될 수 있습니다. 이 절차를 따르면, 최종 목표에 따라 70번째 리보솜에 안정적으로 결합된 소정의 랑세스의 NAST와 폴리펩티드를 얻을 수 있습니다.

이 복합체는 NMR 또는 fre와 같은 직접 및 간접 접근 방식을 사용하여 리보솜 결합 초기 사슬의 확인 결정 또는 개발 후 테스트 인자 및 리간드 결합과 같은 다양한 목적으로 사용할 수 있습니다. 이 기술은 구조 생물학 및 단백질 접힘 분야의 연구자들이 리보솜에 결합된 전체 길이 단백질과 유아용 침대 번역 접힘 중간체의 확인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 본 후에, 당신은 tranlational 단백질 접힘의 분야에 있는 각종 질문에 응답하기 위하여 더 이용될 수 있는 70 s 리보솜에 안정적으로 바운스된 초기 폴리펩티드를 준비하고 고립시키는 방법의 좋은 이해가 있어야 합니다.

방사성 동위원소 및 라벨링된 아민산(예: A 35 메티오닌)으로 작업하려면 특별한 예방 조치가 필요하며 이 절차를 수행하는 동안 항상 고려해야 한다는 점을 잊지 마십시오.