Name: Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 SecM 체포 시퀀스를 활용한 리보솜 결합 신생 폴리펩타이드 분리 기법입니다. E. coli 무세포 시스템에서 70S 리보솜에 안정적으로 결합된 RNC를 획득하여 번역 동역학 및 단백질 폴딩 초기 과정을 연구할 수 있습니다.

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1. DNA를 템플릿 준비 및 시험 관내 스크립트 작성에 <ol><li> 관심있는 유전자는 어떤 T7 및 / 또는 예 : 플라스미드 기반 SP6 발기인에 복제됩니다. 관심 RNCs를 얻으려면 폴리펩티드 대상의 C-말단은 SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7 구속 유도 시퀀스를 추가하여 연장됩니다. 관심 폴리펩티드 조각은 ribosomal 터널 밖으로 압출 성형 것을 보장하기 위해서, 대상 단백질의 C-말단 부분은 12-14 최소한 30 아미노산에 의해 확장되어야한다. 유연한 글리신 - 세린 풍부 링커는 모든 가능한 conformational 제약을 피하기 위해 단백질과 SecM 체포 시퀀스 사이에 도입 할 수 있습니다. </li><li> 시험 관내 전사의 경우, 템플릿 DNA가 ORF의 하류를 절단 제한 효소로 선형되어야합니다. 하나는 아가로 오스 겔 전기 영동에 제한 소화 제품을 실행하여 플라스미드 DNA의 완전한 선형화를 확인해야합니다. </li><li> 선형 혈장id는 추가 시험 관내 전사 반응에 사용됩니다. 템플릿 DNA의 서로 다른 농도는 시험 관내 전사에 필요한 최적의 DNA 농도를 확인하는 테스트를 할 수 있습니다. 일반적으로 Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)로, 1 μg 선형 DNA는 40-60 μg의 mRNA를 얻을. 시험 관내 전사에는 제조 업체의 지침 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)에 따라 이루어집니다 . </li><li> 시험 관내 전사에 따라 mRNA는 제조 업체의 지침 (Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트, Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)에 따라 염화 리튬의 석출에 의해 정화된다. </li><li> mRNA 무결성이 더욱 아크릴 아미드 또는 아가로 오스의 젤을 사용하여 전기 영동으로 확인됩니다. </li></ol> 2.에서 체외 번역 RTS 100 E. 대장균 HY 키트 (5 프라임, Gaither 이용한 체외 번역에 들어sburg, MD)는 다음 단계를 따르십시오 : <ol><li> 의 체외 번역 반응이 다음과 같은 제조 업체의 지침을 100 μl를 준비합니다. 간단히, nuclease 무료로 물속에 24 μl 아미노산 혼합물 마이너스 메티오닌 (1 ㎜), Ribonuclease 억제제의 10 단위 (Invitrogen / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕), 방사성의 20 μCi [35 S] (-메티오닌 MP의 Biomedicals를 추가 솔론, OH), 20 μl 반응 믹스, 24 μl Reconstitution 버퍼와 E의 24 μl 대장균은 Lysate. </li><li> 따뜻한 번역 반응을 미리하는 5 분 동안 30 ° C에서 반응을 품어. 10-15 분 30 ° C에서 번역 반응과 부화 mRNA 1-2 μg을 추가합니다. </li><li> 얼음 번역 반응을 배치하여 반응을 중지합니다. </li></ol> 3. 체외 번역 반응의 초기 폴리펩티드의 분리 <ol><li> RNCs를 분리하려면 번역 반응 20 MM HEPES-코이의 산도 7 5-30%의 자당 기울기 4.5 ML 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다0.5, 15 밀리미터 MgCl 2, 100 MM 칼륨 아세테이트, 1 밀리미터 DTT와, 41,000 rpm으로 4 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 SW55-티 로터를 사용 ° C를 2 시간 동안 centrifuged. </li><li> 원심 분리 후, 자당 기울기 다른 ribosomal 인구 및 관련 초기 체인을 분리 fractionated입니다. 분리는 ISCO UA-6 흡광 검출기를 사용하여 254 nm의에서 연속 녹화로 ISCO 프로그램 밀도 구배 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. </li><li> 70 년대의 변이를 포함하는 분획 (들) 수집 및 추가 실험 목적에 따라 분석하고 있습니다. </li></ol> 4. 단백질의 관찰 트리스 - tricine SDS 페이지와 Ribosome뿐 이잖아 SecM 확장 단백질은 ribosome 70 년대에 붙어 남아 있는지, 확인하려면 그라데이션 분수를 모으고 다음과 같이 취급되었다 : <ol><li> 각 분획의 단백질은 10 %의 최종 농도로 Trichloroacetic 산 (TCA)를 추가하여 시켰던 4 ° C overni에서 incubated되었다ght. </li><li> 하룻밤 배양 후 시료 펠렛 ~ 15 분 단백질을 위해 14,000 X g에서 centrifuged되었다. 다음 원심 분리의 표면에 뜨는이 제거하고 펠릿는 솔루션이 포함된 아세톤으로 두번 씻었습니다 : 1 ㎜ 트리스-HCL의 산도 7.6 (4시 1분). 펠렛은 더 이상 공기가 건조하고 SDS-PAGE 로딩 버퍼에 해산했습니다. </li><li> 처리 시료가 해결 및 트리스 - tricine SDS-PAGE에 의해 분석되었다. </li><li> 전기 영동 후, 젤류가 수정되었습니다, 진공 젤 다이어를 사용하고 autoradiography를 받게 건조. 어렸을때 polypeptides의 분포는 phosphoimaging을 사용하여 관찰되었다. </li></ol> 5. 대표 결과 여기에서 우리는 안정적으로 ribosome 70에 바인딩 장편 소 감마-B Crystallin의 고립을 설명하는 실험을 제시한다. 그림 1은 소 감마-B Crystallin의 RNCs의 격리에 관련된 단계를 묘사. 감마-B Crystallin의 C-말단는 32 아미노산의 t으로 전체적인 확대되었다ribosomal 터널의 전체 길이 단백질 extrudes 아웃을 보장 해줬, 이것은 또한 폴리펩티드 융합의 C-말단 매우 배치 SecM 끄는 순서를 포함합니다. 체외 번역에 이어 70 년대의 리보솜은 자당의 기울기 원심 분리 (그림 2.1)에 의해 분리되었다. 단백질이 안정적으로 ribosome에 바인딩 상태를 유지하기 위해, 분수를 포함하는 70가 풀링되었다 desalted, 버퍼 교환 및 자당의 기울기 원심 분리의 추가 라운드 (그림 2.2)에 노출. 그림 2에 제시된 결과는 명확하게 그 SecM 효율적으로 감마-B Crystallin의 RNCs의 translational 체포를 유도 수 있습니다 제안합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" /> 1 그림. RNCs의 분리에 관여 단계 도식 설명. 소 감마-B Crystallin의 C-말단는 32 아미노산 서열에 의해 확대되었다. 이 확장C-말단 영역은 또한 SecM 체포 시퀀스를 포함합니다. SecM 순서와 감마-B Crystallin은 pIVEX 2.3 (T7 기준) 플라스미드에 복제되었습니다. 시험 관내 전사의 내용은 템플릿 DNA가 XbaI으로 선형되었다. 선형화된 템플릿은 추가 시험 관내 전사에 사용되었습니다. DNA를 템플릿에서 T7은 T7 프로 모터의 감마-B Crystallin 유전자 위치 하류를 transcribes T7 RNA 중합 효소에 의해 인정되고 있습니다. mRNA는 염화 리튬의 석출 방법을 사용하여 정화되었다. 정화 mRNA 그러면 체외 변환에 사용되었다. 다음과 부화는 번역 반응은 5-30%의 자당 기울기 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가, 2 시간 동안 41,000 RPM, 4 ° C에서 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 SW55-티 로터에 centrifuged되었다. <sp클래스 = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" /> 그림 2. 소 감마-B Crystallin의 분리가 안정적으로 70 년대의 ribosome에 바인딩 RNCs. 1 μg의 mRNA는 100 μl 반응 E.에 혼합되었다 대장균 S30 추출 시스템 20 μCi [35 S]와 프로토콜 절에서 설명한대로-메티오닌과 15 분 동안 30 ° C에서 incubated. 다음과 부화는 번역 반응 20 MM HEPES-코이 산도 7.5, 15 밀리미터 MgCl 2, 100 MM 칼륨 아세테이트, 1 ㎜ DTT에 5-30%의 자당 기울기 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가와 41,000에서 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 SW55-티 로터에 centrifuged되었다 RPM, 2 시간 4 ° C에서. 속도 침강에 따라 그라데이션이 언로 드되었으며 ribosome 프로 르가 얻은 것입니다. 데이터 PeakTrak 프로그램 (ISCO 구배 밀도 기울기 분획화 시스템)에 의해 기록되었다. 분수가 수집되었다 단백질은 TCA는 시켰던와 해결 16.5 %의 T에 6퍼센트 C 트리스-T였다ricine 페이지 겔 15. 겔은 건조하고 autoradiography에 대해 접했습니다. 아래 노출이 젤은 태풍 9,410 이미징 스캐너를 사용하여 스캔했습니다. 그림 2.1 전체 길이 감마-B Crystallin은 70 ribosome 분수에 있는지 보여줍니다. 따라서 SecM 끄는 순서는 안정 소 감마-B Crystallin의 RNCs의 절연을 허용합니다. 그림 2.2에서 데이터가 명확하게 고립된 RNCs 실제로 안정을 나타냅니다. 현재 실험에서 자당의 기울기 원심 분리의 첫 라운드 이후 70 년대의 분수는 풀링된으며 자당은 HEPES-코이 산도 7.5, 15 MM 20 밀리미터를 포함하는 용액에 버퍼 교환 뒤에 Amicon 울트라-4 원심 필터 유닛 (Millipore)을 사용하여 삭제되었습니다 MgCl 2, 100 밀리미터 칼륨 아세테이트, 1 밀리미터 DTT. 이 샘플은 더욱 5-30%의 자당 기울기와 fractionated 통해 원심 분리의 추가 라운드를 받게되었다. 각 분획은 취급 그림 2.1에서처럼 분석되었다.

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

시험 관내 전사와 번역에 사용된 부품의 재현성 결과, 품질과 집중이 중요하십시오. 우리는 시험 관내 전사 및 번역 추출물에서 시판 사용하고 신중하게 처리한다면 그들은 효과적이고 재현성 결과를 제공합니다. mRNA의 품질이 번역에 영향을 미칠 수 있으므로, 그것은 체외의 번역을 위해 사용하기 전에 mRNA의 무결성을 테스트하기 위해 가장 중요합니다. 체외 번역에 대한 배양 시간은 단백질의 길이에 따라 다릅니다. 또한, 원심 분리의 시간 / 속도, 그에 따라 조정할 수 있습니다 경우, 70 ribosomal 분수가 잘 해결되지 않고 50에서 분리. 또한, ribosome 바운드 단백질 단지는 RNase 오염을 피하기 위해 신중하게 다루어 져야합니다. 또한, 버퍼 조건 주의깊게 모니터링해야하며 MG 2 킬레이트 수 chelating 요원은 + 피해야한다. <p class="jove_conte...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 키트의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 높은 항복 전사 키트 </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100 E.coli HY 키트 </td><td> 5 프라임 </td><td> 2,401,100 </td></tr><tr><td> Ribonuclease 억제제 </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> 트랜스 [35 S]-라벨 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 0,151,006 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라-4 원심 필터 유닛 </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> 저장 형광체 autoradiography </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 태풍 9,410 가변 모드 영상기 </td></tr><tr><td> 밀도 그라데이션 분획화 시스템 </td><td> Teledyne Isco 주식 회사 </td><td> ISCO 프로그램 밀도 기울기 시스템 </td></tr><tr><td> 자당 그라데이션 Centrifugation </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> Optima L-90 K 예비의 Ultracentrifuge </td></tr></tbody></table>

ribosome 바운드 polypeptides을 파악하는 도구로 secm 체포 시퀀스를 사용하여

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

광범위한 연구는 세포에 개고 단백질이 공동 translational 절차 1-5는 것을 제안 충분한 증거를 제공했습니다. 다만, 폴리펩티드 사슬는 기능적인 양식을 달성하기위한 공동 translational 접는 동안 다음과 정확한 경로는 여전히 수수께끼입니다. 이 과정을 이해하고 공동 translational 접힘 중간체의 정확한 형태를 결정하기 위해서는, 그들의 자세한 구조 분석을 허용하도록 미리 정해진 크기의 초기 체인을 들고 RNCs의 절연을 허용 기법을 개발하는 것이 필수적입니다. SecM (분비 모니터)는 170 아미노산 E.입니다 secM-secA 오페론 6 하류 SecA (분비 운전) ATPase의 표현을 규제 대장균 단백질. Nakatogawa와 이토 원래 SecM 단백질의 C-말단 지역에서 17 아미노산 긴 시퀀스 (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166)에 충분하고 필요한 것을 발견따라서 peptidyl-glycyl-tRNA가 안정적으로 7-9 P 사이트 ribosomal에 바인딩 생산, Gly165에서 SecM 신장의 연기자 거든. 더 중요한 건, 그것이 17 아미노산 긴 시퀀스 따라서 미리 결정된 사이즈 7의 초기 체인을 들고 RNCs의 생산을 허용하는 거의 모든 전신 및 / 또는 잘린 단백질의 C-말단에 융합 수있는 사실을 발견했습니다. 따라서 대상 단백질에 융합하거나 삽입할 때 SecM 끄는 순서는 폴리펩티드 사슬의 신장의 체포를 생산하고 E.에서 생체내에 모두 안정적인 RNCs를 생성 대장균 세포와 세포없는 시스템에서 체외 인치 자당의 기울기 원심 분리는 더욱 RNCs을 분리하기 위해 사용된다. 격리된 RNCs는 공동 translational 접힘 중간체의 구조 및 기능적 특징을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에는이 기술이 성공적으로 여러 개의 ribosome 바운드 초기 체인 10,11의 구조에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 다음은 소 감마-B Crystallin의 고립을 설명하는 것은 SecM에 융합 및 체외 번역 시스템에서 발생 RNCs.

우리는 지금 여기 정기적으로 안정적으로 바운드 ribosome 초기 체인 단지 (RNCs)를 분리하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이 기술은 17 아미노산 긴 SecM &quot;체포 시퀀스는&quot;prokaryotic에서 번역 신장을 중지할 수있는 발견의 활용 (<em&gt; E. 대장균</em&gt; 거의 모든 단백질 (또는 C-말단에 융합)에 삽입) 시스템.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

광범위한 연구를 통해 세포 내 단백질 접힘이 공동 번역 과정(co-translational process)임을 시사하는 충분한 증거들이 제시되었습니다1-5. 그러나 정확한 경로...

이 프로시저의 전반적인 목적은 인 비트로(in vitro) 무세포 시스템에서 번역 중에 생성된 SEC TED 70 s 리보솜 결합 nascent chain complex 또는 RNC를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자의 C-말단에 17개 아미노산 길이의 SEC M 정지 서열을 도입하고, 이를 T7 전사 프로모터 하위에 클로닝함으로써 수행됩니다. 그다음, 인 비트로 전사 반응을 통해 mRNA를 전사한 후 이를 정제합니다.그 다음, 정제된 mRNA를 방사성 아미노산이 포함된 S 30 E coli 추출 시스템에서 번역하여 합성된 단백질 또는 nascent polypeptide를 표지합니다. 마지막으로, 두 번째 Mr.Ed 리보솜 결합 nascent chain 복합체를 sucrose 밀도 구배 원심분리 및 분획법으로 분리합니다. 최종적으로, 구배 분획에서 분리된 표지된 polypeptide의 젤 전기영동 분석을 통해 nascent chain이 70 s 리보솜에 안정적으로 결합되어 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.종결 코돈이 결핍된 mRNA를 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 번역 및 후속 원심분리 단계 동안 신생 폴리펩타이드 사슬이 70 s 리보솜에 결합하는 것을 매우 효율적으로 보장한다는 점입니다. 또한, 종결 코돈 결핍 기술과 달리, 이 방법은 in vitro 및 in vivo 시스템 모두에서 거의 동일한 효율로 사용될 수 있습니다. 이 방법은 번역 과정 중 어느 시점에 다양한 번역 폴딩 중간체가 형성되는지와 같이 번역 단백질 폴딩 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 나아가 직접적 또는 간접적 구조 분석을 통해 이들의 구조를 분석하는 데 기여할 수 있습니다.탐침 및 결정 방법 이 기술은 리보솜에서의 단백질 접힘 경로를 파악하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 70 s 리보솜에 결합된 전체 길이의 bine gamma B 결정성 신생 사슬의 분리 방법을 설명하였습니다. 하지만 이 기술은 사실상 관심 있는 모든 단백질의 다양한 변이체를 분리하는 데 사용될 수 있습니다.이 전략은 derm Es의 절단된 natin 폴리펩타이드 사슬을 분리하는 데에도 채택될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 수크로스 밀도 구배 원심분리 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 하지만 숙련된 연구자에게는 문제가 되지 않을 것입니다. 정지 코돈이 결여된 mRNA를 사용한 초기 시도가 성공적이지 않자, 우리는 70S 리보솜에 결합된 gamma B crystalline 신생 폴리펩타이드를 분리하기 위해 두 번째 정지 서열(stalling sequence)을 활용하기로 결정했습니다.후자의 기술은 SECM 정지 서열을 사용하는 기술만큼의 효율로 이후의 원심분리 단계 동안 RNC의 안정성을 보장할 수 없었습니다. 구배(gradient) 준비 및 RNC 분리 단계는 학습하기 어려울 수 있으며, 재현 가능한 결과를 보장하기 위해서는 일정 수준의 전문 지식이 필요하므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 시연은 본 실험실의 대학원생이 수행할 예정입니다. 인비트로(in vitro) 전사와 번역을 수행하기 위해, 먼저 ribosome nascent chain complex 또는 RNC를 생성하기 위해 T7 및/또는 SP6 기반 플라스미드에 클로닝된 관심 유전자부터 시작하십시오.폴리펩타이드 단편이 리보솜 터널 밖으로 밀려나올 수 있도록 M의 정지 유도 서열(arrest inducing sequence)을 추가하여 표적 폴리펩타이드의 C-말단을 연장합니다. 단백질과 SEC M 정지 서열 사이에 유연한 glycine-serine 풍부 링커를 추가하여 인비트로(in vitro) 전사를 준비합니다. 템플릿 DNA를 선형화하기 위해 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 하류(downstream)를 절단하는 제한 효소를 사용하고, AGOs 겔 전기영동을 실시하여 시료가 완전히 절단되었는지 확인합니다. 최적의 DNA 농도를 확인한 후, 제조사의 지침에 따라 고수율 전사 키트를 사용하여 메신저 RNA를 합성합니다.염화 리튬 침전법을 사용하여 mRNA를 정제하십시오. 그런 다음 아크릴아마이드 겔 또는 아가로스 겔에서 샘플을 전기영동하여 순도를 확인하십시오. 이는 인비트로(in vitro) 번역을 위한 것입니다.nuclease free water를 사용한 e coli 시스템에서, methionine이 제외된 1 mM 아미노산 혼합물, 10 units의 ribonuclease inhibitor, 20 µCi의 35S-methionine, 20 µL의 반응 혼합물, 24 µL의 재구성 버퍼 및 24 µL의 e coli Lysate를 첨가합니다. 30 °C에서 5분 동안 배양하여 반응액을 예열합니다. 그 다음 1~2 µg의 mRNA를 첨가하고 30 °C에서 10~15분 동안 추가로 배양합니다.70 S 리보솜 결합 신생 사슬 복합체(nascent chain complexes, NCs)를 분리하기 위해 반응물을 얼음에 놓아 반응을 정지시킵니다. 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 15 mM 마그네슘, 100 mM 아세트산 칼륨 및 1 mM DTT가 포함된 5-30% sucrose gradient 4.5 mL 위에 번역 반응액을 층 분리하여 올립니다. 4 °C에서 41,000 RPM으로 2시간 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 프로그래밍 가능 밀도 구배 시스템과 254 nm로 설정된 흡광 검출기를 사용하여 sucrose gradient를 분획합니다.SEC M 연장 단백질이 70 s 리보솜에 계속 부착되어 있는지 확인하기 위한 추가 분석을 위해 70 s 리보솜이 포함된 분획들을 수집합니다. 각 구배 분획에 트리클로로아세트산을 첨가하여 단백질을 침전시킵니다. 시료를 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 14,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 단백질 펠렛을 형성하고, 1 mM tris, HCL pH 7.6과 아세톤을 1:4 비율로 혼합한 용액으로 펠렛을 세척합니다.펠릿을 공기 중에서 건조시킨 후, SDS page 로딩 버퍼에 다시 현탁합니다. Tris-Tricine SDS page로 샘플을 분리한 다음, 겔을 고정 및 건조시키고 여기에 표시된 대로 자동 방사선 촬영 및 인산화 이미징을 수행합니다. 시험관 내 번역(in vitro translation) 후, gamma B 결정성 단백질이 리보솜에 안정적으로 결합되어 있는지 확인하기 위해 sucrose 밀도 구배 원심분리와 분획법으로 70 S 리보솜을 분리하였습니다.70 s를 포함하는 분획들을 모아 탈염 및 버퍼 교환을 수행한 후, 추가적으로 수크로스 밀도 구배 원심분리를 실시하였습니다. 여기에 제시된 결과는 SEC M이 gamma B crystalline RNCs의 번역 정지를 효율적으로 유도할 수 있음을 시사합니다. 이 기술은 일단 숙달되면, 대개 하룻밤 동안 TCA 침전 단계가 필요한 신생 사슬의 겔 전기영동 분석을 제외하고는 작업일 기준 하루 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 모든 단계에서 RNA 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. RNA 오염은 추출물의 번역 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 70S 리보솜으로부터 신생 폴리펩타이드의 방출을 유도할 수 있습니다. 이 절차를 통해 최종 목적에 따라 70S 리보솜에 안정적으로 결합된 NAST 및 미리 정해진 길이의 폴리펩타이드를 얻을 수 있습니다.이 복합체는 NMR 또는 FRET과 같은 직접 및 간접적인 접근 방식을 통한 리보솜 결합 신생 사슬(nascent chains)의 구조 결정이나, 개발 후 인자와 리간드의 결합 테스트 등 다양한 목적으로 활용될 수 있습니다. 이 기술은 구조 생물학 및 단백질 접힘 분야의 연구자들이 리보솜에 결합된 전장 단백질의 구조뿐만 아니라 공번역 접힘 중간체(cotranslational folding intermediates)를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 번역 단백질 접힘 분야의 다양한 질문에 답하는 데 활용할 수 있도록 70S 리보솜에 안정적으로 결합된 신생 폴리펩타이드를 준비하고 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.방사성 동위원소 및 ${}^{35}\text{S}$ 메티오닌과 같은 표지 아미노산을 다룰 때는 특별한 주의가 필요하며, 본 실험 절차를 수행하는 동안 항상 이를 고려해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 진핵 세포의 변이를 번역의 추출을위한 프로토콜을 설명합니다. 일단 추출된, 리보솜은 다른 ribosomal 인구가 분석 수 있도록 자당 기울기 분별 (분리)에 의해 monosomes 및 polyribosomes로 구분됩니다. 따라서이 방법은 번역의 규정을 조사를위한 황금 표준입니다.

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기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.

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이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.

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리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

여기에서 우리는 박테리아에 있는 RIBO-seq를 위한 견본 수집 및 준비의 단계를 기술합니다. 이러한 지침에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 간단하고 표준 실험실 장비를 사용하며 리시스에서 라이브러리 획득까지 7 일이 걸립니다.

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

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AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

배우세요 SecM 체포 시퀀스를 활용한 리보솜 결합 신생 폴리펩타이드 분리 기법입니다. E. coli 무세포 시스템에서 70S 리보솜에 안정적으로 결합된 RNC를 획득하여 번역 동역학 및 단백질 폴딩 초기 과정을 연구할 수 있습니다.

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