감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Lyco 음성 가닥, RNA 바이러스. 인플루엔자 바이러스의 게놈은 바이러스 갈비뼈 핵 단백질 복합체 또는 VR nps의 형태로 포장되어 단일 가닥 게놈이 핵 단백질에 의해 캡슐화되고 PA PB 1 및 PB 2 소단위로 구성된 심황 중합효소 복합체와 결합되어 감염된 포유류 세포의 온전한 복합체를 정제합니다. 헬라 세포는 재조합 스트렙트 태그가 지정된 인플루엔자 바이러스와 함께 배양됩니다.

바이러스가 세포에 들어가면 바이러스 RNA는 감염 후 핵에서 합성되고, 세포는 세제를 사용하여 거짓말을 하고 원심분리 및 공격 기반 염색질 분획 프로토콜을 사용하여 세포질 핵 및 염색질 분획으로 분획됩니다. 마지막으로, 스트렙트 태그가 지정된 VRP는 은 염색에 의한 정제된 VR NPS의 단백질 및 RNA 구성의 각 분획 분석에서 친화성 정제된 것은 이 프로토콜을 단단히 사용하더라도 염색질 결합 VRP를 분리할 수 있음을 보여줍니다. 그대로. 따라서 인플루엔자 바이러스 늑골 핵 단백질 복합체를 친화성 정제하는 표준 방법과 비교할 때 당사 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 당사의 방법을 사용하여 인플루엔자 바이러스 mRNA 합성 부위로 알려진 감염된 세포의 염색질에서 VR NPS를 정제할 수 있다는 것입니다.

따라서 우리의 방법은 예를 들어 어떤 바이러스 또는 세포 요인뿐만 아니라 예를 들어 바이러스 mRNA 합성 또는 바이러스 게놈 RNA 합성에 어떤 번역 후 변형이 필요한지 등과 같은 바이러스 복제 및 전사 조절을 둘러싼 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 이 방법을 처음 사용하는 연구자들은 핵 하위 분별이 생화학적 조건에 매우 민감하고 세포주마다 크게 다를 수 있기 때문에 약간의 어려움에 직면할 수 있습니다. 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포를 치료하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다., RWSN PB 2 연쇄상구균은 PB 2 소단위체의 C 말단에 유전적으로 융합된 연쇄상구균 태그가 3의 감염 다중

차가운 PBS로 세포를 한 번 씻은 다음 차가운 PBS 12ml를 넣고 접시에서 꺼냅니다. 고무 스크레이퍼 사용. 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮기고 원심분리로 펠릿화합니다.

이 절차에서 가장 어려운 부분은 세포 분획 프로토콜입니다. 세포핵은 균질화 및 혼합 절차에 매우 민감하며, 잘못 수행하면 염색질 추출물을 쉽게 망칠 수 있습니다. 따라서 균질화 기술뿐만 아니라 여기에 표시된 것처럼 용해물의 일반적인 처리를 따르는 것이 매우 중요합니다.

스핀 흡입 후 PBS 및 Resus는 10ml의 차가운 자당 완충액에 세포 펠릿을 현탁시킵니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 10ml 플라스틱 세럼 피펫에 부착하고 세포를 통과시켜 세포 덩어리를 분해합니다. 얼음 위에서 10분 동안 현탁액을 배양합니다.

주기적으로 세포를 부드럽게 반전시켜 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 비 IET P 40을 0.5 %의 최종 농도에 추가하고 15 초 동안 고속으로 와류를 일으킨 다음 탁상용 원심 분리기에서 섭씨 4도에서 3, 500 회 G에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 스핀 후, supinate를 제거하고 15 밀리리터의 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

supinate는 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이것은 세포질 분획입니다. 펠릿은 여기에 표시된 것처럼 원래 세포 펠릿보다 작고 흰색이어야 합니다.

프로토콜이 나중에 완료될 경우, 세포 펠릿을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 그렇지 않으면 이전과 같이 펠릿을 5ml의 차가운 자당, 완충액 및 원심 분리로 계속 세척하십시오. 스핀이 완료되면 supinate를 버리고 1.5ml의 차가운 핵 플라즈마 추출 버퍼에 핵이 포함된 펠릿을 재현탁합니다.

재현탁된 펠릿을 꼭 맞는 절굿공이로 냉각된 전체 유리 4밀리리터 댄스 균질화기로 옮기고 20번의 스트로크로 핵을 균질화합니다. 거품을 피하려면 약 10 스트로크 후에 저항이 증가해야합니다. 효율적인 균질화를 확인하려면 위상차 현미경으로 샘플을 검사하십시오.

핵은 더 이상 둥글지 않아야 하며 불규칙한 형태를 가지며 파열된 것처럼 보여야 합니다. 핵이 균질화되면 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도의 회전 휠에서 20분 동안 균질산염을 배양합니다.

다음 16, 000 시간 G에 10 분 동안 마이크로 분리기에 있는 4 섭씨 온도에 원심분리기. 스핀 후 핵 플라즈마 분율인 supinate를 1.5ml 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 보관합니다. 그런 다음 Reese는 펠릿을 1.5ml의 소화액에 현탁시키고 완충액을 섭씨 37도로 예열합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 분획을 배양합니다. 다음으로, 42마이크로리터의 5몰 염화나트륨을 추가하여 염화나트륨의 최종 농도를 150밀리몰로 만든 다음 얼음에서 20분 동안 배양합니다. 16, 000 번, 10 분 동안 섭씨 4도의 마이크로 원심 분리기에서 G에 원심 분리기.

회전 후 supinate를 제거하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이것은 CH one 50 분수입니다. Reeses는 1.5ml의 차갑고 높은 염분 완충액으로 펠릿을 구부리고 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.

16, 000 번, 10 분 동안 섭씨 4도에서 마이크로 원심 분리기에서 G를 원심 분리기. 탈수 후 sup natant를 제거하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이것은 CH 500 분수입니다.

분별 프로토콜 동안 저장된 분획을 꺼내 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 세포질 분획에 300마이크로리터의 5몰 염화나트륨을 추가합니다. 그런 다음 분획당 Sphero 비드에 포장된 100마이크로리터의 연쇄상구균 T를 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

비드에 10부피의 연쇄상구균 세척 완충액을 추가합니다. 튜브를 뒤집어 혼합하고 1000회씩 5분 동안 원심분리합니다. G를 탁상용 원심분리기에 넣고 sna를 버립니다.

완충액 세척을 두 번 반복한 다음 Reese는 동일한 부피의 연쇄상구균 세척 완충액에서 펠릿을 구부리고 세척된 연쇄상구균 200마이크로리터의 연쇄상구균 액을 각 분획에 비드 슬러리에서 작용합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전시킵니다. 그런 다음 섭씨 4도의 1000배 G에서 1분 동안 튜브를 원심분리하고 supinate를 버립니다.

그런 다음 15ml 튜브에서 세포질 분획과 함께 배양된 비드용 비드에 1ml의 세척 버퍼를 추가합니다. 세척 버퍼를 추가하고 비드를 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 1 분 동안 구슬을 세척하고십시오, 그 후에 4 섭씨 온도에 1000 시간 G에 1 분 동안 관을 원심 분리하십시오.

마지막 세척 단계 후에 두 번 반복합니다. 평평한 피펫 팁을 사용하여 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 엘루시안 완충액을 넣고 튜브를 부드럽게 섞어 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.

배양하는 동안 때때로 튜브의 바닥을 부드럽게 두드려 구슬을 혼합합니다. 15 분이 통과 된 후 원심 분리기를 사용하여 섭씨 4도에서 1000 회 G로 1 분 동안 선택합니다. 용리된 연쇄상구균 태그가 지정된 VRP가 포함된 Senna를 수집합니다.

그, 우리 세포는 인플루엔자 바이러스 균주, WSN에 9 시간 동안 감염되었으며, 분획 된 용해물은 여기에 표시된 것처럼 서양 꽃에 의해 분석되었습니다. 부드러운 핵 분리는 튜불린과 같은 세포질 단백질을 효율적으로 추출하는 동시에 풍부한 핵 단백질의 방출을 방지합니다. 낮은 염으로 추출된 염색질 분획은 전사에 중요한 단백질이 풍부합니다.

높은 염분 분획은 용출된 세포질 분획의 단백질 구성을 결정하기 위해 주로 뉴클레오솜을 포함하지만, 태그가 지정되지 않은 바이러스, RWSN 또는 RWSN PB 2 연쇄상구균에 9시간 동안 감염된 R 세포의 V NPS는 세포질 용리액에 대해 표시된 바와 같이 은 염색으로 분석했습니다. 여기서 95 킬로달톤과 100 킬로달톤 사이의 대역에 비해 55 킬로달톤 이상의 주요 밴드에서 입증된 바와 같이 NP 대 PA PB 1, PB 2의 비율이 높은데, 이는 대부분의 연쇄상구균 PB 2가 완전히 형성된 VRNP의 일부로 정제됨, 즉 상대적 수율을 비교하기 위해 거의 용해성 중합효소가 포획됨을 시사합니다. 이 은 염색 젤에서 볼 수 있듯이 RWSN PB 2 연쇄상구균 또는 RWSN 또는 은 염색 9시간 후 감염 후 9시간 후에 4개의 세포 분획 모두에서 정제할 수 있는 RWSN PB 2 연쇄상구균 감염 후 9시간 후 정제된 VR NPS

v RMP의 가장 높은 농도는 핵 플라스마에서 발견되지만, 상당한 부분도 세포질과 염색질에서 정제할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 감염된 세포의 핵에서 온전한 인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체를 고수율로 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때 깨끗한 완충액을 사용하고 샘플을 불필요하게 실온에 노출시키지 않도록 하는 것이 중요한데, 이렇게 하면 RNA와 단백질 분해를 모두 방지할 수 있을 뿐만 아니라 단백질 복합체 분해를 방지할 수 있기 때문입니다.

그리고 전염성 인플루엔자 바이러스와 함께 일하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 모든 단계는 NP 40이 용해물에 추가될 때까지 생물 안전 레벨 2 작업대에서 수행해야 합니다.