Name: 감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 학습하세요 인플루엔자 바이러스 감염 세포의 염색질에서 바이러스 리보뉴클레오프로틴 컴플렉스(VRNP)를 동질 정제하는 방법을. HeLa 세포 분획화와 친화성 정제를 통해 바이러스 복제 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

저자 rWSN-PB2-Strep 바이러스 나다 Naffakh과 마리 앤 Rameix-Welti (Institut 파스퇴르)을 감사드립니다.

<html> 프로토콜의 개략도 순서도는 그림에 표시됩니다. 1과 시약의 테이블이 아래에 제공됩니다. 1. 감염 (16-24 H) <ol><li> Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) - 높은들은 다음날 (약 5 X 10 8 셀) 약 80 %가 confluency 도달할 것이라는 등의 포도당 중간, 5 150mm 플라스틱 세포 배양 접시에 HELA 세포 밖으로 종자. 그것은 세포가 100 % confluency 도달하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 다음 날에는로 Strep-태그가 인플루엔자 바이러스 주식을 희석 인산 버퍼 식염수 (PBS)가 포함된 0.3 % 소 (BSA) 3 감염의 다수에 대한 혈청 알부민. </li><li> 세포 성장 매체를 제거 PBS로 한번 씻어, 10 ML PBS는 세포에 바이러스를 포함하는 추가합니다. 상온에서 1 H 동안 품어. </li><li> DMEM 높은 포도당으로 감염 매체를 교체, 37에서 부화를 계속 ° C. </li></ol>&quot;&gt; 부화의 길이는 (토론 참조) 공부되는 감염의 단계에 따라 달라집니다. 2. Subcellular 분별화 (3 H) <ol><li> 차가운 PBS로 한 번 세포를 씻어하고 고무 스크레이퍼와 50 ML 원뿔 튜브로 전송 차가운 PBS로 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 1,000 rpm으로 5 분 용 테이블 탑 원심 분리기에서 다음 펠렛 세포는 PBS를 기음. </li><li> 10 ML 차가운 자당 버퍼의 Resuspend 세포 펠렛 (10 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 10 MM KCl, 2 밀리미터 MG 아세트산 (MgOAc), 3 MM CaCl 2, 340 밀리미터 자당, 1 ㎜ dithiothreitol (DTT), 1 % 테아제 억제제 믹스) . 정지 후, 세포 대단히 짧은 시간을 일부러 망치려고 10 ML 플라스틱 혈청의 피펫에 부착된 200 μl 피펫 팁을 통해 세포를 전달합니다. </li><li> 얼음에 10 분 알을 품다. 부드럽게 세포를 resuspend하기 위해 주기적으로 바꾸란. </li><li> 15 초위한 고속으로 0.5 %와 와동의 최종 농도로 Nonidet P-40 (NP-40)를 추가합니다. 즉시 테이블 상단 centrifu에서 4 ° C에서 3,500 XG에 10 분 동안 원심 분리기GE. </li><li> 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 세포질 분획이다. 펠렛은 원래 세포 펠렛보다 작고 하얀이 있어야합니다. 모든 분수는 4 ° C.에 최소 4 H 위해 저장할 수 있습니다 </li><li> 단계 2.5에서와 같이 5 ML 차가운 자당 버퍼, 다시 원심 분리기에 펠릿 씻고 뜨는 버리고. </li><li> 1.5 ML 차가운 nucleoplasmic 추출 완충액 (50 밀리미터 HEPES 산도 7.9, 150 MM KOAc, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 % NP-40, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스)에 펠렛을 (핵 포함) Resuspend. </li><li> 꽉 끼는 유봉과 냉장, 전체가 유리로 4 ML 다운스 호모 지 나이저 편입 및 20 스트로크로 핵 homogenize. 균질화 동안 거품 마십시오. 저항은 약 10 스트로크 후에 증가한다. 효율적인 균질은 위상 대비 현미경으로 확인할 수 있습니다. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 균질 핵 전송과 4에서 회전 바퀴에서 20 분 품어 °C. </li><li> 10 분 4 ° C에서 microcentrifuge에 16,000 X g에서 원심 분리기. </li><li> 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 nucleoplasmic 분수입니다. </li><li> 1.5 ML의 소화 버퍼 (50 밀리미터 HEPES 산도 7.9, 10 MM NaCl, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스, 100 U / ML Benzonase (RNA 분석을위한, 20 U / ML RNase와 대용품에 Resuspend 펠릿 무료 DNase I)) 37에 미리 예열 ° C, 37시 10 분 품어 ° C. </li><li> 5 M NaCl 42 μl를 (150 MM NaCl의 최종 농도)을 추가, 4시 20 분 추가 품어 ° C. </li><li> 10 분 4 ° C에서 microcentrifuge에 16,000 X g에서 원심 분리기. </li><li> 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 ch150 분수입니다. </li><li> Resuspend 펠렛 1.5 ML 추위 높은 소금 버퍼 (50 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 500 MM NaCl, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 % NP-40, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스)와 얼음 속에서 20 분 알을 품다. </li><li> 16,000에서 X G &lt;을 원심 분리기/ em&gt;는 10 분, 4 ° C에서 microcentrifuge 인치 </li><li> 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 ch500 분수입니다. </li></ol> 3. Strep-태그 정화 (2 H) <ol><li> 세포질 분획 (150 MM NaCl의 최종 농도의 경우)에 5 M NaCl 300 μl를 추가합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브 분율 당 포장 Strep-Tactin 세파 로스 비즈의 나누어지는 100 μl. </li><li> 믹스, 그리고 탁상 1,000 X g에서 5 분 원심 분리기하도록 튜브 반전, 구슬로 Strep 세척 버퍼 10 볼륨 (20 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 150 MM NaCl (ch500 샘플 500 MM NaCl), 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 추가 원심 분리기. </li><li> , 뜨는을 삭제하시겠습니까 두번 단계 3.3 반복하고 Strep 세척 버퍼의 동일한 볼륨에 비드 펠렛을 resuspend. </li><li> 각각의 분율 (n​​uceloplasmic위한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브, ch150, 그리고 ch500 분수와 세포질 분획을위한 15 ML 원뿔 튜브)로 형편없는 Strep-Tactin 비드 슬러리 200 μl를 추가합니다. </li><li> 회전4에 튜브 1 시간 ° 회전 바퀴에서 C #. </li><li> 튜브에게 4에 1000 X g에서 1 분 ° C를 원심 분리기 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 각 관 1 ML 추운 Strep 세척 버퍼를 추가합니다. 15 ML 튜브 (세포질 분획)에서 1.5 ML 관에 구슬을 전송합니다. 4 시에 튜브 1 분 ° C 단계 3.7에서와 같이 이후 centrifuging 씻으십시오. 두번 세차 단계를 반복합니다. </li><li> 마지막 세척 단계 후, 플랫 피펫 팁을 사용하여 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 100 μl 용출 버퍼 (Strep 세척 버퍼 2.5 MM desthiobiotin를 포함)을 추가하고 가볍게 섞는다. </li><li> 얼음에 15 분 알을 품다. 부드럽게 튜브의 바닥을 도청하여 가끔 구슬을 섞는다. </li><li> 원심 분리기 튜브 4에 1000 X g에서 1 분 ° C microcentrifuge 인치 뜨는 포함된 eluted Strep-태그를 vRNPs를 수집합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 분별화의 효율성을 최고의 antib을 사용 fractionated lysates의 서양 얼룩 분석에 의해 규정되는subcellular 마커 (그림 2) 특정 오디. 특히, 성공적인 subnuclear 분별화는 nucleoplasmic에서 거의 없거나 전혀없는 세포 RNA 중합 효소 II (폴 II) 또는 용해 핵 분획 4, 대부분의 150 MM NaCl 5 추출해야 표시해야합니다. 폴 II의 저하도 reproducibly 문학 6 일관성 감염되지 않은 세포에 비해 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에서 관찰된다. 그림에서 세포질 eluate 위해 그림과 같이 vRNPs의 정화는 최고, 은색 또는 Coomassie 염색법에 의해 판단된다. 3. 우리의 경험에서, 대부분의 Strep-PB2는 완전하게 구성된 vRNP의 일환으로, 즉 약간 용해 효소 포로가되어로 정화된다. 은색 또는 Coomassie의 염색법으로 관찰 PA/PB1/PB2 비율 : 이것은 높은 NP에 반영됩니다. 여러 유비 쿼터스 RNases (예 : RNase 등) dissoci에 같은 방식으로 분열 바이러스성 RNA로 알려져있다으로 낮은 비율은 RNases와 버퍼 오염을 제안합니다NP multimers 7 효소를 먹었어요. 흥미롭게도, 혼자 Benzonase 치료는 바이러스 RNA를 소화하기에 충분하면서 vRNP 단백질 stochiometric 비율에 아무런 영향을 미치지 않습니다 것처럼 보인다. 우리가이 현상을 설명할 수는 없지만, 우리는 그 Benzonase 제안 기타 RNases (데이터가 표시되지 않음)과 소화 후에 vRNPs의 장애가 특정 구조적으로 중요한 RNA 영역을 그대로두고 있습니다 관찰했다. 세포질과 nucleoplasm (nuclease의 소화하지 않고 수행)에서 vRNPs 정화 후, 고분자 중량 8 희미하지만 이산 밴드는 8 인플루엔자 게놈 분야의 예측 분자 무게에 해당하는 실버 염색법, (심판을 참조하십시오. 3 관찰할 수있다 ). 9 H 포스트 감염에서 각 분획에서 정화 vRNPs의 상대적인 양의 그림에 표시됩니다. 4. vRNPs의 분포는 초기 시간 지점에서 ch150 분수의 강한 축적과 함께, 감염의 과정을 통해 다양하고,늦은 시간 지점에서 nucleoplasm 및 세포질에서 증가 축적. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig1.jpg" alt="그림 1"/> subcellular 분별화의 그림 1. 플로우 차트. 심판에서 적응. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에서 subcellular 분수의 서양 얼룩 분석. 10 9 HELA 세포는 subcellular 분별화 이전 9 H에 대한 인플루엔자 바이러스 스트레인 WSN에 감염되었다. 총 단백질 균등 금액이 각 레인에로드하고 표시된 항체를 사용하여 분석되었다. RNA 중합 효소 II는 (폴 II) C-말단 도메인 (hypophosphorylated 밴드가 가장 두드러진입니다) 모든 형태를 인식 클론 8WG16를 사용하여 감지되었습니다. 심판에서 적응. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3.vRNPs 투석의 실버 얼룩 분석. HELA 세포는 rWSN (마이너스 컨트롤) 또는 세포질 분획에서 Strep 정화 이어 9 H 용 rWSN-PB2-Strep, 감염되었다. 별표는 RNase의 소화 후 보이지 않는 밴드를 나타냅니다. 심판에서 적응. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 다른 세포 분수에서 정화 vRNPs의 실버 얼룩 분석. 10 9 HELA 세포가 9 rWSN-PB2-Strep 또는 rWSN 감염된 H는 subcellular 분별화 및 Strep 정화로 따라갔다. 각 분획에서 eluate의 균등 금액이로드되었습니다. 심판에서 적응. 3.

<ol><li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li>
<li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329(2005).</li>
<li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187(2011).</li>
<li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell%3A+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li>
<li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460(2009).</li>
<li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li>
<li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427(2010).</li>
<li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li>
<li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma%2C+MOPC+315%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889(1974).</li>
<li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30(2010).</li>
<li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618(2011).</li>
<li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879(2010).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

많은 연구가 최근에 각각의 단백질이나 인플루엔자 바이러스 감염 8 개입 셀룰러 네트워크를 확인하고 있지만, 이러한 상호 작용의 대부분의 기능 의미는 불분명 남아 있습니다. 독감 바이러스는 RNA 합성과 핵 9 복잡 biophysical 및 생화 학적 자연을위한 염색질 기반 기능의 절대적인 의존성을 감안할 때, 새로운 기술은 이러한 기능을 명료하게하다하셔야합니다. vRNPs의 친화력 정화와 결합 우리가 여기서 제시 subnuclear 분별화은, 이전에 액세스할 수있었습니다 중요한 바이러스성 RNA 공장의 특성화 수 있습니다. 많은 subcellular 분획화 프로토콜은 이전 문헌에 설명되어있다. 우리는 이러한 전통적인 방법의 대부분은 핵에서 vRNPs의 조기 유출로 이어질 것을 관찰, 현상은 또한 폴 II 10에 대해 설명했다. 낮은 C와 함께 사전에 치명적 전지의 짧은 부화를 사용함으로써약한 세제, NP-40의 onc...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM 높은 포도당 </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> 단백 분해 효소 억제제 믹스 G </td><td> Serva </td><td> 39,101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Novagen </td><td> 71,206 </td><td> 25 U / μl </td></tr><tr><td> DNase 나 RNase 부담 </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U / μl </td></tr><tr><td> 균 질기를 Dounce </td><td> Wheaton의 </td><td> 432-1271 </td><td> &quot;B&quot;유봉을 입력하십시오 </td></tr><tr><td> Strep-Tactin 세파 로스 </td><td> IBA 게엠베하 </td><td> 2-1201-025 </td><td> 50 % 서스펜션 칼럼 형식도 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBA게엠베하 </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

모든 부정적인 - 가닥 RNA 바이러스와 마찬가지로 인플루엔자 바이러스의 게놈은 단일 좌초된 게놈은 핵 단백질 (NP)에 의해 encapsidated, 그리고 구성된 trimeric 효소 복합과 연관된되는 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNP)의 형태로 패키지되어 PA, PB1, 그리고 PB2 subunits의. 그러나 대부분의 RNA 바이러스와는 달리, 인플루엔자 바이러스는 감염된 세포의 핵에 바이러스 RNA 합성을 수행합니다. 흥미롭게도, 바이러스성 mRNA 합성이 primers로 세포 사전 mRNAs를 사용하고,이 과정은 염색질 1 이루어지는 것이 제안되었습니다. 바이러스 중합 효소와 RNA 중합 효소 II 호스트뿐만 아니라, NP 및 호스트 nucleosomes 간의 상호 작용은 또한 1,2를 묘사하고있다. 최근 원 - Strep-태그를 인코딩 재조합 독감 바이러스의 세대 유전자가 바이러스 중합 효소의 PB2 subunit의 C-말단 (rWSN-PB2-Strep 3)로했습니다 융합실내는 설명했다. 이러한 재조합 바이러스가 감염된 세포에서 vRNPs 포함한 PB2 함유 단지,의 정화를 허용합니다. vRNPs 투석을 받기 위해서는, 세포 배양은 감염 및 vRNPs이 세포에서 파생된 lysates에서 정화 친화력 있습니다. 그러나 탁아소를 운영하는 용해 절차는 일반 nuclease의 존재에도 불​​구하고, 주로 inefficiently 염색질 바인딩된 자료를 추출 한 단계 세제 용해에 기반하고있다. 우리의 예비 작업은 핵 vRNPs의 많은 부분은 전통적인 세포 용해 동안 추출되지 않은 것을 제안, 따라서 친화력 정화 될 수 없었습니다. 이 추출 효율을 향상시키기 위해, 비 염색질 바인딩된 핵 vRNPs에서 염색질 표지인 분리, 우리는 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포 단계 현명한 subcellular 추출 프로토콜을 적응. 간단히,이 절차는 먼저 세포에서 핵을 분리하고 용해 핵 단백질 (여기서 &quot;nucleoplasmic&quot;분수 되나) 추출합니다.남은 불용성 핵 자료는 다음 Benzonase, 두 소금 추출 단계 뒤에 unspecific의 DNA / RNA nuclease로 소화된다 : 먼저 150 MM NaCl (이하 &quot;ch150 &#39;되나)를 사용하여 다음 500 MM NaCl (&quot;ch500 &quot;) (그림 1 ). 이러한 소금 추출 단계 500 밀리미터 NaCl 아직 여전히 친화 행렬에 태그를 vRNPs의 바인딩을 허용 핵 vRNPs의 85 % 이상 solubilize하기에 충분하다고 우리의 관찰을 바탕으로 선정되었습니다. 감염된 세포의 subcellular 분별화 후, 그것은 각각의 분획의 친화력 정화 PB2-태그를 vRNPs하는 것이 가능하고 단백질과 각각 서양 얼룩 및 프라이머 확장자를 사용하여 RNA 구성 요소를 분석합니다. 최근, 우리는 500 MM NaCl (ch500) 3 추출한 염색질 분획에서 감염 후 늦은 점 중 그 vRNP 수출 단지 양식을 발견하는이 방법을 활용.

인플루엔자 바이러스는 호스트 세포 염색질과 협회들의 RNA 게놈을 복제. 여기서는 감염된 세포의 염색질에서 그대로 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스를 정화하는 방법을 제시한다. 바이러스 단지 투석을하는 것은 각각 서양 얼룩 및 단백질과 RNA 내용의 프라이머 확장명을 모두에 의해 분석할 수 있습니다.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

모든 음성 가닥 RNA 바이러스와 마찬가지로, 인플루엔자 바이러스의 게놈은 바이러스 리보핵단백질 복합체(vRNP) 형태로 패키징되며, 여기서 ...

Lyco 음성 가닥, RNA 바이러스. 인플루엔자 바이러스의 게놈은 바이러스 리보핵산단백질 복합체(VR nps) 형태로 패키징되며, 여기서 단일 가닥 게놈은 핵단백질에 의해 캡슐화되고 PA, PB1 및 PB2 서브유닛으로 구성된 폴리머라제 복합체와 결합합니다. 감염된 포유류 세포로부터 온전한 복합체를 정제하기 위해, HeLa 세포를 재조합 strept-tagged 인플루엔자 바이러스와 함께 배양합니다.바이러스가 세포 내로 진입하면 감염 후 핵에서 바이러스 RNA가 합성됩니다. 이후 세포를 계면활성제를 사용하여 용해시킨 다음, 원심분리와 염분 기반의 크로마틴 분획 프로토콜을 통해 세포질, 핵 및 크로마틴 분획으로 분리합니다. 마지막으로, 각 분획에서 strept-tag가 붙은 VRP를 친화성 정제합니다. 정제된 vRNP의 단백질 및 RNA 조성을 은 염색법으로 분석한 결과, 본 프로토콜을 통해 크로마틴에 강하게 결합된 VRP조차 손상 없이 분리할 수 있음을 확인하였습니다. 따라서 인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체를 친화성 정제하는 표준 방법과 비교했을 때 본 프로토콜의 주요 장점 중 하나는, 인플루엔자 바이러스 mRNA 합성이 일어나는 곳으로 알려진 감염 세포의 크로마틴으로부터 vRNP를 정제할 수 있다는 점입니다.따라서 본 방법은 바이러스 복제 및 전사 조절과 관련된 질문들에 답하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 어떤 바이러스 또는 세포 인자가, 그리고 어떤 번역 후 수식(post-translational modifications)이 바이러스 mRNA 합성이나 바이러스 게놈 RNA 합성에 필요한지 등을 확인하는 데 활용될 수 있습니다. 다만, 핵 내 분획(sub nuclear fractionation)은 생화학적 조건에 매우 민감하며 세포주마다 크게 다를 수 있으므로, 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 프로토콜은 감염 다중도(multiplicity of infection) 3으로 PB2 서브유닛의 C-말단에 strep tag가 유전적으로 융합된 인플루엔자 바이러스 RWSN PB2-strep을 감염시킨 세포를 사용하여 시작합니다.차가운 PBS로 세포를 한 번 세척한 다음, 차가운 PBS 12 milliliters를 첨가하고 고무 스크래퍼를 사용하여 디쉬에서 세포를 제거합니다. 세포를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮긴 후 원심분리를 통해

affinity-purification-influenza-virus-ribonucleoprotein-complexes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인플루엔자 바이러스의 게놈은 RNA와 단백질 여덟 별도 단지, 칭했다 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNPs)로 구성되어 있습니다. 본 논문은 글리세롤 기울기 정화 및 독감 vRNPs의 전송 전자 현미경의 시각화에 대해 설명합니다.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 그것은 한 손으로 그리고 다른 한편으로는 태그를 단백질과 두 번째 레이블이 붙은 단백질 (예 : poliovirus) 간의 친화력에 자석 구슬 및 태그 단백질 (예 : nanobodies) 사이의 상호 작용을 기반으로 안정적인 기술입니다.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

Source: Lopez Jr., M. A., et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the purification of polyhistidine-tagged viral integrase using nickel affinity chromatography. The protocol uses imidazole gradient elution to selectively isolate the integrase based on its affinity for nickel-charged resin.

친화성 크로마토그래피를 이용한 바이러스 인테그레이스의 정제

출처: Gao, Y., et al. 호흡기 세포융합 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드 생성 및 조립. J. Vis. Exp. (2021)본 영상에서는 정제된 RNA-free 뉴클레오단백질-인단백질 복합체로부터 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드를 시험관 내(in vitro)에서 조립하는 방법과 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 정제 과정, 그리고 조립된 입자 내의 전체 길이 바이러스 RNA 검증 과정을 보여줍니다.

바이러스 뉴클레오캡시드 유사 입자의 인비트로(In Vitro) 재구성 및 정제

이 프로토콜은 human INO80 염색질 리모델링 복합체의 야생형 및 돌연변이 버전을 생성하고 정제하는 절차를 설명합니다. INO80 subunit의 에피토프 태그 버전은 HEK293 세포에서 안정적으로 발현되며, 특정 subunit 세트가 없는 완전 복합체 및 복합체는 면역친화성 크로마토그래피로 정제됩니다.

세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화

이 공동 면역침전 프로토콜을 통해 인간 세포에서 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질과 항바이러스 Mx1 단백질 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Mx1 및 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질의 성공적인 동시 면역침전을 위한 N-에틸말레이미드의 중요성을 강조합니다.

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

우리는 아데노바이러스(Ad)에 감염된 인간 세포에서 바이러스 복제 구획(RC)을 분리하는 새로운 전략을 제공합니다. 이 접근법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 조절하는 분자 메커니즘과 RC에서 확립된 바이러스-숙주 상호 작용의 조절을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 무세포 시스템을 나타냅니다.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

바이러스가 숙주 세포에 들어가는 동안 인플루엔자 A 바이러스 코어를 분해하는 것은 다단계 과정입니다. 우리는 바이러스 비코팅의 초기 단계를 분석하기 위한 시험관 내 방법을 설명합니다. 이 접근 방식에서는 속도 구배 원심분리를 사용하여 정의된 조건에서 코팅 해제를 시작하는 단계를 생화학적으로 해부합니다.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

이 원고는 특정 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 통해 진핵 세포에서 형성된 동족 RNP를 선별하는 방법을 설명합니다. DHX9/RNA 헬리카제 A로 구성된 레트로바이러스 5' 미번역 영역에 결합된 동족 RNP를 분리하여 이 접근법의 적용 가능성을 입증합니다.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

학습하세요 인플루엔자 바이러스 감염 세포의 염색질에서 바이러스 리보뉴클레오프로틴 컴플렉스(VRNP)를 동질 정제하는 방법을. HeLa 세포 분획화와 친화성 정제를 통해 바이러스 복제 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

더 많은 동영상 탐색