Name: 감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 학습하세요 인플루엔자 바이러스 감염 세포의 염색질에서 바이러스 리보뉴클레오프로틴 컴플렉스(VRNP)를 동질 정제하는 방법을. HeLa 세포 분획화와 친화성 정제를 통해 바이러스 복제 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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저자 rWSN-PB2-Strep 바이러스 나다 Naffakh과 마리 앤 Rameix-Welti (Institut 파스퇴르)을 감사드립니다.

<html> 프로토콜의 개략도 순서도는 그림에 표시됩니다. 1과 시약의 테이블이 아래에 제공됩니다. 1. 감염 (16-24 H) <ol><li> Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) - 높은들은 다음날 (약 5 X 10 8 셀) 약 80 %가 confluency 도달할 것이라는 등의 포도당 중간, 5 150mm 플라스틱 세포 배양 접시에 HELA 세포 밖으로 종자. 그것은 세포가 100 % confluency 도달하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 다음 날에는로 Strep-태그가 인플루엔자 바이러스 주식을 희석 인산 버퍼 식염수 (PBS)가 포함된 0.3 % 소 (BSA) 3 감염의 다수에 대한 혈청 알부민. </li><li> 세포 성장 매체를 제거 PBS로 한번 씻어, 10 ML PBS는 세포에 바이러스를 포함하는 추가합니다. 상온에서 1 H 동안 품어. </li><li> DMEM 높은 포도당으로 감염 매체를 교체, 37에서 부화를 계속 ° C. </li></ol>&quot;&gt; 부화의 길이는 (토론 참조) 공부되는 감염의 단계에 따라 달라집니다. 2. Subcellular 분별화 (3 H) <ol><li> 차가운 PBS로 한 번 세포를 씻어하고 고무 스크레이퍼와 50 ML 원뿔 튜브로 전송 차가운 PBS로 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 1,000 rpm으로 5 분 용 테이블 탑 원심 분리기에서 다음 펠렛 세포는 PBS를 기음. </li><li> 10 ML 차가운 자당 버퍼의 Resuspend 세포 펠렛 (10 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 10 MM KCl, 2 밀리미터 MG 아세트산 (MgOAc), 3 MM CaCl 2, 340 밀리미터 자당, 1 ㎜ dithiothreitol (DTT), 1 % 테아제 억제제 믹스) . 정지 후, 세포 대단히 짧은 시간을 일부러 망치려고 10 ML 플라스틱 혈청의 피펫에 부착된 200 μl 피펫 팁을 통해 세포를 전달합니다. </li><li> 얼음에 10 분 알을 품다. 부드럽게 세포를 resuspend하기 위해 주기적으로 바꾸란. </li><li> 15 초위한 고속으로 0.5 %와 와동의 최종 농도로 Nonidet P-40 (NP-40)를 추가합니다. 즉시 테이블 상단 centrifu에서 4 ° C에서 3,500 XG에 10 분 동안 원심 분리기GE. </li><li> 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 세포질 분획이다. 펠렛은 원래 세포 펠렛보다 작고 하얀이 있어야합니다. 모든 분수는 4 ° C.에 최소 4 H 위해 저장할 수 있습니다 </li><li> 단계 2.5에서와 같이 5 ML 차가운 자당 버퍼, 다시 원심 분리기에 펠릿 씻고 뜨는 버리고. </li><li> 1.5 ML 차가운 nucleoplasmic 추출 완충액 (50 밀리미터 HEPES 산도 7.9, 150 MM KOAc, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 % NP-40, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스)에 펠렛을 (핵 포함) Resuspend. </li><li> 꽉 끼는 유봉과 냉장, 전체가 유리로 4 ML 다운스 호모 지 나이저 편입 및 20 스트로크로 핵 homogenize. 균질화 동안 거품 마십시오. 저항은 약 10 스트로크 후에 증가한다. 효율적인 균질은 위상 대비 현미경으로 확인할 수 있습니다. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 균질 핵 전송과 4에서 회전 바퀴에서 20 분 품어 °C. </li><li> 10 분 4 ° C에서 microcentrifuge에 16,000 X g에서 원심 분리기. </li><li> 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 nucleoplasmic 분수입니다. </li><li> 1.5 ML의 소화 버퍼 (50 밀리미터 HEPES 산도 7.9, 10 MM NaCl, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스, 100 U / ML Benzonase (RNA 분석을위한, 20 U / ML RNase와 대용품에 Resuspend 펠릿 무료 DNase I)) 37에 미리 예열 ° C, 37시 10 분 품어 ° C. </li><li> 5 M NaCl 42 μl를 (150 MM NaCl의 최종 농도)을 추가, 4시 20 분 추가 품어 ° C. </li><li> 10 분 4 ° C에서 microcentrifuge에 16,000 X g에서 원심 분리기. </li><li> 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 ch150 분수입니다. </li><li> Resuspend 펠렛 1.5 ML 추위 높은 소금 버퍼 (50 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 500 MM NaCl, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 % NP-40, 1 밀리미터 DTT, 1 % 프로 테아제 억제제 믹스)와 얼음 속에서 20 분 알을 품다. </li><li> 16,000에서 X G &lt;을 원심 분리기/ em&gt;는 10 분, 4 ° C에서 microcentrifuge 인치 </li><li> 4에서 뜨는 및 저장소를 제거 ° C. 이것은 ch500 분수입니다. </li></ol> 3. Strep-태그 정화 (2 H) <ol><li> 세포질 분획 (150 MM NaCl의 최종 농도의 경우)에 5 M NaCl 300 μl를 추가합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브 분율 당 포장 Strep-Tactin 세파 로스 비즈의 나누어지는 100 μl. </li><li> 믹스, 그리고 탁상 1,000 X g에서 5 분 원심 분리기하도록 튜브 반전, 구슬로 Strep 세척 버퍼 10 볼륨 (20 밀리미터 HEPES의 산도 7.9, 150 MM NaCl (ch500 샘플 500 MM NaCl), 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 추가 원심 분리기. </li><li> , 뜨는을 삭제하시겠습니까 두번 단계 3.3 반복하고 Strep 세척 버퍼의 동일한 볼륨에 비드 펠렛을 resuspend. </li><li> 각각의 분율 (n​​uceloplasmic위한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브, ch150, 그리고 ch500 분수와 세포질 분획을위한 15 ML 원뿔 튜브)로 형편없는 Strep-Tactin 비드 슬러리 200 μl를 추가합니다. </li><li> 회전4에 튜브 1 시간 ° 회전 바퀴에서 C #. </li><li> 튜브에게 4에 1000 X g에서 1 분 ° C를 원심 분리기 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 각 관 1 ML 추운 Strep 세척 버퍼를 추가합니다. 15 ML 튜브 (세포질 분획)에서 1.5 ML 관에 구슬을 전송합니다. 4 시에 튜브 1 분 ° C 단계 3.7에서와 같이 이후 centrifuging 씻으십시오. 두번 세차 단계를 반복합니다. </li><li> 마지막 세척 단계 후, 플랫 피펫 팁을 사용하여 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 100 μl 용출 버퍼 (Strep 세척 버퍼 2.5 MM desthiobiotin를 포함)을 추가하고 가볍게 섞는다. </li><li> 얼음에 15 분 알을 품다. 부드럽게 튜브의 바닥을 도청하여 가끔 구슬을 섞는다. </li><li> 원심 분리기 튜브 4에 1000 X g에서 1 분 ° C microcentrifuge 인치 뜨는 포함된 eluted Strep-태그를 vRNPs를 수집합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 분별화의 효율성을 최고의 antib을 사용 fractionated lysates의 서양 얼룩 분석에 의해 규정되는subcellular 마커 (그림 2) 특정 오디. 특히, 성공적인 subnuclear 분별화는 nucleoplasmic에서 거의 없거나 전혀없는 세포 RNA 중합 효소 II (폴 II) 또는 용해 핵 분획 4, 대부분의 150 MM NaCl 5 추출해야 표시해야합니다. 폴 II의 저하도 reproducibly 문학 6 일관성 감염되지 않은 세포에 비해 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에서 관찰된다. 그림에서 세포질 eluate 위해 그림과 같이 vRNPs의 정화는 최고, 은색 또는 Coomassie 염색법에 의해 판단된다. 3. 우리의 경험에서, 대부분의 Strep-PB2는 완전하게 구성된 vRNP의 일환으로, 즉 약간 용해 효소 포로가되어로 정화된다. 은색 또는 Coomassie의 염색법으로 관찰 PA/PB1/PB2 비율 : 이것은 높은 NP에 반영됩니다. 여러 유비 쿼터스 RNases (예 : RNase 등) dissoci에 같은 방식으로 분열 바이러스성 RNA로 알려져있다으로 낮은 비율은 RNases와 버퍼 오염을 제안합니다NP multimers 7 효소를 먹었어요. 흥미롭게도, 혼자 Benzonase 치료는 바이러스 RNA를 소화하기에 충분하면서 vRNP 단백질 stochiometric 비율에 아무런 영향을 미치지 않습니다 것처럼 보인다. 우리가이 현상을 설명할 수는 없지만, 우리는 그 Benzonase 제안 기타 RNases (데이터가 표시되지 않음)과 소화 후에 vRNPs의 장애가 특정 구조적으로 중요한 RNA 영역을 그대로두고 있습니다 관찰했다. 세포질과 nucleoplasm (nuclease의 소화하지 않고 수행)에서 vRNPs 정화 후, 고분자 중량 8 희미하지만 이산 밴드는 8 인플루엔자 게놈 분야의 예측 분자 무게에 해당하는 실버 염색법, (심판을 참조하십시오. 3 관찰할 수있다 ). 9 H 포스트 감염에서 각 분획에서 정화 vRNPs의 상대적인 양의 그림에 표시됩니다. 4. vRNPs의 분포는 초기 시간 지점에서 ch150 분수의 강한 축적과 함께, 감염의 과정을 통해 다양하고,늦은 시간 지점에서 nucleoplasm 및 세포질에서 증가 축적. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig1.jpg" alt="그림 1"/> subcellular 분별화의 그림 1. 플로우 차트. 심판에서 적응. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에서 subcellular 분수의 서양 얼룩 분석. 10 9 HELA 세포는 subcellular 분별화 이전 9 H에 대한 인플루엔자 바이러스 스트레인 WSN에 감염되었다. 총 단백질 균등 금액이 각 레인에로드하고 표시된 항체를 사용하여 분석되었다. RNA 중합 효소 II는 (폴 II) C-말단 도메인 (hypophosphorylated 밴드가 가장 두드러진입니다) 모든 형태를 인식 클론 8WG16를 사용하여 감지되었습니다. 심판에서 적응. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3.vRNPs 투석의 실버 얼룩 분석. HELA 세포는 rWSN (마이너스 컨트롤) 또는 세포질 분획에서 Strep 정화 이어 9 H 용 rWSN-PB2-Strep, 감염되었다. 별표는 RNase의 소화 후 보이지 않는 밴드를 나타냅니다. 심판에서 적응. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 다른 세포 분수에서 정화 vRNPs의 실버 얼룩 분석. 10 9 HELA 세포가 9 rWSN-PB2-Strep 또는 rWSN 감염된 H는 subcellular 분별화 및 Strep 정화로 따라갔다. 각 분획에서 eluate의 균등 금액이로드되었습니다. 심판에서 적응. 3.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

많은 연구가 최근에 각각의 단백질이나 인플루엔자 바이러스 감염 8 개입 셀룰러 네트워크를 확인하고 있지만, 이러한 상호 작용의 대부분의 기능 의미는 불분명 남아 있습니다. 독감 바이러스는 RNA 합성과 핵 9 복잡 biophysical 및 생화 학적 자연을위한 염색질 기반 기능의 절대적인 의존성을 감안할 때, 새로운 기술은 이러한 기능을 명료하게하다하셔야합니다. vRNPs의 친화력 정화와 결합 우리가 여기서 제시 subnuclear 분별화은, 이전에 액세스할 수있었습니다 중요한 바이러스성 RNA 공장의 특성화 수 있습니다. 많은 subcellular 분획화 프로토콜은 이전 문헌에 설명되어있다. 우리는 이러한 전통적인 방법의 대부분은 핵에서 vRNPs의 조기 유출로 이어질 것을 관찰, 현상은 또한 폴 II 10에 대해 설명했다. 낮은 C와 함께 사전에 치명적 전지의 짧은 부화를 사용함으로써약한 세제, NP-40의 onc...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM 높은 포도당 </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> 단백 분해 효소 억제제 믹스 G </td><td> Serva </td><td> 39,101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Novagen </td><td> 71,206 </td><td> 25 U / μl </td></tr><tr><td> DNase 나 RNase 부담 </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U / μl </td></tr><tr><td> 균 질기를 Dounce </td><td> Wheaton의 </td><td> 432-1271 </td><td> &quot;B&quot;유봉을 입력하십시오 </td></tr><tr><td> Strep-Tactin 세파 로스 </td><td> IBA 게엠베하 </td><td> 2-1201-025 </td><td> 50 % 서스펜션 칼럼 형식도 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBA게엠베하 </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

모든 부정적인 - 가닥 RNA 바이러스와 마찬가지로 인플루엔자 바이러스의 게놈은 단일 좌초된 게놈은 핵 단백질 (NP)에 의해 encapsidated, 그리고 구성된 trimeric 효소 복합과 연관된되는 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNP)의 형태로 패키지되어 PA, PB1, 그리고 PB2 subunits의. 그러나 대부분의 RNA 바이러스와는 달리, 인플루엔자 바이러스는 감염된 세포의 핵에 바이러스 RNA 합성을 수행합니다. 흥미롭게도, 바이러스성 mRNA 합성이 primers로 세포 사전 mRNAs를 사용하고,이 과정은 염색질 1 이루어지는 것이 제안되었습니다. 바이러스 중합 효소와 RNA 중합 효소 II 호스트뿐만 아니라, NP 및 호스트 nucleosomes 간의 상호 작용은 또한 1,2를 묘사하고있다. 최근 원 - Strep-태그를 인코딩 재조합 독감 바이러스의 세대 유전자가 바이러스 중합 효소의 PB2 subunit의 C-말단 (rWSN-PB2-Strep 3)로했습니다 융합실내는 설명했다. 이러한 재조합 바이러스가 감염된 세포에서 vRNPs 포함한 PB2 함유 단지,의 정화를 허용합니다. vRNPs 투석을 받기 위해서는, 세포 배양은 감염 및 vRNPs이 세포에서 파생된 lysates에서 정화 친화력 있습니다. 그러나 탁아소를 운영하는 용해 절차는 일반 nuclease의 존재에도 불​​구하고, 주로 inefficiently 염색질 바인딩된 자료를 추출 한 단계 세제 용해에 기반하고있다. 우리의 예비 작업은 핵 vRNPs의 많은 부분은 전통적인 세포 용해 동안 추출되지 않은 것을 제안, 따라서 친화력 정화 될 수 없었습니다. 이 추출 효율을 향상시키기 위해, 비 염색질 바인딩된 핵 vRNPs에서 염색질 표지인 분리, 우리는 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포 단계 현명한 subcellular 추출 프로토콜을 적응. 간단히,이 절차는 먼저 세포에서 핵을 분리하고 용해 핵 단백질 (여기서 &quot;nucleoplasmic&quot;분수 되나) 추출합니다.남은 불용성 핵 자료는 다음 Benzonase, 두 소금 추출 단계 뒤에 unspecific의 DNA / RNA nuclease로 소화된다 : 먼저 150 MM NaCl (이하 &quot;ch150 &#39;되나)를 사용하여 다음 500 MM NaCl (&quot;ch500 &quot;) (그림 1 ). 이러한 소금 추출 단계 500 밀리미터 NaCl 아직 여전히 친화 행렬에 태그를 vRNPs의 바인딩을 허용 핵 vRNPs의 85 % 이상 solubilize하기에 충분하다고 우리의 관찰을 바탕으로 선정되었습니다. 감염된 세포의 subcellular 분별화 후, 그것은 각각의 분획의 친화력 정화 PB2-태그를 vRNPs하는 것이 가능하고 단백질과 각각 서양 얼룩 및 프라이머 확장자를 사용하여 RNA 구성 요소를 분석합니다. 최근, 우리는 500 MM NaCl (ch500) 3 추출한 염색질 분획에서 감염 후 늦은 점 중 그 vRNP 수출 단지 양식을 발견하는이 방법을 활용.

인플루엔자 바이러스는 호스트 세포 염색질과 협회들의 RNA 게놈을 복제. 여기서는 감염된 세포의 염색질에서 그대로 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스를 정화하는 방법을 제시한다. 바이러스 단지 투석을하는 것은 각각 서양 얼룩 및 단백질과 RNA 내용의 프라이머 확장명을 모두에 의해 분석할 수 있습니다.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

모든 음성 가닥 RNA 바이러스와 마찬가지로, 인플루엔자 바이러스의 게놈은 바이러스 리보핵단백질 복합체(vRNP) 형태로 패키징되며, 여기서 ...

Lyco 음성 가닥, RNA 바이러스. 인플루엔자 바이러스의 게놈은 바이러스 리보핵산단백질 복합체(VR nps) 형태로 패키징되며, 여기서 단일 가닥 게놈은 핵단백질에 의해 캡슐화되고 PA, PB1 및 PB2 서브유닛으로 구성된 폴리머라제 복합체와 결합합니다. 감염된 포유류 세포로부터 온전한 복합체를 정제하기 위해, HeLa 세포를 재조합 strept-tagged 인플루엔자 바이러스와 함께 배양합니다.바이러스가 세포 내로 진입하면 감염 후 핵에서 바이러스 RNA가 합성됩니다. 이후 세포를 계면활성제를 사용하여 용해시킨 다음, 원심분리와 염분 기반의 크로마틴 분획 프로토콜을 통해 세포질, 핵 및 크로마틴 분획으로 분리합니다. 마지막으로, 각 분획에서 strept-tag가 붙은 VRP를 친화성 정제합니다. 정제된 vRNP의 단백질 및 RNA 조성을 은 염색법으로 분석한 결과, 본 프로토콜을 통해 크로마틴에 강하게 결합된 VRP조차 손상 없이 분리할 수 있음을 확인하였습니다. 따라서 인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체를 친화성 정제하는 표준 방법과 비교했을 때 본 프로토콜의 주요 장점 중 하나는, 인플루엔자 바이러스 mRNA 합성이 일어나는 곳으로 알려진 감염 세포의 크로마틴으로부터 vRNP를 정제할 수 있다는 점입니다.따라서 본 방법은 바이러스 복제 및 전사 조절과 관련된 질문들에 답하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 어떤 바이러스 또는 세포 인자가, 그리고 어떤 번역 후 수식(post-translational modifications)이 바이러스 mRNA 합성이나 바이러스 게놈 RNA 합성에 필요한지 등을 확인하는 데 활용될 수 있습니다. 다만, 핵 내 분획(sub nuclear fractionation)은 생화학적 조건에 매우 민감하며 세포주마다 크게 다를 수 있으므로, 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 프로토콜은 감염 다중도(multiplicity of infection) 3으로 PB2 서브유닛의 C-말단에 strep tag가 유전적으로 융합된 인플루엔자 바이러스 RWSN PB2-strep을 감염시킨 세포를 사용하여 시작합니다.차가운 PBS로 세포를 한 번 세척한 다음, 차가운 PBS 12 milliliters를 첨가하고 고무 스크래퍼를 사용하여 디쉬에서 세포를 제거합니다. 세포를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮긴 후 원심분리를 통해 펠렛화합니다.이 절차에서 가장 어려운 부분은 세포 분획 프로토콜입니다. 세포 핵은 균질화 및 혼합 과정에 매우 민감하며, 이를 잘못 수행할 경우 크로마틴 추출물이 쉽게 손상될 수 있습니다. 따라서 여기서 보여드리는 균질화 기술뿐만 아니라, 용해물의 전반적인 취급 주의사항을 준수하는 것이 매우 중요합니다.원심분리 후 상층액과 재현탁액(Resus)을 제거한 다음, 세포 펠렛을 10 milliliters의 차가운 자당 완충액(sucrose buffer)에 현탁합니다. 10 milliliter 플라스틱 혈청 피펫 끝에 200 microliter 피펫 팁을 부착하고, 세포를 통과시켜 세포 덩어리를 풀어줍니다. 현탁액을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.세포를 주기적으로 부드럽게 반전시켜 재부유시킵니다. 다음으로, non IET P 40을 최종 농도 0.5%가 되도록 첨가하고 고속으로 15초간 볼텍싱한 후, 즉시 탁상 원심분리기를 사용하여 4°C에서 3,500 ×g로 10분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하여 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.상층액을 4 °C에서 보관하십시오. 이것은 세포질 분획입니다. 펠렛은 여기에서 보는 바와 같이 원래의 세포 펠렛보다 크기가 더 작고 색이 더 하얗게 나타나야 합니다.프로토콜을 나중에 완료할 예정이라면, 세포 펠렛을 4 °C에서 보관하십시오. 그렇지 않은 경우, 5 mL의 차가운 sucrose 완충액으로 펠렛을 세척하고 이전과 동일하게 원심분리하여 계속 진행하십시오. 원심분리가 완료되면 상층액을 버리고, 핵이 포함된 펠렛을 1.5 mL의 차가운 핵질 추출 완충액에 재현탁하십시오.재현탁된 펠렛을 페스틀이 밀착된 냉각된 4 mL 전유리 덴스키(Dounce) 균질기로 옮기고, 20회 스트로크하여 핵을 균질화합니다. 거품이 발생하지 않도록 주의하며, 약 10회 스트로크 후에는 저항이 증가해야 합니다. 효율적인 균질화 여부를 확인하기 위해 위상차 현미경으로 샘플을 관찰합니다.핵은 더 이상 둥근 모양이 아니어야 하며, 불규칙한 형태를 띠고 마치 터진 것처럼 보여야 합니다. 핵이 균질화되면, 이를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리관으로 옮기십시오. 균질액을 회전 휠에서 4 °C로 20분 동안 배양하십시오.그 다음 마이크로 원심분리기를 사용하여 4°C에서 10분 동안 16,000 ×g로 원심분리합니다. 원심분리 후 핵질 분획인 상층액을 1.5 mL 튜브로 옮겨 4°C에서 보관합니다. 그런 다음 37°C로 예열한 소화 버퍼 1.5 mL에 펠렛을 다시 현탁합니다.그 후 해당 분획을 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 5 M sodium chloride 42 µL를 첨가하여 sodium chloride의 최종 농도를 150 mM로 맞춘 후 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 4 °C의 마이크로 원심분리기에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 상층액을 제거하여 4 °C에서 보관하십시오. 이것이 CH one 50 분획입니다. 펠릿을 1.5 mL의 차가운 고염 버퍼(high salt buffer)로 재현탁하고 얼음 위에서 20분 동안 배양하십시오.4°C의 마이크로 원심분리기에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하여 4°C에 보관합니다. 이것이 CH 500 분획입니다.분획 프로토콜 동안 저장해 둔 분획물들을 꺼내 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 세포질 분획물에 5 M sodium chloride 300 µL를 첨가합니다. 이어서 분획당 100 µL의 packed strep T in Sphero beads를 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.beads에 strep wash buffer를 10배 부피로 첨가합니다. 튜브를 뒤집어 혼합한 후, 탁상용 원심분리기에서 1000 ×g로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다.버퍼 세척을 2회 반복한 다음, 펠릿을 동일한 부피의 strep wash buffer로 재현탁하고, 각 분획에 세척된 strep Act in bead slurry 200 µL를 추가합니다. 튜브를 4 °C에서 1시간 동안 회전시킵니다. 그 후 튜브를 4 °C에서 1000 ×g로 1분 동안 원심분리하고 상청액을 제거합니다.그다음 15 mL 튜브에서 세포질 분획과 함께 배양한 비드에 세척 완충액 1 mL를 추가합니다. 세척 완충액을 넣고 비드를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 비드를 1분 동안 세척한 다음, 4 °C에서 1000 ×g로 1분 동안 튜브를 원심분리합니다.마지막 세척 단계 후 이 과정을 두 번 반복하십시오. 평평한 피펫 팁을 사용하여 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거합니다. 그 다음 100 microliters의 용출 버퍼를 넣고 부드럽게 혼합한 뒤, 튜브를 얼음에 15분 동안 보관하십시오.배양하는 동안 튜브 바닥을 가볍게 두드려 비즈를 가끔씩 섞어줍니다. 15분이 지나면 4 °C에서 1000 ×g로 1분 동안 원심분리합니다. 용출된 strep-tagged VRP가 포함된 상층액을 수집합니다.세포를 인플루엔자 바이러스 WSN 균주로 9시간 동안 감염시킨 후, 분획된 용해물을 여기에서 보는 바와 같이 웨스턴 블로팅으로 분석하였습니다. 완만한 핵 분리법은 다량의 핵 단백질 방출을 방지하면서 튜불린과 같은 세포질 단백질을 효율적으로 추출합니다. 저염 상태에서 추출된 염색질 분획에는 전사에 중요한 단백질들이 농축되어 있음에 유의하십시오.고염 분획에는 주로 뉴클레오솜이 포함되어 있으므로, 태그가 없는 바이러스, RWSN 또는 RWSN PB two strep로 9시간 동안 감염시킨 R 세포에서 용출된 세포질 분획의 단백질 조성을 결정하기 위해 v NPS를 은 염색으로 분석하였으며, 이는 세포질 용출액에 대해 나타낸 바와 같습니다. 여기서 95에서 100 kilodaltons 사이의 밴드와 비교하여 55 kilodaltons 이상의 주요 밴드에서 나타나듯이 NP 대 PA PB one, PB two의 비율이 높으며, 이는 대부분의 strep PB two가 완전히 형성된 VRNP의 일부로 정제되었음을 시사합니다. 즉, 상대적 수율을 비교했을 때 가용성 폴리머라아제는 거의 포착되지 않았습니다. RWSN PB two strep 또는 RWSN으로 9시간 동안 감염시킨 후 정제된 VR NPS를 은 염색한 결과가 이 은 염색 겔에 나타나 있으며, 감염 9시간 후 4가지 세포 분획 모두에서 v RMPs를 정제할 수 있습니다.v RMP의 최고 농도는 핵질에서 발견되지만, 상당 부분은 세포질과 염색질에서도 정제할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 감염된 세포의 핵에서 손상되지 않은 인플루엔자 바이러스 리보핵단백질 복합체를 고수율로 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 깨끗한 완충액을 사용하고 샘플이 불필요하게 실온에 노출되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이를 통해 RNA와 단백질의 분해는 물론 단백질 복합체의 해체를 방지할 수 있습니다.또한 감염성 인플루엔자 바이러스를 다루는 것은 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 용해물에 NP 40를 첨가하기 전까지 모든 단계는 생물안전등급 2(biosafety level two) 작업대에서 수행해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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