Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

이 절차의 목적은 heca 형성에 기반한 두 가지 방법을 사용하여, 임의의 세포주에서 제한 인자가 C형 간염 바이러스 복제 주기 완결에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 첫 번째 방법은 인간 간 세포와 heal A 및 Hep 56 1D 패키징 세포를 배양하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 전기 천공법을 통해 C형 간염 바이러스 또는 HCV RNA를 간 세포에 형질 도입합니다. 그 후, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 HCV 복제 세포주를 각각의 패키징 세포주와 융합시킵니다. 두 번째 융합 방법의 첫 번째 단계는 고역가의 HCV 스톡을 생산하는 것입니다.

이후 서로 다른 세포주를 공동 배양하고, prototype foamy virus 당단백질을 형질전환하여 세포 융합을 유도합니다. 다음으로, 생성된 heterocaryon을 HCV로 감염시킵니다. heterocaryon 형성의 두 방법 중 어느 것을 사용하든, 형광 현미경 관찰을 통해 융합을 확인하고 감염성 입자의 생성량을 정량화합니다.

이 기법의 주요 장점은 HV 특이적 우성 제한 인자의 발현을 확인하기 위해 대규모의 세포주 및 일차 세포 패널을 스크리닝하는 데 유용하다는 것입니다. 이 방법은 HCV의 종 특이성과 규범에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 세포 융합 유도에 앞서, 두 가지 융합 시스템의 기본 개념에 대한 이해를 돕기 위해 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

표준 프로토콜에 따라 HUH 7.5 세포에 H-C-V-R-N-A를 트랜스펙션하고, 다음 날 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 서브게놈 레플리콘을 보유한 트랜스펙션된 HUH 7.5 세포와 heal R 및 hep 56 1D 패키징 세포를 수확합니다. 이 패키징 세포들은 HCV 단백질 core, E1, E2, P7 및 NS2를 이소성으로 발현하도록 제작되었습니다. 트립신 처리 후, 세포를 DMEM 완전 배지에 다시 현탁하고 세포 현탁액을 다음과 같은 농도로 희석합니다: HUH 7.5는 5 × 10⁵ cells/mL, heal 및 hep 56 1D 세포는 2 × 10⁵ cells/mL로 희석합니다.

다음으로, 웰당 2~3개의 멸균 유리 커버슬립을 넣은 6-웰 배양 플레이트를 준비합니다. 융합 효율을 추가로 분석하려면, 형질전환된 HUH 7.5 세포 1 mL와 패키징 세포 1 mL를 혼합하여 6-웰 플레이트의 한 웰에 접종하고 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후 세포 밀도를 확인합니다.

세포막이 융합될 수 있도록 세포들이 서로 충분히 인접해야 하므로, 세포 융합을 유도하기 전 세포 밀도는 60~80% 합류도(confluency) 범위여야 합니다. 공배양된 세포에서 배지를 흡입하여 제거하고 1 mL PBS로 한 번 세척합니다. 그 다음, 미리 데워둔 40% polyethylene glycol 또는 PEG 1,500을 500 µL 조심스럽게 첨가합니다. 대조군으로서 다른 공배양 세포 웰에 500 µL PBS를 첨가합니다. 이종 핵 형성(heterokaryon formation)을 유도하기 위해 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. PEG를 흡입하여 제거하고 1분 후 2 mL PBS를 조심스럽게 첨가합니다. PBS를 흡입하여 제거하고 2 mL의 신선한 PBS를 첨가합니다. 과잉 PEG를 제거하기 위해 1회 세척당 1분씩 PBS로 3~5회 세척합니다.

마지막으로, 각 웰에 2 mL의 완전 배지 DMEM을 추가하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양합니다. 융합 후 48시간이 지나면, 각 SNAT를 수집하고 0.45 µm 필터로 여과합니다. 세포 배양 상청액을 수집한 후, 면역형광법을 통해 융합 효율을 결정할 수 있습니다. 유리 커버슬립이 들어 있는 웰을 1 mL의 PBS로 1분 동안 한 번 세척합니다.

PBS에 희석된 3% paraformaldehyde 600 µL를 사용하여 세포를 15분 동안 고정합니다. PBS로 1분씩 총 3회 세척한 후, 마지막 세척 단계를 완료합니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 24웰 플레이트로 조심스럽게 옮긴 뒤, PBS에 희석된 0.5% Triton X 100 500 µL를 사용하여 5분 동안 세포를 투과화합니다.

그 후 PBS로 3회 세척하고, 각 웰에 1차 항체 용액 250 µL를 분주합니다. anti NS5A 항체는 0.5 µg/mL 농도로, 인간 단일클론 anti E2 항체는 6.4 ng/mL 농도로 사용하십시오. 실온에서 45분 동안 배양한 후, PBS로 3회 세척합니다.

다음으로, 각 웰에 2차 항체 250 µL를 추가합니다. Alexa Fluor 546 또는 Alexa Fluor 488이 결합된 2 µg/mL 농도의 secondary goat anti-mouse 또는 goat anti-human IgG 특이적 항체를 사용합니다. 암소 상태의 실온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, PBS로 한 번 세척합니다.

그 후 PBS로 1:3000으로 희석한 250 µL의 DPI를 사용하여 세포핵을 염색합니다. 암실 상태의 상온에서 1분 동안 배양한 후 PBS로 4회, 증류수로 1회 세척합니다. 마지막으로 현미경 슬라이드 위의 flora mount 한 방울 위에 커버슬립을 뒤집어 덮고 암실에서 건조시킵니다.

이 절차를 시작하려면 다음 세포들의 단일 세포 현탁액을 수확하여 준비하십시오. CD 81의 내인성 발현이 결핍된 Luna NA 인간 간 세포주, He r 패키징 세포 및 인간 CD 81을 안정적으로 발현하는 Hep 56 1D 세포를 준비합니다. Luna n 세포를 he r 세포와 1:1 비율로, Hep 56 1D HCD 81 세포와 1:2 비율로 공동 배양하여, 12웰당 총 세포 밀도가 1.5 × 10⁵ cells가 되도록 합니다.

다음 날 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 2000을 사용하여 세포에 고발현 PFE 엔벨로프 단백질을 일시적으로 형질전환합니다. PFE 당단백질 형질전환 30시간 후, MOI 약 2.3으로 미리 준비된 바이러스 스톡 350 µL를 heterocaryons에 접종합니다.

다음 날 37°C, 5% CO2 조건에서 12시간 동안 배양합니다. PBS로 한 번 세척한 후, 웰당 1 mL의 DMEM 완전 배지를 첨가하고 37°C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후에 헤테로카리온(heterocaryon) 배양액의 상층액을 수집하고, 이를 0.45 µm 필터로 여과합니다. 그다음, 전날 96-웰 플레이트에 분주한 HUH 7.5 세포에 이 상층액을 접종하여 한계 희석 분석(limiting dilution assay)을 수행하며, 감염성 자손 입자의 생성량을 정량화하기 전까지 72시간 동안 배양합니다.

융합 이벤트를 시각화하는 절차는 공동 배양 6시간 전에 완료해야 합니다. 부착 세포를 5 mL의 PBS로 한 번 세척한 다음, 10 cm 디쉬당 4 mL의 적절한 DI 용액을 첨가하십시오. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 45분 동안 배양합니다. 세포를 5 mL의 PBS로 1분 동안 한 번 세척한 후 DMEM 완전 배지를 첨가하십시오. 파종 전 37 °C, 5% CO2 조건에서 6시간 동안 배양합니다. 12-웰 플레이트의 각 웰에 커버슬립을 추가하십시오. 그 후 이전에 설명한 대로 세포를 파종하고 형질전환 및 염색을 수행합니다. 형질전환 30시간 후, 1 mL의 PBS로 1분 동안 세포를 조심스럽게 세척한 다음, 3% 파라포름알데히드 250 µL를 사용하여 실온에서 15분 동안 세포를 고정합니다.

PBS 1 mL로 세포를 1분 동안 한 번 세척한 다음, PBS와 물로 각각 한 번씩 세척하고 dappy로 1분 동안 염색한 후 커버 슬립, 선글라스, 슬라이드를 마운트하여 제한 인자가 HCV 복제 주기 완료에 미치는 영향을 조사하는 첫 번째 접근 방식을 수행합니다. 헤테로카론(hetero carons)에서 HUH 7.5 세포에 루시페라아제 트랜스유전자와 HCV 비구조 단백질을 발현하는 서브게놈 레플리콘을 일시적으로 형질전환시킨 후, HCV 구조 단백질 core 및 보조 단백질을 발현하는 세포주와 공배양 및 융합시켰습니다. 대표적인 결과가 이 그림에 묘사되어 있으며, E2 구조 단백질과 NS5A 비구조 단백질에 대한 단클론 항체를 사용하여 세포를 면역 염색하였습니다.

상단 패널의 이미지들은 PEG 처리 시 MS five A와 D two의 신호가 동일한 세포질에서 동시에 검출되었으며, 이는 자가 융합이 일어났음을 보여줍니다. 반면, 하단 패널에서는 공배양된 세포를 PBS로 처리했을 때 융합이 유도되지 않았음을 보여줍니다. 따라서 신호의 공동 국소화가 관찰되지 않았습니다. 이종 카론에서 생성된 바이러스 감염력을 정량화하기 위해 융합 유도 48시간 후에 공배양 세포로부터 상청액을 수집하였으며, 이를 나이브 HUH 7.5 세포에 접종하여 후속 루시퍼레이스 분석을 수행하였습니다.

이 그래프에는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균값이 표시되어 있습니다. 회색 가로 막대는 감염되지 않은 HUH 7.5 세포에서 측정된 상대 발광 단위(RLU)의 배경값을 나타냅니다. 특히, HUH 7.5 복제 세포를 나이브 세포주와 융합하거나 대조군으로 PBS를 처리했을 때, 배양액에서는 감염성이 검출되지 않았습니다.

하지만 PEG에 의해 HUH 7.5 레플리콘과 패키징 세포주 간의 세포 융합이 유도되었을 때, 감염성 바이러스 입자가 배양액으로 방출되었습니다. 이는 바이러스 생산에 세포 융합과 패키징 세포주 내 바이러스 단백질의 발현이 필요함을 나타냅니다. 특히 HUH 7.5 인간 간암 세포의 헤테로카리온뿐만 아니라, 인간 비간세포 및 마우스 간세포와의 헤테로카리온에서도 바이러스 방출이 가능했으며, 이는 이러한 세포 유형에 존재할 수 있는 제한 인자들에 의해 조립 및 방출이 지배적으로 억제되지 않음을 시사합니다. 대안적인 방법으로, 세포 배양 후 유전적 당단백질의 발현을 통해 체세포 융합을 유도하였습니다.

공동 배양 및 transfection 이전에 서로 다른 세포주를 cell tracker dye로 염색하여 hetero caron을 시각화하였으며, genic protein 세포와 함께 transfection 한 후 30시간 뒤에 세포를 고정하고 DPI로 염색하였으며, 그 대표적인 결과가 본 그림에 제시되어 있습니다. 두 세포 유형의 융합은 여기에서 설명된 바와 같이 세포질 내에 dye가 균일하게 분포된 hetero carryon으로 나타납니다. 이와 대조적으로, 하단 패널의 이미지들은 이중 염색된 세포질을 가진 세포가 없음을 보여주며, 이는 세포 융합이 일어나지 않았음을 나타냅니다.

이 마지막 그래프는 모든 HCV 진입 인자가 human CD 81을 발현하는 hela 또는 Hep 56 1D 세포와 함께 Luna N 세포의 이종 캐리어에서만 발현됨을 보여줍니다. 여기에서 배양물은 감염성 HCV 입자로 접종되었습니다. 48시간 후에 배양액을 수집하였으며, naive HUH 7.5 표적 세포를 이용한 한계 희석법으로 이종 캐리온으로부터의 de novo 입자 방출량을 측정하였습니다. 세 번의 독립적인 실험의 평균값이 표시되었으며, 회색 가로 막대는 분석의 검출 한계를 나타냅니다.

대조군으로서 lunar N 세포를 lunar N 세포와 융합시킨 결과, 검출 한계에 가까운 매우 낮은 수준의 감염성 HCV가 나타났습니다. lunar N 세포를 naive HEP 56 1D 세포와 융합했을 때도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 두 경우 모두 인간 CD 81이 없었기 때문에, HCV가 이종 세포를 생산적으로 감염시킬 수 없었습니다.

이와 대조적으로, heer와 융합된 lunar 10 세포 및 인간 CD 81을 발현하는 HEP 56 1D 세포와 융합된 lunar hand 세포에서는 분석 배경값보다 약 10배 높은 수준의 감염성 바이러스 자손의 de novo 생성이 관찰되었습니다. 이는 HCV가 RetroCars 내에서 복제 주기를 성공적으로 완료했음을 나타내며, 따라서 이 세포주들에서 우성 제한 인자가 발현되지 않았음을 입증합니다. 일단 숙달되면, 실험 절차를 적절히 수행할 경우 전체 과정을 1주일 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 잠재적인 HCV 제한 인자를 식별하기 위해 이형 접합 운반체(hetero carryon)를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. C형 간염 바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 높은 생물 안전 수준과 같은 예방 조치를 항상 고려해야 함을 잊지 마십시오.