흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

본 절차의 전반적인 목적은 고품질의 인간 혈관 내피세포를 분리하고, 이를 이용하여 하류 흐름(underflow) 조건에서 호중구의 세포 간 이동을 조절하는 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 인간 제대정맥 내피세포를 분리하여 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 배양된 세포를 IBD 챔버로 분할하여 옮기는 것입니다.

다음으로, 갓 분리한 인간 호중구를 활성화된 혈관 내피세포 위에 도포하면 호중구의 롤링, 강한 부착 및 투과 현상이 나타납니다. 마지막 단계는 비디오 현미경을 사용하여 투과 정도를 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 형광 및 명시야 현미경을 통해 활성화된 혈관 내피세포를 가로지르는 호중구의 투과 양상을 평가할 수 있습니다.

혈관 내피세포 분리는 설명하기는 쉽지만, 주요 단계에서 탯줄의 시각적 확인이 필요하기 때문에 습득하기는 어렵습니다. 이러한 이유로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 방법은 흐름 조건에서 백혈구 모집이 어떻게 일어나는지, 그리고 흐름 조건에서 혈관 내피세포가 어떻게 행동하는지와 같은 염증 분야의 핵심 질문들을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

이 방법은 염증 과정 중의 호중구 모집에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 자연 살해 세포(natural killer cells)나 호산구(eosinophil)와 같은 희귀 백혈구 집단에도 적용 가능합니다. Ritu Sharma와 함께 이 절차를 시연하는 사람은 제 실험실의 기술자인 Hong Jang입니다. 절차 시작 최소 1시간 전에 T 75 플라스크를 젤라틴으로 코팅한 후 37 °C에서 배양하십시오.

그 다음, 층류 후드 내에서 가위를 사용하여 태반에서 탯줄을 잘라내어 혈관 내피세포 분리 과정을 시작합니다. 멸균 장갑으로 교체한 후 탯줄을 면밀히 살펴보고 혈전이 포함되어 있거나 분만 시 탯줄 클램핑으로 인해 손상된 부분은 폐기합니다. 그런 다음 탯줄에 존재하는 두 개의 동맥과 한 개의 정맥을 확인합니다.

다음으로, 2방향 스톱콕이 연결된 캐뉼라를 정맥의 한쪽 끝에 조심스럽게 삽입한 후, 캐뉼라 주변에 클램프를 설치하여 위치를 단단히 고정합니다. 이 과정에서 가장 까다로운 부분 중 하나는 탯줄을 관류하는 것입니다. 이를 성공적으로 수행하기 위해, 탯줄에 과량의 버퍼를 관류하며 유출물이 투명해질 때까지 흐름을 관찰하십시오.

유출액이 투명해질 때까지 탯줄 버퍼로 정맥을 관류한 다음 탯줄 끝을 클램프로 집습니다. 관류 중에 의사가 제대혈을 채취하여 생긴 작은 구멍이 발견되는 경우가 가끔 있습니다. 이런 상황에서는 혈관 집게(hemostat)를 사용하여 구멍을 막고, 혈관 내피 세포를 분리하는 동안 관류를 계속할 수 있습니다.

콜라게나제 처치 시간을 정확하게 조절하는 것이 매우 중요합니다. 처리 시간이 너무 짧으면 내피세포가 충분히 회수되지 않으며, 너무 길면 평활근세포의 오염이 발생하거나 내피세포가 손상될 수 있습니다. 그 다음, 새로 준비한 따뜻한 콜라게나제로 정맥을 관류하십시오.

스톱콕을 잠그고 온도가 유지된 제대 완충액(cord buffer)이 담긴 비커에서 제대를 배양합니다. 10분 후, 제대를 꺼내어 정맥 내강에서 혈관 내피세포가 떨어져 나오도록 부드럽게 마사지합니다. 제대 완충액으로 제대를 두 번 헹구어 남은 세포를 모두 제거하면서, 해당 용액을 5 mL의 혈관 내피세포 배지(ECM)가 담긴 튜브에 들이붓습니다.

이제 세포를 3,000 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 실온에서 상층액을 제거한 후 펠렛을 재부유시킵니다. 10 mL의 혈관 내피 세포 배지에 세포를 현탁하여 젤라틴 코팅된 T 75 플라스크로 옮기고, 혈관 내피 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플라스크를 부드럽게 흔들어 남아 있는 적혈구를 제거합니다.

그 다음 상층액을 제거하고 따뜻한 HBSS로 혈관 내피세포 배양물을 세척합니다. HBSS를 제거한 후, 따뜻한 ECM 10 milliliters를 세포에 공급합니다. 그런 다음 현미경으로 세포를 관찰하여 적혈구가 제거되었는지 확인하고, 혈관 내피세포의 합류도와 형태를 평가합니다.

세포가 합류도(confluency)에 도달할 때까지 3일마다 배지를 계속 교체하십시오. 그 시점에서 trypsin 및 EDTA 용액을 사용하여 세포를 분할하십시오. 그런 다음 분리된 세포를 수확하여 ECM에 재부유시키십시오.

마지막으로, IBD 챔버의 각 웰을 젤라틴으로 코팅합니다. 과량의 젤라틴을 제거한 다음, 각 웰에 1.5 × 10⁶ cells/mL 농도의 혈관내피세포 현탁액을 첨가합니다. 혈관내피세포를 활성화하는 동안 적절한 자극제와 함께 배양하여, 접착 및 활성 분자의 세포 표면 발현 상향 조절을 유도하는 것으로 시작합니다.

기존에 발표된 바와 같이 밀도 원심 분리를 통해 건강한 인간 지원자의 말초혈액에서 호중구를 분리하고, 이를 HBSS 및 인간 알부민 혼합액에 10⁶/mL 농도로 현탁합니다. 현미경 설정을 마친 후, 자극된 혈관 내피 세포가 포함된 IBD 챔버를 현미경 튜브에 연결합니다. 10x 위상차 대물렌즈를 선택한 다음, 시린지 펌프를 인출 모드로 설정하여 원하는 전단 응력으로 HBSS의 흐름을 시작합니다.

출구 측의 3방향 스톱콕을 'off' 위치로 돌려 흐름을 잠시 멈추고, 유입 라인을 HBSS에서 분리된 중성구로 전환합니다. 스톱콕을 다시 'on' 위치로 돌려 흐름을 재개합니다. 그런 다음 DVD 기록기에 연결된 CCD 카메라를 사용하여 기록을 시작합니다.

타이머를 시작합니다. 4분 후 중성구가 챔버로 진입하면, 새로운 중성구가 부착되는 것을 방지하기 위해 다시 HBSS로 교체합니다. 전체 상호작용, 롤링 및 강한 부착(firm adhesion) 데이터를 얻고자 하는 경우, 10배 위상차 렌즈를 사용하십시오.

4분에서 5분 사이에 6개의 무작위 영역을 각각 10초 동안 촬영합니다. 마지막으로 40 x 대물렌즈로 전환하여 관심 시점의 단일 시야를 기록합니다. 10분째에 호중구 관류를 수행한 후, 5개에서 10개의 무작위 시야를 수집합니다.

자극되지 않은 혈관 내피세포는 중성구의 모집을 지원하지 않습니다. 따라서 다음의 그림들은 TNF alpha로 자극된 혈관 내피세포와 상호작용하는 중성구를 보여줍니다. 노란색 화살표로 표시된 부착된 중성구와 흰색 화살표로 표시된 투과 이동 중인 중성구에 유의하십시오.

호중구의 투과(transmigration)는 세포 접합부에서 일어나거나 내피세포 자체를 통해 일어날 수 있습니다. 이 두 가지 상태를 구별하기 위해, 내피세포를 anti VE-cadherin 항체로 표지하였습니다. 여기 빨간색으로 표시된 것과 같이, 투과는 세포 간(paracellular) 또는 세포 내(transcellular) 투과로 구분하여 측정합니다.

이 모델에서는 이전 두 그림을 겹쳐서 보여주는 이 그림에서 입증된 바와 같이, 거의 모든 투과가 세포 간 경로(paracellular)를 통해 일어납니다. 세 개의 그래프 중 첫 번째 그래프에서는 neutrophil 상호작용을 Image J 소프트웨어를 사용하여 검토하고 측정하였습니다. neutrophil과 TNF alpha로 활성화된 endothelial cell 사이의 상호작용이 자극되지 않은 대조군 endothelial cell과의 상호작용보다 유의미하게 더 많이 발생했음에 주목하십시오.

전체 상호작용 세포는 이전과 동일하게 롤링(rolling), 강한 부착(firmly adherent) 또는 투과 이동(trans migrating) 상태로 추가 특성화되었습니다. 내피세포를 분리한 후, 활성화된 내피세포가 포함된 웰에서 호중구 투과 이동이 유의미하게 더 많이 발생했습니다. 발달 이후에는 내피세포 생물학과 관련된 추가적인 의문을 해결하기 위해 웨스턴 블로팅(western blotting), 실시간 PCR(real time PCR) 및 내피 저항성 측정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

본 방법은 염증 및 혈관 생물학 분야의 연구자들이 인간 모델 시스템의 흐름 조건에서 백혈구 보충이 어떻게 일어나는지 이해하는 데 도움을 줄 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 제대정맥 내피세포를 분리하고, ity 챔버를 사용하여 흐름 조건 하에서 호중구 투과를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.