흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 고품질의 인간 내피 세포를 분리하고 이를 사용하여 호중구 트랜스 이동, 언더플로 조건을 조절하는 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 인간 제대 정맥 내피 세포를 분리하고 도금함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 세포를 IBD 챔버로 분할하는 것입니다.

다음으로, 새로 분리된 인간 호중구는 활성화된 내피 세포를 가로질러 퍼져 호중구 롤링 확고한 접착 및 전이를 초래합니다. 마지막 단계는 비디오 현미경을 사용하여 전이를 정량화하는 것입니다. 궁극적으로 형광 및 명시야 현미경 검사는 활성화된 내피 세포를 가로지르는 호중구 전이를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

내피 세포 분리는 설명하기 쉽지만 핵심 단계에서 탯줄의 시각화가 필요하기 때문에 부분적으로 배우기가 어렵습니다. 이러한 이유로 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 이 방법은 유동 조건에서 백혈구 동원이 어떻게 발생하는지, 유동 조건에서 내피 세포가 어떻게 행동하는지와 같은 염증 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이해.

이 방법은 염증 중 호중구 모집에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 자연적인 살해 세포 및 호산구와 같은 백혈구 희소한 집단에 적용될 수 있습니다. 리투 샤르마(Ritu Sharma)와 함께 이 시술을 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 홍 장(Hong Jang)으로, 시술 프리코 최소 1시간 전에 젤라틴이 든 T 75 플라스크를 섭씨 37도에서 배양합니다.

그런 다음 가위를 사용하여 태반에서 탯줄을 잘라 층류 후드에서 내피 세포 분리 절차를 시작합니다. 멸균 장갑으로 갈아끼신 후에는 탯줄을 자세히 검사하고 혈전이 있거나 탯줄 클램핑으로 인해 손상된 부분은 모두 버리십시오. 그런 다음 탯줄에 있는 두 개의 동맥과 단일 정맥을 확인합니다.

다음으로, 양방향 정지 수탉이 부착된 캐뉼라를 정맥의 한쪽 끝에 부드럽게 삽입한 다음 캐뉼라 주위에 클램프를 놓아 제자리에 단단히 고정합니다. 절차에서 가장 까다로운 부분 중 하나는 탯줄을 관류하는 것입니다. 이 작업이 성공적으로 수행되도록 하려면 과도한 버퍼가 있는 코드를 관류하고 깨끗해질 때까지 흐름을 관찰하십시오.

흐름이 깨끗해질 때까지 코드 버퍼로 정맥을 관류한 다음 코드 끝을 고정합니다. 때때로 관류 중에 의사가 탯줄에서 제대혈을 제거했기 때문에 작은 구멍이 드러납니다. 이러한 상황에서는 지혈제를 사용하여 구멍을 막을 수 있으며 내피 세포를 분리하는 동안 관류를 계속할 수 있습니다.

콜라겐분해효소 처리 시간을 정확하게 맞추는 것이 매우 중요합니다. 시간이 너무 짧고 내피 세포가 충분하지 않으면 너무 오래 채취되어 평활근 세포가 오염되거나 내피 세포가 손상될 수 있습니다. 그런 다음 갓 준비한 따뜻한 콜라겐 분해 효소로 정맥을 관류시킵니다.

스톱 콕을 닫고 따뜻한 코드 버퍼가 들어 있는 비커에 코드를 배양합니다. 10분 후 탯줄을 제거한 다음 부드럽게 마사지하여 정맥 내강에서 내피 세포를 느슨하게 합니다. 5ml의 내피 세포 매체 또는 ECM이 들어 있는 튜브에 용액을 배출하고 코드 버퍼로 탯줄을 두 번 세척하여 남아 있는 세포를 제거합니다.

이제 실온에서 50회 3회 10분 동안 세포 G.At 스핀다운하고 상등액을 제거한 다음 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 10ml의 내피 세포 배지에서 세포를 젤라틴으로 코팅된 T 75 플라스크로 옮기고 내피 세포를 섭씨 37도 및 5%CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플라스크를 부드럽게 흔들어 적혈구를 제거합니다.

그런 다음 상층액을 제거하고 따뜻한 HBSS로 내피 세포 배양액을 세척합니다. HBSS를 제거한 후 10ml의 따뜻한 ECM을 세포에 공급합니다. 그런 다음 현미경으로 세포를 검사하여 적혈구가 제거되었는지 확인하고 내피 세포의 합류 정도와 형태를 평가합니다.

세포가 cofluency에 도달할 때까지 3일마다 배지를 계속 교체합니다. 이 시점에서 트립신과 EDTA 용액을 사용하여 세포를 분할합니다. 그런 다음 분리된 세포를 수확하고 ECM에 다시 현탁시킵니다.

마지막으로, IBD 챔버의 각 웰을 젤라틴으로 코팅합니다. 여분의 젤라틴을 제거한 다음 내피 세포 현탁액의 밀리리터당 6에 1.5 곱하기 10을 챔버의 각 웰에 추가합니다. 먼저 내피 세포가 활성화되는 동안 적절한 자극제로 내피 세포를 배양하여 접착 및 활성화 분자 세포 표면 발현의 상향 조절을 유도합니다.

이전에 발표된 바와 같이 밀도 원심분리를 통해 건강한 인간 지원자의 말초 혈액에서 호중구를 분리한 다음 HBSS와 인간 알부민에서 밀리리터당 6배의 농도로 세포를 현탁시킵니다. 현미경을 설정한 후 자극된 내피 세포가 들어 있는 IBD 챔버를 현미경 튜브에 부착합니다. 10 x 위상차 대물렌즈를 선택한 다음 주사기 펌프를 빼내고 원하는 전단 응력에서 HBSS의 흐름을 시작하도록 설정합니다.

출구 쪽의 3방향 정지 콕을 꺼짐 위치로 돌리고 입구 라인을 HBSS에서 격리된 호중구로 전환하여 흐름을 잠시 중지합니다. 스톱 콕을 다시 켜짐 위치로 돌려 흐름을 다시 시작하십시오. 그런 다음 DVD 레코더에 연결된 CCD 카메라를 사용하여 녹음을 시작합니다.

타이머를 시작합니다. 4분 후 호중구가 챔버에 들어오면 새로운 호중구가 부착되는 것을 방지하기 위해 HBSS로 다시 전환하십시오. 전체 상호 작용 롤링 및 확고한 접착력에 대한 데이터가 필요한 경우 10 x 위상차를 사용합니다.

목표: 10초 동안 각각 1분, 4분에서 5분 사이에 6개의 무작위 필드를 이미지화합니다. 마지막으로 40 x 대물렌즈로 전환하고 관심 있는 시간에 단일 시야를 기록합니다. 10분에 호중구 관류 후 5개에서 10개 사이의 무작위 시야를 수집합니다.

자극되지 않은 내피 세포는 호중구 모집을 지원하지 않습니다. 따라서, 다음 그림은 TNF 알파 자극 내피 세포와 상호 작용하는 호중구를 보여줍니다. 노란색 화살촉으로 표시된 부착 호중구와 흰색 화살촉으로 표시된 트랜스 이동 호중구에 주목하십시오.

호중구 전이(Neutrophil transmigration)는 세포 접합부(cell junctions)에서 또는 내피 세포(endothelial cell) 자체를 통해 발생할 수 있습니다. 이 두 가지 상태를 구별하기 위해 내피 세포는 항 VE 응집성 항체로 표지되었습니다. 여기 빨간색에서 볼 수 있듯이 형질전환은 세포주위 또는 세포횡단으로 발생하는 것으로 점수가 매겨집니다.

이 모델에서, 거의 모든 전이(transmigration)는 앞의 두 그림의 오버레이를 보여주는 이 그림에서 알 수 있듯이 준세포(paracell)입니다. 세 개의 그래프 중 첫 번째 그래프에서는 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 호중구 상호 작용을 검사하고 측정했습니다. 호중구 내피 세포 상호 작용이 대조군의 자극되지 않은 내피 세포보다 호중구와 TNF 알파 활성화 내피 세포 간에 훨씬 더 많이 발생했다는 점에 유의하십시오.

총 상호 작용 세포는 이전과 같이 롤링 또는 단단히 부착 또는 트랜스 마이그레이션으로 추가로 특성화되었습니다. 상당히 더 많은 호중구 전이가 활성화된 내피 세포를 포함하는 우물에서 발생했으며, 이는 내피 세포의 분리 후에 발생했습니다. 웨스턴 블로팅(western blotting), 실시간 PCR 및 내피 저항성(endothelial resistance)과 같은 다른 방법은 개발 후 내피 세포 생물학과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.

이 방법은 염증 및 혈관 생물학 분야의 연구자들이 인간 모델 시스템의 흐름 조건에서 백혈구 모집이 어떻게 발생하는지 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 제대 정맥 내피 세포를 분리하고 ity chamber를 사용하여 흐름 조건에서 호중구 전이를 연구하는 데 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.