조사를위한 인적 나팔관 모델

Chlamydia trachomatis는 그람 음성 절대 세포 내 기생 세균입니다. 안구 또는 생식기 감염을 유발하는 다양한 클라미디아 혈청형이 알려져 있습니다. Chlamydia trachomatis에 의한 생식기 감염은 전 세계적으로 가장 빈번하게 발생하는 성매개 질환입니다.

이들은 1990년부터 2009년까지 유럽 연합에서 보고된 감염 건수가 거의 300만 건에 달하는 유병률을 보입니다. 2009년에는 거의 400,000건의 사례가 보고되었습니다. 공공 보건 및 성교육이 지속적으로 개선되고 있음에도 불구하고, 새로운 생식기 클라미디아 감염 사례가 1990년 70,000건에서 2009년 400,000건으로 증가하는 추세가 감지되었습니다.

모든 신규 감염의 75%가 15세에서 24세 사이의 젊은 층에서 보고됩니다. 임상적 후유증은 병원균의 불충분한 제거로 인해 발생하는 것으로 추정되며, 이는 하부 생식기에서 상부 생식기로의 상행성 감염으로 이어져 결과적으로 감염된 조직에 만성 염증성 손상을 일으킬 수 있습니다. Chlamydia trachomatis에 감염된 여성의 10%에서 30%가 골반염(PID)을 앓으며, PID 사례의 최대 50%가 Chlamydia trachomatis 감염에 의한 것으로 알려져 있습니다.

결과적으로, 난관 불임 환자의 50%와 자궁 외 임신 환자의 40%에서 클라미디아가 원인 병원균으로 발견됩니다. 감염되지 않은 건강한 여성의 경우, 수정란은 난관을 통해 자궁으로 이동하여 출산 시까지 발달합니다. 감염된 환자의 경우, 클라미디아가 하부 생식기에서 난관으로 상행하여 만성 염증 과정을 유발할 수 있습니다.

병원균에 의해 유도된 상피 세포 손상과 중심 상피 세포 기능의 상실은 최종적으로 난관 폐쇄를 일으켜, 난소에서 자궁으로의 난자 이동을 감소시키거나 완전히 차단하는 원인이 되는 것으로 생각됩니다. 이를 위해 자궁 절제술을 받는 여성의 인간 난관을 수집하여 보관합니다. 수집된 난관은 절개하여 조심스럽게 엽니다.

실험 설정에 따라, 이들은 작은 표본으로 절단되며 각각의 시점에 따라 24~48시간 동안 감염성 chlamydia tracheitis elementary bodies로 감염시킵니다. 표본은 추가 준비 단계 전까지 최소 3일 동안 Monty 고정액으로 고정합니다. 자궁 적출술을 받는 여성으로부터 얻은 인간 난관(HFT)은 수술 직후에 보관합니다.

준비 전까지 항생제가 포함되지 않은 5% FCS 함유 RPMI 내에서 4°C로 보관하십시오. 전체 처리 과정 동안 항생제가 없는 5% FCS 함유 RPMI가 들어 있는 페트리 접시에서 인간 난관을 박리하십시오. 건조를 방지하기 위해 튜브를 배지로 잠기게 해야 하며, 결합 조직 및 수술 중 파손된 조직은 절단하여 제거하십시오.

해부 후, 소형 메스로 HFT를 조심스럽게 엽니다. 포셉과 메스를 부주의하게 사용하여 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오. 감염을 위해 5x5 mm 크기로 조직 조각을 준비하고, 항생제가 포함되지 않은 5% FCS 함유 RPMI 1 mL에 HFT 검체를 보관하며 C track을 추가합니다.

OMAS elementary bodies HFT 시료를 일반 배양기 내의 37 °C, 5%CO2 및 20%O2 조건 또는 저산소 챔버 내의 5%O2 미만인 저산소 환경에서 최대 48시간 동안 배양합니다. 각각의 배양 시간 경과 후, 시료를 수집하여 투과전자현미경(TEM) 또는 주사전자현미경(SEM) 준비 전까지 4 °C에서 최소 3일 동안 Monty's Fixative에 보관합니다. 고정된 조직을 작은 조각으로 절단하여 세척한 후, 1%osse 및 tetroxide와 함께 하룻밤 동안 배양합니다.

여러 단계의 세척 및 건조 과정을 거친 후, 탈수된 시료를 새로 준비한 aite에 옮겨 60 °C에서 48시간 동안 중합시킵니다. 트리밍 후, 세미-씬(semi-thin) 및 울트라-씬(ultra-thin) 섹션을 절단하여 각각 슬라이드 또는 그리드에 옮깁니다. 염색 후, 세미-씬 섹션을 광학 현미경으로 관찰하여 투과 전자 현미경 관찰 부위를 확인합니다.

시료를 Monty 고정액에서 꺼내어 최대 2 x 2 x 5 mm 크기의 조각으로 절단합니다. 세척, sodium CCO 희석 버퍼 배양, 오스뮴 테트라옥사이드 세척, 탈수 및 에탄올 농도 구배 처리를 거친 후, 시료를 50% propylene oxide와 aite 혼합액에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 새로 준비한 aite로 옮겨 최소 1시간 동안 둡니다.

그런 다음 평평한 몰드로 옮겨 aite로 채운 뒤 60 °C에서 48시간 동안 aerd dite를 중합시킵니다. 임베딩된 샘플을 다듬은 후, 유리 나이프 또는 가급적 다이아몬드 나이프가 장착된 울트라 마이크로톰을 사용하여 약 700 nm의 세미-씬 섹션(semi thin section) 또는 70 nm의 울트라-씬 섹션(ultra thin section)으로 절편을 만듭니다. 세미-씬 및 울트라-씬 섹션은 광학 현미경과 투과 전자 현미경으로 시편을 분석하며, 주사 전자 현미경으로도 분석합니다.

시료는 상피 세포가 위를 향하도록 코르크 판에 고정하며, 농도가 점차 증가하는 아세톤을 사용하여 세척 및 탈수합니다. 임계점 건조기로 건조한 후, 시료를 SEM 시료 마운트로 옮기고 스퍼터 코더를 사용하여 백금, 금 또는 팔라듐으로 코팅합니다. 그러면 주사 전자 현미경 분석을 위한 준비가 완료됩니다.

검체를 Monty 고정액에서 꺼내어, 상피 조직이 위를 향하도록 코르크 시트 위에 놓고 곤충 핀으로 위치를 고정합니다. sodium caco dilate 완충액으로 세척하고 아세톤 처리한 후, 임계점 건조기(critical point dryer)를 사용하여 검체를 건조합니다. 검체를 코르크에서 SEM 시편 거치대로 옮긴 후, 스퍼터 코터(sputter coater)를 사용하여 검체에 전도성 백금-금 또는 팔라듐 코팅을 수행합니다. 코팅된 검체를 주사전자현미경(scanning electron microscope)으로 옮겨 추가 분석을 진행합니다.

여성에게서 나타나는 높은 빈도의 자궁경부 감염률과 상행성 감염으로 인한 막대한 임상적 결과는 이 분야의 기초 및 중개 연구를 강화해야 하는 근거가 됩니다. 본 연구진은 St. Perus 그룹이 이전에 확립한 인간 난관의 ex vivo 조직 모델을 활용하여 난관 내에서 클라미디아에 의해 유도된 세포 손상을 형태학적으로 분석하였습니다. 이 방법을 통해 복제 및 지속성 감염이 모두 관찰되었으며, 세포 내 봉입체의 형성이 다양한 발달 단계에서 확인되었습니다.

하지만 인간 난관 조직 내에 지속성 클라미디아가 존재한다는 실험적 증거는 여전히 부족하며, 클라미디아, 자손 및 지속성 유전자의 전사 상향 조절에 대한 추가 분석이 필요합니다. 이 모델의 주요 한계 중 하나는 염증 세포가 없다는 점이며, 이는 초기 KLA 글라우코마 감염으로 인한 2차 영향 분석을 어렵게 만듭니다. 그럼에도 불구하고, 이 모델은 난관 상피 세포 손상 맥락에서의 산소 함량과 같은 환경 조건을 분석하고, 급성 글라우코마 감염에 대한 초기 숙주 면역 반응을 분석하는 데 적절한 것으로 보입니다.

향후 목표 중 하나는 pH 인간 난관 조직 모델에서 CTU의 MIC 테스트를 위한 더 정교한 모델을 구축하고, 이 모델을 사용하여 이광자 레이저 주사 현미경 기술을 통해 CLI의 서로 다른 발달 단계를 대사적으로 명확히 정의하는 것입니다.