Name: 조사를위한 인적 나팔관 모델 C. trachomatis 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 C. trachomatis 감염으로 인한 인간 나팔관 상피세포 손상을 연구하는 ex vivo 조직 모델을 활용한 방법입니다. 이 기법은 만성 염증 반응과 생식 건강에 미치는 영향을 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 &quot;인터페이스에 염증&quot;우수 DFG-클러스터 (RA-하면, RA-D)에 의해 지원되었다. 우리는 크리스틴 Wischnat의 우수한 기술 지원을위한 감사를드립니다.

1. 클라미디아의 trachomatis Serovar D 증권의 작성 <ol><li> 네 ML C.으로 HELA-229 세포를 포함하는 지류 175cm 2 세포 배양 플라스크를 감염 버퍼를 SPG의 trachomatis의 디. </li><li> 끊임없이 진동하는 동안 37 ° C에서 한 시간 만이라도 품어. </li><li> 10% FCS와 240 μl Cycloheximide있는 20 ML DMEM을 추가합니다. </li><li> 37시 48 H 위해 humidified 인큐베이터에서 부화 ° C에서 5 % CO 2. </li><li> C를 분리하고 파괴하는 5 ML 멸균 유리 구슬, 강한 쉐이크를 추가하십시오 HELA-229 세포를 숨겨주 trachomatis. </li><li> 표면에 뜨는를 수집하고 멸균 유리 구슬의 또 다른 5 ML을 추가합니다. </li><li> 1 분 용 록 세 번 모두 HELA-229 세포를 파괴하고 릴리스 C.하기 trachomatis. </li><li> 5 천 rpmi에서 분 및 4 ° C 원심 분리기 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 8-10 175cm 2 세포 배양의 감염 뜨는을 모으이 합류 G를 flasksHELA 229 세포와 rown. </li><li> 37 1 시간 4 ML SPG 버퍼와 이전의 감염에서 4 ML에 뜨는 ° 지속적인 진동과 C로 모든 휴대용 술병을 품어. </li><li> 한 시간 10% FCS 37 ° C에서 5 % CO 2에서 48 H 보육 다음에 230 μl cycloheximide와 15 ML DMEM을 추가한 후. </li><li> 5 ML 멸균 유리 구슬을 추가 분리하는 악수와 C를 파괴 HELA-229 세포를 숨겨주 trachomatis. </li><li> 표면에 뜨는를 수집하고 멸균 유리 구슬의 또 다른 5 ML을 추가합니다. </li><li> 1 분 용 록 세 번 모두 HELA-229 세포를 파괴하고 릴리스 C.하기 trachomatis. </li><li> 4에 1000 rpmi에서 5 분 원심 ° C에서 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 표면에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 11,000 rpmi로 99 분, 50 ML 팔콘 튜브, 원심 분리기에 뜨는 40 ML을 채웁니다. </li><li> 원심 분리 후 뜨는를 버리고 한 ML이 버퍼를 SPG와 함께 펠릿 씻는다. </li><li> 를 Homogenize펠렛 -70에서 1, 5 ML Eppendorf 튜브, 저장 ° C에서 사용까지 1 ML의 SPG 및 나누어지는 20 μl 인치 준비된 재고 생물 학적 활동이 설립 HELA-229 세포 감염 모델에서 확인되었다. </li></ol> 2. 인간 나팔관의 준비 <ol><li> 즉시 RPMI는 준비까지 4 항생제없이 ° C를 5퍼센트 FCS를 포함한에서 수술 후 자궁 적출술을받은 여성 스토어 인간 난관 튜브 (HFT). 프로토콜은 Lübeck의 대학 (09-153)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. (53까지 나이 34) 연구에 포함된 여성은 이전에 C의 아무 기록도 없었 trachomatis 감염. 나팔관의 조직은 제왕 섹션 동안이나 luteal 단계에서 증상 자궁​​ fibroids로 인해 hysterectomies 동안 산모의 요청에 peripartum 살균에서 수집된되었다. 모든 HFT는 C.에 대한 부정적인 테스트를했다 PCR에 의한 trachomatis. </li><li> 과 RPMI가 포함된 배양 접시에있는 HFT 해부항생제없이 5퍼센트 FCS. 전체 처리하는 동안 조직은 건조 방지를 위해 미디어에 빠져들되어야한다. </li><li> 차단하고 수술하는 동안 파괴 결합 조직과 조직을 버리고. </li><li> 절개 후 작은 메스로 조심스럽게 HFT를 엽니다. </li><li> 자세한 내용은 실험 X 0.5 cm 최대 1cm X 1cm까지 0.5 cm의 크기로 조직의 조각을 준비합니다. </li><li> 감염 저장소 HFT 검체의 경우 1 ML RPMI 항생제없이 5% FCS를 포함하는. HFT의 표본은 C의 5.5x10 5 IFU (포함 성형 세대)에 감염되었다 trachomatis. </li><li> 37 년 HFT 검체를 품어 ° C, 5 % CO 2와 21% O이뿐만 아니라 37에 ° C, 5 % CO 2와 2퍼센트 24 H에 대한 O 2. </li><li> 배양 시간은 4시 최소한 사흘 동안 Monti의 정착액의 표본과 점포를 수집 후 SEM / TEM 준비까지 ° C에서.에게 </li></ol> 3. TEM에 대한 HFT 표본의 작성 <ol><li> 용TEM은 Monti의 정착액에서 시료를 제거하고 4 X 5mm 조각 ~ 2 X 2mm를 잘라. 나머지 조직은 SEM을 위해 사용될 수 있습니다. </li><li> 한 H에 대한 나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 7.35와 조각을 씻으십시오. </li><li> 1퍼센트 (W / V) 아쿠아 dest 안에 오스뮴의 tetroxide에서 품어. 하룻밤. </li><li> 나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 7.35에서 6x5 분 세척하여 과잉 오스뮴의 tetroxide를 제거합니다. </li><li> 물에 에탄올의 증가 농도 (V / V) (2 H 30 %, 2 시인데 40 %, 2 시인데 50 %, 2 H 60 %, 박 이상 70 %,이 80 %에 잠복기로 물을 제거 H 1, H 90 %, 1 H 95 %, 1 H 100 %. </li><li> 프로필렌 옥사이드 2 X 15 분 동안 에탄올을 씻어하고 이후에 50 % 혼합 (V / V) 프로필렌의 신선한 araldite (모든 구성 요소 포함)을 전송하여 하룻밤 사이에 알을 품다. </li><li> 최소 1 H 위해 신선한 araldite (모든 구성 요소를 포함)에게 전송합니다. </li><li> 평면 퍼가기 금형으로 전송하고 araldite로 기입하십시오. </li><li> 위해 araldite 강화하자60 ° C에서 최소 48 H </li><li> 임베디드 시료의 트리밍 후 유리 knifes이나 조직을 다이아몬드 나이프를 사용 ultramicrotome에 세미 얇은 섹션 (700 nm의)를 잘라서 리처드슨의 얼룩에 얼룩. </li><li> 다이아몬드 나이프와 구리 그리드 (예 : 150 평방 메쉬)로 전송을 사용하여 극도로 얇은 부분 (약 70 nm의)를 잘라. </li><li> 아쿠아 dest 안에 0.5 % (W / V) uranyl 아세트산과 울트라 얇은 부분을 청바지. 3퍼센트 (W / V) 아쿠아 dest 안에 리드 구연산으로 따라갔다. 자동 섹션 제조인 인치 또는 섹션은 격자에게 아쿠아 dest 안에 uranyl 아세트산의 포화 centrifuged 용액에 15 분 출발하여 수동으로 물들일 수있다. 아쿠아 dest 안에 0.3 %의 리드 구연산 (W / V)로 따라갔다. </li></ol> 4. SEM에 대한 HFT 시편의 준비 <ol><li> SEM은 상피는 1.5 X 1cm의 코르크 시트에 위쪽으로 향하게과 Monti의 정착액, 동양에서 시료를 제거하고 곤충 바늘을 사용하여 위치를 고정 때문이다. </li><li> 적당한 금속 바구니에 코르크에 표본을 전송하고나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 7.35에서 30 분 동안 씻는다. </li><li> 아세톤 / 물 혼합의 증가 농도 (V / V) 6 H 30 %, 6 H로 40 %, 8 H 60 %, 박 이상 70 %, 2 시인데 80 %, 90 %에 표본을 잠복기에 의해 수분을 제거 밤이여 2 시인데 및 100 % (표본 계속 빠져들 유지하기가 매우주의). </li><li> 임계점 건조 (온도 40 ° C, 압력 80 바)에 의해 신선한 100 % 아세톤과 건조 표본으로 전송합니다. </li><li> 전도성 탄소 시멘트를 사용하여 전도성 탄소 탭을 갖춘 SEM 검체 마운트에서 위쪽으로 향하게 상피와 바늘, 코르크 및 접착제 검체를 제거합니다. 마운트 및 전도성 탄소 탭 사이의 전도성을 향상시키기 위해 액체 전도성 실버를 사용합니다. </li><li> 이 coater의 스퍼터 사용하여 시편의 전도성 백금, 금 또는 팔라듐 코팅을 준비합니다. </li></ol> 5. 리처드슨의 얼룩과 준결승 얇은 섹션의 염색법 <ol><li> 슬라이드에서 준 얇은 부분이 건조 해. </li><li> 1-2 분 동안 60 ° C에서 솔루션을 더럽히는 것으로 섹션을 청바지. </li><li> 아쿠아 dest 안에 씻는다. </li><li> 드라이 섹션과 coverslip. </li></ol> 6. 대표 결과 인간 난관 감염 모델 내에서 우리는 비 감염된 컨트롤 (그림 1)과 C. 사이의 상피 형태의 차이를 시각화 할 수 있었다 trachomatis - normoxic 조건 하에서 감염된 튜브 (그림 2). 특색 형태학의 차이가 아닌 감염된 컨트롤에 검색되지 않을 수 난관 상피 세포의 병원체 유발 붓기와 용해를 암시. 세미 얇은 섹션과 전송 전자 현미경을 사용하여 우리는 세포내 C를 증명할 수 있었다 인간 난관 조직을 감염 전 생체내의 trachomatis에 포함 형성 (그림 3, 5)하지만 이외 감염된 컨트롤 (그림 4). 산소 집중으로여성의 성기 요로에 tions 우리도 hypoxic 조건 하에서 우리의 모델을 조사 염증성 과정에서 생리적 조건 11, 그리고 더욱 감소 하에서 이미 낮습니다. 예선 결과는 모델 산소 농도를 변화 아래 chlamydial 성장과 자손을 분석하는 데 유용 나타냅니다. 클라미디아 유도된 내피 세포의 손상은 감염 전에 나팔관 (그림 6)의 경솔한 준비 및 처리를 통해 매개되는 유물로부터 분리되어야한다. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 컨트롤 매체에서 하루 인큐베이션 (녹색 화살표가 속눈썹이있는 세포, 파란색 화살표가 아닌 속눈썹이있는 세포를 보여주 표시) 이후에 비 감염된 인간 난관의 전자 현미경 (SEM)을 스캐닝. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 스캐닝 전자 마이크로<html> 인간의 난관 하루 게시물 감염 (흰색 화살표 마르크 파열 포함)를 감염 전직 생체내 C. trachomatis의 사본 (SEM). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 세미 얇은 섹션 C. 가진 인간 난관의 감염 이후에 전형적인 세포내 흠도 (흰색 화살표) 1D 표시 trachomatis의 전직의 생체내. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 제어 매체에서 하루 배양 후 비 감염된 인간 나팔관의 전송 전자 현미경 (TEM). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="그림 5" /> 전직 생체내 C의 그림 5. 전송 전자 현미경 (TEM) trachomatis는 인간의 난관 하루 게시물 감염 (흰색 화살표가 chlamydial 흠도을 표시)을 감염. ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. 표본의 경솔한 준비 및 처리 (흰색 화살표 표시가 상피 조직을 destructed)를 통해 손상된 난관의 상피의 전자 현미경 (SEM)을 스캐닝.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감염된 조직에 병원체 유도된 피해의 시각화는 힘든와 생쥐의 실험 절차에 종종 제한됩니다. 우리는 C를 분석하기 위해 인간의 나팔관에서 전직 생체내 감염 모델을 확립 상단 여성 성기 요로의 trachomatis 감염. 이 방법의 사용으로, 우리는 C를 시각화 할 수 있었다 trachomatis - 언젠가 포스트 감염 내에서 인간 난관의 상피에 손상을 유도. 세포 붓기와 용해가 C로 관찰되었다 전형적인 형태학의 변경 사항이있었습니다 trachomatis - 감염된 나팔관 아니지만 비 감염된 컨트롤 인치 TEM 분석은 chlamydiae가 다시 차별 초등학교 신체뿐만 아니라 지속성을 나타낼 수도 확대 그물 모양 단체와 작은 흠도로 큰 흠도을 보여주는 감염된 조직 내에 일반 세포 개발 사이클을 구현하는 것으로 나타났다. 그러나 혼자 형태학의 그림 repl 구별하는 데 충분하지 않습니다감소 신진 대사를 특징으로하고있다 icating과 지속적인 감염은 antimicrobials 10 저항을 증가했다. 감염된 나팔관에서 상피의 파괴는 C의 파괴에 어느 때문입니다 trachomatis - 세포 성장주기 및 전염성 초등 기관의 릴리스 또는 프로 염증성 크린 시토킨 8 릴리스의 완료 이후에 감염된 상피 세포. 병원체 유발 조직 손상와 C에 대한 호스트 유도된 면역 반응 trachomatis는 내피 세포 기능, fibroblast 리모델링 및 생체내 8,11의 마지막 튜발 불임의 손실로 이어지는 주요 요인 있어야합니다. 이 모델의 주요 한계 중 하나는 초기 C.에 보조 효과 분석을 hampers 염증 세포의 부재이다 난관의 상피의 trachomatis 감염. 그러나 모델은 AP이다서로 다른 환경 조건 (예 : 산소 함량) 및 급성 C.의 초기 호스트 면역 반응을 조사 propriate trachomatis 감염 8,9. 앞으로의 계획은 C.에 대한 antimicrobials의 테스트 모델을 확립하는 것입니다 모든 인간의 나팔관과 2 광자 레이저 스캐닝 현미경에 의해 민족인 상피에서 관찰 다른 발달 단계의 대사 상태를 특성화하는 trachomatis.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-8​​02 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 버퍼 SPG </td><td> 여러 </td><td></td><td> 아래의 제조법을 참조하십시오 </td></tr><tr><td> Monti의 정착액 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 아래의 제조법을 참조하십시오 </td></tr><tr><td> 나트륨 cacodylate 버퍼 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 아래의 제조법을 참조하십시오 </td></tr><tr><td> Richardson의 얼룩 </td><td> 여러 </td><td></td><td> 아래의 제조법을 참조하십시오 </td></tr></tbody></table> 조리법 : 1. 버퍼 SPG <ol><li> 75g의 자당을 추가합니다. </li><li> 2.47 g 나트륨 인산을 추가합니다. </li><li> 0.36 g monosodium 인산을 추가합니다. </li><li> 0.72 g glutamic 산을 추가합니다. </li><li> 아쿠아 이명 령과 1리터로 채웁니다. </li><li> 7.3로 산도를 조정합니다. </li></ol> 2. 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, 산도 7.35. <ol><li> 42.80 g dimethylarsenic 산 나트륨 소금을 추가합니다. </li><li> 68.46 g의 자당을 추가합니다. </li><li> 아쿠아 이명 령과 1리터로 채웁니다. 0.2 M 나트륨 cacodylate 버퍼를 얻으려고 말야. </li><li> 아쿠아 이명 령과 함께 묽은 용액을 사용하기 전에. 농도를 원하는과 7.35 필요한 경우에 산도를 조절합니다. </li></ol> 3. Monti의 정착액 <ol><li> 156 ML 0.12 M 나트륨 cacodylate 버퍼를 추가합니다. 3.2 아쿠아 dest 안에 25 ML 25% glutardialdehyde를 추가합니다. </li><li> 19 ML 추가아쿠아 dest 안에 10 % paraformaldehyde. </li><li> 아쿠아 이명 령에서 3 ML 3% CaCl 2를 추가합니다. </li><li> 7.35로 산도를 조절하고 아쿠아 이명 령으로 채운다. 312 ML 최후의 해결책합니다. </li></ol> 4. 리처드슨의 얼룩 <ol><li> 아쿠아 dest 안에 1% 수성 붕사 솔루션과 1% AZUR II의 1 % 메틸렌 블루의 동등한 부분을 섞는다. </li></ol>

조사를위한 인적 나팔관 모델<em&gt; c. trachomatis</em&gt; 감염

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

클라미디아의 trachomatis와 성기 요로 감염증 (C. trachomatis의) 전세계적으로 여성에서 가장 빈번한 전송 성적으로 질병입니다. 병원균의 비효율적인 통관이나 지속성은 상부 성기 요로의 감염을 오름차순과 감염된 조직의 1,2에 만성 염증성 손상을하기로되어 발생할 수 있습니다. 결과적으로 골반 염증성 질환 (PID), 투발의 폐색 및 불임 등의 심각한 임상 sequelae는 3,4가 발생할 수 있습니다. C.있는 연구의 대부분은 trachomatis는 상피 세포 라인 (예 : C 형 간염-2 세포 HELA-229)이나 생쥐에서 실시되었습니다. 그러나 셀 - 문화 기반 모델과 마찬가지로, 그들은 둘 다 기본 조직의 생리 기능이나 C의 pathophysiology을 반영하지 않습니다 생체내 5 trachomatis 성기 요로 감염증. 또한 한계는 사실에 의해 주어집니다 그 중앙 시그널링 폭포 (예 : IFN-γ mediat세포내 chlamydial 성장을 제어하는 에드 JAK / STAT 신호 경로)는 근본적으로 생쥐와 인간 6,7 사이에 다릅니다. 우리와 다른 그러므로 C. 간의 직접적인 상호 작용을 조사하기 위해 전체 장기 난관 모델을 확립 trachomatis와 인간 난관 세포의 전직 생체내 8,9. 이를 위해 자궁 적출술을받은 여성에서 인간의 나팔관은 C.으로 수집 감염되었다 24 H 포스트 감염 이내 trachomatis serovar 디 표본 어디 클라미디아의 trachomatis을 감지 스캔 전자 현미경 (SEM) 및 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용하면 상피 손상뿐만 아니라 중재 분석 C. 난관 조직의 trachomatis에 포함 형성.

우리에 대해 설명<em&gt; 예 생체내 감염</em인간 난관 세포와 세균 병원균에서 직접적인 상호 작용의 시각화를위한&gt; 모델입니다. 모든 장기 조직 모델은 조사를 설립<em&gt; C. trachomatis</em&quot;생명과 같은&quot;조건 하에서 여성의 난관에&gt; 유도 병리학.

조사를위한 인적 나팔관 모델<em&gt; C. trachomatis</em&gt; 감염

Chlamydia trachomatis(C. trachomatis)에 의한 생식기 감염은 전 세계 여성에게서 가장 빈번하게 발생하는 성매개 질환입니다. 비효율적인...

Chlamydia trachomatis는 그람 음성 절대 세포 내 기생 세균입니다. 안구 또는 생식기 감염을 유발하는 다양한 클라미디아 혈청형이 알려져 있습니다. Chlamydia trachomatis에 의한 생식기 감염은 전 세계적으로 가장 빈번하게 발생하는 성매개 질환입니다.이들은 1990년부터 2009년까지 유럽 연합에서 보고된 감염 건수가 거의 300만 건에 달하는 유병률을 보입니다. 2009년에는 거의 400,000건의 사례가 보고되었습니다. 공공 보건 및 성교육이 지속적으로 개선되고 있음에도 불구하고, 새로운 생식기 클라미디아 감염 사례가 1990년 70,000건에서 2009년 400,000건으로 증가하는 추세가 감지되었습니다.모든 신규 감염의 75%가 15세에서 24세 사이의 젊은 층에서 보고됩니다. 임상적 후유증은 병원균의 불충분한 제거로 인해 발생하는 것으로 추정되며, 이는 하부 생식기에서 상부 생식기로의 상행성 감염으로 이어져 결과적으로 감염된 조직에 만성 염증성 손상을 일으킬 수 있습니다. Chlamydia trachomatis에 감염된 여성의 10%에서 30%가 골반염(PID)을 앓으며, PID 사례의 최대 50%가 Chlamydia trachomatis 감염에 의한 것으로 알려져 있습니다.결과적으로, 난관 불임 환자의 50%와 자궁 외 임신 환자의 40%에서 클라미디아가 원인 병원균으로 발견됩니다. 감염되지 않은 건강한 여성의 경우, 수정란은 난관을 통해 자궁으로 이동하여 출산 시까지 발달합니다. 감염된 환자의 경우, 클라미디아가 하부 생식기에서 난관으로 상행하여 만성 염증 과정을 유발할 수 있습니다.병원균에 의해 유도된 상피 세포 손상과 중심 상피 세포 기능의 상실은 최종적으로 난관 폐쇄를 일으켜, 난소에서 자궁으로의 난자 이동을 감소시키거나 완전히 차단하는 원인이 되는 것으로 생각됩니다. 이를 위해 자궁 절제술을 받는 여성의 인간 난관을 수집하여 보관합니다. 수집된 난관은 절개하여 조심스럽게 엽니다.실험 설정에 따라, 이들은 작은 표본으로 절단되며 각각의 시점에 따라 24~48시간 동안 감염성 chlamydia tracheitis elementary bodies로 감염시킵니다. 표본은 추가 준비 단계 전까지 최소 3일 동안 Monty 고정액으로 고정합니다. 자궁 적출술을 받는 여성으로부터 얻은 인간 난관(HFT)은 수술 직후에 보관합니다.준비 전까지 항생제가 포함되지 않은 5% FCS 함유 RPMI 내에서 4°C로 보관하십시오. 전체 처리 과정 동안 항생제가 없는 5% FCS 함유 RPMI가 들어 있는 페트리 접시에서 인간 난관을 박리하십시오. 건조를 방지하기 위해 튜브를 배지로 잠기게 해야 하며, 결합 조직 및 수술 중 파손된 조직은 절단하여 제거하십시오.해부 후, 소형 메스로 HFT를 조심스럽게 엽니다. 포셉과 메스를 부주의하게 사용하여 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오. 감염을 위해 5x5 mm 크기로 조직 조각을 준비하고, 항생제가 포함되지 않은 5% FCS 함유 RPMI 1 mL에 HFT 검체를 보관하며 C track을 추가합니다.OMAS elementary bodies HFT 시료를 일반 배양기 내의 37 °C, 5%CO2 및 20%O2 조건 또는 저산소 챔버 내의 5%O2 미만인 저산소 환경에서 최대 48시간 동안 배양합니다. 각각의 배양 시간 경과 후, 시료를 수집하여 투과전자현미경(TEM) 또는 주사전자현미경(SEM) 준비 전까지 4 °C에서 최소 3일 동안 Monty's Fixative에 보관합니다. 고정된 조직을 작은 조각으로 절단하여 세척한 후, 1%osse 및 tetroxide와 함께 하룻밤 동안 배양합니다.여러 단계의 세척 및 건조 과정을 거친 후, 탈수된 시료를 새로 준비한 aite에 옮겨 60 °C에서 48시간 동안 중합시킵니다. 트리밍 후, 세미-씬(semi-thin) 및 울트라-씬(ultra-thin) 섹션을 절단하여 각각 슬라이드 또는 그리드에 옮깁니다. 염색 후, 세미-씬 섹션을 광학 현미경으로 관찰하여 투과 전자 현미경 관찰 부위를 확인합니다.시료를 Monty 고정액에서 꺼내어 최대 2 x 2 x 5 mm 크기의 조각으로 절단합니다. 세척, sodium CCO 희석 버퍼 배양, 오스뮴 테트라옥사이드 세척, 탈수 및 에탄올 농도 구배 처리를 거친 후, 시료를 50% propylene oxide와 aite 혼합액에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, 새로 준비한 aite로 옮겨 최소 1시간 동안 둡니다.그런 다음 평평한 몰드로 옮겨 aite로 채운 뒤 60 °C에서 48시간 동안 aerd dite를 중합시킵니다. 임베딩된 샘플을 다듬은 후, 유리 나이프 또는 가급적 다이아몬드 나이프가 장착된 울트라 마이크로톰을 사용하여 약 700 nm의 세미-씬 섹션(semi thin section) 또는 70 nm의 울트라-씬 섹션(ultra thin section)으로 절편을 만듭니다. 세미-씬 및 울트라-씬 섹션은 광학 현미경과 투과 전자 현미경으로 시편을 분석하며, 주사 전자 현미경으로도 분석합니다.시료는 상피 세포가 위를 향하도록 코르크 판에 고정하며, 농도가 점차 증가하는 아세톤을 사용하여 세척 및 탈수합니다. 임계점 건조기로 건조한 후, 시료를 SEM 시료 마운트로 옮기고 스퍼터 코더를 사용하여 백금, 금 또는 팔라듐으로 코팅합니다. 그러면 주사 전자 현미경 분석을 위한 준비가 완료됩니다.검체를 Monty 고정액에서 꺼내어, 상피 조직이 위를 향하도록 코르크 시트 위에 놓고 곤충 핀으로 위치를 고정합니다. sodium caco dilate 완충액으로 세척하고 아세톤 처리한 후, 임계점 건조기(critical point dryer)를 사용하여 검체를 건조합니다. 검체를 코르크에서 SEM 시편 거치대로 옮긴 후, 스퍼터 코터(sputter coater)를 사용하여 검체에 전도성 백금-금 또는 팔라듐 코팅을 수행합니다. 코팅된 검체를 주사전자현미경(scanning electron microscope)으로 옮겨 추가 분석을 진행합니다.여성에게서 나타나는 높은 빈도의 자궁경부 감염률과 상행성 감염으로 인한 막대한 임상적 결과는 이 분야의 기초 및 중개 연구를 강화해야 하는 근거가 됩니다. 본 연구진은 St. Perus 그룹이 이전에 확립한 인간 난관의 ex vivo 조직 모델을 활용하여 난관 내에서 클라미디아에 의해 유도된 세포 손상을 형태학적으로 분석하였습니다. 이 방법을 통해 복제 및 지속성 감염이 모두 관찰되었으며, 세포 내 봉입체의 형성이 다양한 발달 단계에서 확인되었습니다.하지만 인간 난관 조직 내에 지속성 클라미디아가 존재한다는 실험적 증거는 여전히 부족하며, 클라미디아, 자손 및 지속성 유전자의 전사 상향 조절에 대한 추가 분석이 필요합니다. 이 모델의 주요 한계 중 하나는 염증 세포가 없다는 점이며, 이는 초기 KLA 글라우코마 감염으로 인한 2차 영향 분석을 어렵게 만듭니다. 그럼에도 불구하고, 이 모델은 난관 상피 세포 손상 맥락에서의 산소 함량과 같은 환경 조건을 분석하고, 급성 글라우코마 감염에 대한 초기 숙주 면역 반응을 분석하는 데 적절한 것으로 보입니다.향후 목표 중 하나는 pH 인간 난관 조직 모델에서 CTU의 MIC 테스트를 위한 더 정교한 모델을 구축하고, 이 모델을 사용하여 이광자 레이저 주사 현미경 기술을 통해 CLI의 서로 다른 발달 단계를 대사적으로 명확히 정의하는 것입니다.

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