Name: 인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 학습하세요 인간 배아 신장 293T 세포를 이용한 분비 단백질 발현 방법을. 이 기술은 재조합 단백질을 효율적으로 생산하고 대규모 확장이 가능하여 구조 및 기능 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 HA, FCA, 그리고 JDC에 온타리오 에이즈 치료 네트워크 연구 운영 그랜트 (로저-G645) 및 보건 연구 새로운 탐정 수상 (MSH-113554)의 캐나다 연구소 JEL까지, 토론토 장학금의 대학에 의해 지원되었다. 저자 제공 세포, ebolavirus GP의 발현 벡터 및 일반 조언 스크립스 연구소 (라 Jolla, CA)에서 마니 Fusco, Dafna 아벨 박사 에리카 Ollmann Saphire 감사드립니다.

<ol><li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li>
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<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
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<li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
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<li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression%3A+developments+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li>
<li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li>
<li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li>
<li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha%2C+beta%2C+and+gammac+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

10 층 전지 공장 단백질 밀리그램 양의 생산을위한 효과적인 선박입니다. 이러한 롤러 병, 흔들 flasks 또는 회전자 flasks 같은 다른 전통적인 혈관, 이상 세포 공장 사용의 가장 큰 장점은 추가적인 실험실 장비의 구입을 요구하지 않는다는 것입니다. 표준 CO 2 배양기는 (~ 6.0 세제곱. 피트) 쉽게 사 10 층 전지 공장 (그림 2)를 수용합니다. 또한, 이러한 혈관 요리 flasks 또는 세포와 단백질을 생산하기 위해 롤러 병보다 적은 노동과 공간을 필요로, 한 100 레이어 전지 공장은 7.5 일반 롤러 병 (표 1)를 사용하는 것과 동일합니다. 더 중요한 건, HEK 293T 세포는 혈관에 잘 적응하기 때문에 상업적인 transfection의 시약으로 적은 비용과 효과적인 옵션을 제공 PEI에 의한 일시적인 transfection에 매우 의무가 있습니다. 전지 공장은 일회용 세포 배양 plasticware되도록 설계하고 있지만...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 알칼리 인산 분해 효소 (BCIP / NBT) 액체 기판 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycotic / 항생제, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 HA 친화력 매트릭스, 클론 3F10 </td><td> 로슈 </td><td> 1,815,016 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 HA murine mAb, 클론 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 플라스크는 T75 cm이 조직 문화는 치료 </td><td> 코닝 </td><td> 430,641 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 플라스크는 T225 cm이 조직 문화는 치료 </td><td> 코닝 </td><td> 431,082 </td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시는, 6 잘 조직 문화 처리 </td><td> 코닝 </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 공장, 10 층 CellSTACK </td><td> 코닝 </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate 오메가 5K 카세트 </td><td> 물리다 </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate 오메가 30K 카세트 </td><td> 물리다 </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> 크로마 토그래피 유리 칼럼, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> * 시프 로플 록 사신 </td><td> 시그마 </td><td> 17,850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정된 독수리의 미디어 (DMEM) </td><td> 시그마 </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS), inactivated 열 </td><td> Invitrogen </td><td> 일2484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE의 HD transfection 시약 </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice의 transfection 시약 </td><td> EMD / 머크 </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 시그마 </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> 알칼리 염소 안티 - 마우스 IgG F (AB &#39;) 2 </td><td> 써모 과학 </td><td> 31,324 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 가수 분해 효소 - 복합 항체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 적혈구응집소 (HA) 펩타이드, 100 밀리그램 </td><td> Genscript </td><td> 맞춤형 합성 </td><td></td></tr><tr><td> (순서 : YPYDVPDYA, 95 % 순도) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> HouseholD 표백제 (4 % W / V 나트륨 차아 염소 산염) </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF 멤브레인 </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep 플라스미드 정제 키트, PureLink 빠른 </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep 플라스미드 정제 키트, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> 난이 3 </td><td> 시그마 </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY의 발현 벡터 </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> 100X 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (펜 / strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 식염수 (PBS), 무균 1X </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethyleneimine (PEI), 선형 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23,966 </td><td></td></tr><tr><td> 우유 건조 분말 탈지 </td><td> 카네이션 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP PES 진공 여과 장치, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 μm의, 500 ML 용량 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypan 블루 </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.05 % (W / V) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반-20 </td><td> 시그마 </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> Valproic 산성 </td><td> 시그마 </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> 접선 흐름 시스템을 Centramate </td><td> 물리다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 humidified 인큐베이터, 표준 6.0 세제곱. 피트 </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 전기 및 전송 장치 </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 보육, 37 ° C </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

세균에서 재조합 단백질 발현, 일반적으로 E. 대장균은 단백질의 밀리그램 수량 표현을위한 가장 성공적인 전략이었습니다. 그러나, prokaryotic 호스트는 종종 박테리아 특히 공동 또는 사후 translational 수정의 부족으로 인해 인간, 바이러스성 또는 진핵세포 외국 macromolecule의 독성으로 인해 단백질, 단백질 폴딩 기계의 차이, 또는 표현에 따라 않습니다. 효모 (P.의 pastoris 혹은 S. cerevisiae의) 1,2, baculovirus에 감염된 곤충 (S. frugiperda 또는 T. NI) 셀 3, 체외 번역 시스템의 셀 - 무료를 기반으로 표현 시스템은 2,4가 성공적으로 사용되었습니다 포유 동물 단백질을 생산하고 있습니다. 직관적으로, 최고의 경기는 적절한 사후 translational 개조를 포함하는 재조합 단백질의 생산을 보장하기 위해 포유류의 호스트를 사용하는 것입니다. 포유 동물 세포 라인 (인간 배아 키즈의 숫자네이 (HEK) 293은 S V40 larget T-항원 (COS), 중국 햄스터 난소 (CHO), 그리고 다른 사람을 운반 O rigin에서 C V-1 세포)가 성공적으로 인간 단백질 개수 밀리그램 수량 overexpress 위해 활용되었습니다 5-9. 그러나 포유 동물 세포를 사용의 이점은 주로 안정적인 표현 세포 라인을 개발하기 위해 높은 비용, 전문 실험실 장비의 요구 사항, 낮은 단백질 수율, 그리고 긴 시간으로 반박하고 있습니다. 적은 비용을 유지하면서, 빠른 수율 및 생산 단백질의 증가, 많은 학술 및 상업 실험실을위한 주요 요소입니다. 여기서는 시간과 점착 성의 HEK 293T 세포에서 분비 인간 단백질의 표현을위한 비용 효율적인 두 부분으로 절차를 설명합니다. 이 시스템은 구조적 biophysical 및 생화 학적 연구를위한 기능성 단백질의 밀리그램 수량에 마이크로 그램 제작이 가능합니다. 첫 번째 부분은 관심있는 유전자의 여러 구조는 생산이다병렬 및 transiently 작은 규모의 점착 성의 HEK 293T 세포로 transfected에서 D. 세포 배양 배지로 분비 재조합 단백질의 검출 및 분석은 벡터 인코딩된 단백질 정제 태그 향한 상용화된 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석에 의해 수행됩니다. 그 후, 대규모 단백질 생산에 적합한 구조는 transiently 10 층 전지 공장에서 polyethyleneimine (PEI)를 사용 transfected 있습니다. 에어컨 매체의 리터 - 볼륨으로 분비 단백질은 안티 - HA 친화성 크로마 토그래피에 의해 정제 다음에 접선 유동 여과를 사용하여 관리 가능한 금액으로 집중되고있다. 이 플랫폼의 유틸리티는 크린 시토킨, 시토킨 수용체, 세포 표면 수용체, 본질적인 제한 요인과 바이러스 glycoproteins의 밀리그램 수량을 표현하는 기능에 의해 입증된다. 이 방법은 또한 성공적으로 trimeric ebolavirus의 당단백질의 5,10의 구조 결정에 사용되었다. 2 배양기 이외의 추가적인 장비는, 필요하지 않습니다. 이 절차는 신속하게 이러한 단백질 단지, 항원과 항체, 백신 생산을위한 바이러스 같은 입자, 또는 어려운 셀 라인 도입에 대해 adenoviruses 또는 lentiviruses 생산의 공동 표현과 같은 큰 복잡한 체제를 지원하기 위해 확장할 수 있습니다.

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

일반적으로 E. coli를 이용한 박테리아 내 재조합 단백질 발현은 밀리그램 단위의 단백질 발현을 위한 가장 성공적인 전략이었습니다. ...

본 영상에서는 HEK 293T 세포로부터 분비 단백질을 발현시키기 위한 시간 및 비용 효율적인 절차를 설명합니다. 우선, 6-well 플레이트에 40% 합류도를 갖는 HEK 293T 세포 배양액을 준비합니다. 그 다음, 무혈청 배지에서 GeneJuice와 테스트 플라스미드를 희석하여 transfection 혼합물을 제조합니다.형질전환 혼합물을 세포 위에 분주하고, 단백질 발현을 위해 37 °C에서 배양합니다. 상층액 내 단백질 검출은 western blot을 통해 수행할 수 있습니다. 적절한 컨스트럭트가 확인되면, 10층 세포 공장(cell factory)을 사용하여 공정을 확장할 수 있습니다.PEI를 transfection 시약으로 사용하여 세포를 transfection합니다. 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 후 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 배양 상청액에서 단백질을 수확할 수 있습니다. 궁극적으로, 이 플랫폼을 통해 광범위한 거대분자를 밀리그램 단위의 양으로 발현시킬 수 있습니다.이 기술이 balo virus 기반 곤충 세포 발현과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 수많은 컨스트럭트를 스크리닝하고 발현을 위해 스케일업 할 수 있으며, 단 3주 만에 결과를 얻을 수 있다는 점입니다. 이 절차의 시연은 제 연구실의 대학원생 세 명인 Hello Aiden, Shada Zini, Jonathan Cook이 진행하겠습니다. 먼저 6-웰 플레이트의 웰당 1 mL 부피에 HEC 2 9 3 T 세포 250,000개를 분주하는 것으로 시작합니다. 웰당 10% FBS와 pentre가 보충된 DMEM 1 mL를 추가하고, 플레이트를 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다.그런 다음 37°C의 습윤한 5% 이산화탄소 배양기에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 세포의 합류도가 약 40%에 도달하면, transfection 혼합물을 준비하기 위해 상층액을 2 mL의 신선한 배지로 교체합니다. 먼저 90 µL의 무혈청 DMEM을 원심분리 튜브에 분주합니다.그런 다음 transfection 시약인 gene juice 3 µL를 첨가하고 튜브의 내용물을 부드럽게 혼합한 후 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, transfection할 mini prep 정제 plasmid DNA의 100 ng/µL 스톡액 10 µL를 첨가합니다.튜브의 내용물을 혼합하고 실온

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연구

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생물학

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