Name: 인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 학습하세요 인간 배아 신장 293T 세포를 이용한 분비 단백질 발현 방법을. 이 기술은 재조합 단백질을 효율적으로 생산하고 대규모 확장이 가능하여 구조 및 기능 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 HA, FCA, 그리고 JDC에 온타리오 에이즈 치료 네트워크 연구 운영 그랜트 (로저-G645) 및 보건 연구 새로운 탐정 수상 (MSH-113554)의 캐나다 연구소 JEL까지, 토론토 장학금의 대학에 의해 지원되었다. 저자 제공 세포, ebolavirus GP의 발현 벡터 및 일반 조언 스크립스 연구소 (라 Jolla, CA)에서 마니 Fusco, Dafna 아벨 박사 에리카 Ollmann Saphire 감사드립니다.

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<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li>
<li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li>
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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

10 층 전지 공장 단백질 밀리그램 양의 생산을위한 효과적인 선박입니다. 이러한 롤러 병, 흔들 flasks 또는 회전자 flasks 같은 다른 전통적인 혈관, 이상 세포 공장 사용의 가장 큰 장점은 추가적인 실험실 장비의 구입을 요구하지 않는다는 것입니다. 표준 CO 2 배양기는 (~ 6.0 세제곱. 피트) 쉽게 사 10 층 전지 공장 (그림 2)를 수용합니다. 또한, 이러한 혈관 요리 flasks 또는 세포와 단백질을 생산하기 위해 롤러 병보다 적은 노동과 공간을 필요로, 한 100 레이어 전지 공장은 7.5 일반 롤러 병 (표 1)를 사용하는 것과 동일합니다. 더 중요한 건, HEK 293T 세포는 혈관에 잘 적응하기 때문에 상업적인 transfection의 시약으로 적은 비용과 효과적인 옵션을 제공 PEI에 의한 일시적인 transfection에 매우 의무가 있습니다. 전지 공장은 일회용 세포 배양 plasticware되도록 설계하고 있지만...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 알칼리 인산 분해 효소 (BCIP / NBT) 액체 기판 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> B6404 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycotic / 항생제, 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240062 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 HA 친화력 매트릭스, 클론 3F10 </td><td> 로슈 </td><td> 1,815,016 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 HA murine mAb, 클론 16B12 </td><td> Covance </td><td> MMS-101P </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 플라스크는 T75 cm이 조직 문화는 치료 </td><td> 코닝 </td><td> 430,641 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 플라스크는 T225 cm이 조직 문화는 치료 </td><td> 코닝 </td><td> 431,082 </td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시는, 6 잘 조직 문화 처리 </td><td> 코닝 </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 공장, 10 층 CellSTACK </td><td> 코닝 </td><td> 3312 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate 오메가 5K 카세트 </td><td> 물리다 </td><td> OS005C12 </td><td></td></tr><tr><td> Centramate 오메가 30K 카세트 </td><td> 물리다 </td><td> OS030C12 </td><td></td></tr><tr><td> 크로마 토그래피 유리 칼럼, 1.0x10 cm </td><td> Kontes </td><td> 4204001010 </td><td></td></tr><tr><td> * 시프 로플 록 사신 </td><td> 시그마 </td><td> 17,850 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정된 독수리의 미디어 (DMEM) </td><td> 시그마 </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS), inactivated 열 </td><td> Invitrogen </td><td> 일2484-028 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE의 HD transfection 시약 </td><td> Promega </td><td> 4709691001 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJuice의 transfection 시약 </td><td> EMD / 머크 </td><td> 70967-6 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> 시그마 </td><td> G8898 </td><td></td></tr><tr><td> 알칼리 염소 안티 - 마우스 IgG F (AB &#39;) 2 </td><td> 써모 과학 </td><td> 31,324 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 가수 분해 효소 - 복합 항체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 적혈구응집소 (HA) 펩타이드, 100 밀리그램 </td><td> Genscript </td><td> 맞춤형 합성 </td><td></td></tr><tr><td> (순서 : YPYDVPDYA, 95 % 순도) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEK 293T 세포 </td><td> ATCC </td><td> CRL-11268 </td><td></td></tr><tr><td> HouseholD 표백제 (4 % W / V 나트륨 차아 염소 산염) </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobilon-P PVDF 멤브레인 </td><td> Millipore </td><td> IPVH07850 </td><td></td></tr><tr><td> MiniPrep 플라스미드 정제 키트, PureLink 빠른 </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-11 </td><td></td></tr><tr><td> MaxiPrep 플라스미드 정제 키트, PureLink HiPure </td><td> Invitrogen </td><td> K2100-07 </td><td></td></tr><tr><td> 난이 3 </td><td> 시그마 </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> pDISPLAY의 발현 벡터 </td><td> Invitrogen </td><td> V660-20 </td><td></td></tr><tr><td> 100X 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (펜 / strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 식염수 (PBS), 무균 1X </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethyleneimine (PEI), 선형 25 kDa </td><td> Polyscience </td><td> 23,966 </td><td></td></tr><tr><td> 우유 건조 분말 탈지 </td><td> 카네이션 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stericup-GP PES 진공 여과 장치, </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 μm의, 500 ML 용량 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypan 블루 </td><td> Invitrogen </td><td> 15250061 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.05 % (W / V) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반-20 </td><td> 시그마 </td><td> P7949 </td><td></td></tr><tr><td> Valproic 산성 </td><td> 시그마 </td><td> P4543 </td><td></td></tr><tr><td> 접선 흐름 시스템을 Centramate </td><td> 물리다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 humidified 인큐베이터, 표준 6.0 세제곱. 피트 </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 전기 및 전송 장치 </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 보육, 37 ° C </td><td> 다양한 브랜드가 있습니다 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

세균에서 재조합 단백질 발현, 일반적으로 E. 대장균은 단백질의 밀리그램 수량 표현을위한 가장 성공적인 전략이었습니다. 그러나, prokaryotic 호스트는 종종 박테리아 특히 공동 또는 사후 translational 수정의 부족으로 인해 인간, 바이러스성 또는 진핵세포 외국 macromolecule의 독성으로 인해 단백질, 단백질 폴딩 기계의 차이, 또는 표현에 따라 않습니다. 효모 (P.의 pastoris 혹은 S. cerevisiae의) 1,2, baculovirus에 감염된 곤충 (S. frugiperda 또는 T. NI) 셀 3, 체외 번역 시스템의 셀 - 무료를 기반으로 표현 시스템은 2,4가 성공적으로 사용되었습니다 포유 동물 단백질을 생산하고 있습니다. 직관적으로, 최고의 경기는 적절한 사후 translational 개조를 포함하는 재조합 단백질의 생산을 보장하기 위해 포유류의 호스트를 사용하는 것입니다. 포유 동물 세포 라인 (인간 배아 키즈의 숫자네이 (HEK) 293은 S V40 larget T-항원 (COS), 중국 햄스터 난소 (CHO), 그리고 다른 사람을 운반 O rigin에서 C V-1 세포)가 성공적으로 인간 단백질 개수 밀리그램 수량 overexpress 위해 활용되었습니다 5-9. 그러나 포유 동물 세포를 사용의 이점은 주로 안정적인 표현 세포 라인을 개발하기 위해 높은 비용, 전문 실험실 장비의 요구 사항, 낮은 단백질 수율, 그리고 긴 시간으로 반박하고 있습니다. 적은 비용을 유지하면서, 빠른 수율 및 생산 단백질의 증가, 많은 학술 및 상업 실험실을위한 주요 요소입니다. 여기서는 시간과 점착 성의 HEK 293T 세포에서 분비 인간 단백질의 표현을위한 비용 효율적인 두 부분으로 절차를 설명합니다. 이 시스템은 구조적 biophysical 및 생화 학적 연구를위한 기능성 단백질의 밀리그램 수량에 마이크로 그램 제작이 가능합니다. 첫 번째 부분은 관심있는 유전자의 여러 구조는 생산이다병렬 및 transiently 작은 규모의 점착 성의 HEK 293T 세포로 transfected에서 D. 세포 배양 배지로 분비 재조합 단백질의 검출 및 분석은 벡터 인코딩된 단백질 정제 태그 향한 상용화된 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석에 의해 수행됩니다. 그 후, 대규모 단백질 생산에 적합한 구조는 transiently 10 층 전지 공장에서 polyethyleneimine (PEI)를 사용 transfected 있습니다. 에어컨 매체의 리터 - 볼륨으로 분비 단백질은 안티 - HA 친화성 크로마 토그래피에 의해 정제 다음에 접선 유동 여과를 사용하여 관리 가능한 금액으로 집중되고있다. 이 플랫폼의 유틸리티는 크린 시토킨, 시토킨 수용체, 세포 표면 수용체, 본질적인 제한 요인과 바이러스 glycoproteins의 밀리그램 수량을 표현하는 기능에 의해 입증된다. 이 방법은 또한 성공적으로 trimeric ebolavirus의 당단백질의 5,10의 구조 결정에 사용되었다. 2 배양기 이외의 추가적인 장비는, 필요하지 않습니다. 이 절차는 신속하게 이러한 단백질 단지, 항원과 항체, 백신 생산을위한 바이러스 같은 입자, 또는 어려운 셀 라인 도입에 대해 adenoviruses 또는 lentiviruses 생산의 공동 표현과 같은 큰 복잡한 체제를 지원하기 위해 확장할 수 있습니다.

이후 인간 게놈 시대에 원시 conformations에서 재조합 단백질의 가용성은 구조적 기능적 및 치료 연구와 개발에 매우​​ 중요합니다. 여기서는 테스트 및 재조합 단백질의 다양한 생산하는 데 사용할 수있는 인간의 배아 신장 293T 세포에 대규모 단백질 발현 시스템을 설명합니다.

일반적으로 E. coli를 이용한 박테리아 내 재조합 단백질 발현은 밀리그램 단위의 단백질 발현을 위한 가장 성공적인 전략이었습니다. ...

본 영상에서는 HEK 293T 세포로부터 분비 단백질을 발현시키기 위한 시간 및 비용 효율적인 절차를 설명합니다. 우선, 6-well 플레이트에 40% 합류도를 갖는 HEK 293T 세포 배양액을 준비합니다. 그 다음, 무혈청 배지에서 GeneJuice와 테스트 플라스미드를 희석하여 transfection 혼합물을 제조합니다.형질전환 혼합물을 세포 위에 분주하고, 단백질 발현을 위해 37 °C에서 배양합니다. 상층액 내 단백질 검출은 western blot을 통해 수행할 수 있습니다. 적절한 컨스트럭트가 확인되면, 10층 세포 공장(cell factory)을 사용하여 공정을 확장할 수 있습니다.PEI를 transfection 시약으로 사용하여 세포를 transfection합니다. 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 후 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 배양 상청액에서 단백질을 수확할 수 있습니다. 궁극적으로, 이 플랫폼을 통해 광범위한 거대분자를 밀리그램 단위의 양으로 발현시킬 수 있습니다.이 기술이 balo virus 기반 곤충 세포 발현과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 수많은 컨스트럭트를 스크리닝하고 발현을 위해 스케일업 할 수 있으며, 단 3주 만에 결과를 얻을 수 있다는 점입니다. 이 절차의 시연은 제 연구실의 대학원생 세 명인 Hello Aiden, Shada Zini, Jonathan Cook이 진행하겠습니다. 먼저 6-웰 플레이트의 웰당 1 mL 부피에 HEC 2 9 3 T 세포 250,000개를 분주하는 것으로 시작합니다. 웰당 10% FBS와 pentre가 보충된 DMEM 1 mL를 추가하고, 플레이트를 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다.그런 다음 37°C의 습윤한 5% 이산화탄소 배양기에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 세포의 합류도가 약 40%에 도달하면, transfection 혼합물을 준비하기 위해 상층액을 2 mL의 신선한 배지로 교체합니다. 먼저 90 µL의 무혈청 DMEM을 원심분리 튜브에 분주합니다.그런 다음 transfection 시약인 gene juice 3 µL를 첨가하고 튜브의 내용물을 부드럽게 혼합한 후 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, transfection할 mini prep 정제 plasmid DNA의 100 ng/µL 스톡액 10 µL를 첨가합니다.튜브의 내용물을 혼합하고 실온에서 15분 동안 방치합니다. transfection을 수행하려면 혼합물을 HEC 2 9 3 T 세포 위에 분주합니다. transfection 혼합물이 균일하게 퍼지도록 플레이트를 부드럽게 흔들며 한 방울씩 떨어뜨립니다.그 다음 세포를 37°C에서 배양합니다. 24시간 후에 각 웰에 1 mL의 신선한 배지를 추가하고 48시간 동안 더 배양합니다. 형질전환 3일 후, 상층액을 수확하고 웨스턴 블롯을 통해 표적 단백질의 발현 수준을 검출합니다.적절한 컨스트럭트(construct)가 확인되면, 트랜스펙션(transfection) 절차의 규모를 확대할 수 있습니다. 10층 셀 팩토리(cell factory)를 사용하여, 5% FBS가 보충된 DMEM 1.2리터를 셀 팩토리에 채웁니다. 그런 다음 2억 개의 HEC 2 9 3 T 세포를 모든 층에 균일하게 분산시켜 추가합니다.100% 밀도로 배양된 225 cm² T-플라스크 4개에는 약 2억 개의 세포가 포함되어 있습니다. 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 840 µg의 DNA를 84 mL의 멸균 1× PBS에 희석하여 T 75 플라스크에 transfection 혼합물을 준비하십시오.1 mg/mL 농도의 폴리에틸렌이민(polyethylene imine) 용액 또는 PEI 2.5 milliliters를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 용액이 탁해져야 합니다. 다음으로, 트랜스펙션 혼합물을 셀 팩토리(cell factory)에 천천히 붓고 골고루 분산시킵니다.전체 층. 최종 농도가 4 mM이 되도록 발프로산(valproic acid)을 첨가합니다. 이는 트랜스펙션 혼합물을 첨가한 후 발현 수율을 높여줍니다.단백질 발현을 위해 배양물을 37 °C에서 4일 동안 배양합니다. transfection 후 4일째에 배지를 수확하고, 재사용을 위해 즉시 cell factory를 세척합니다. 수집한 배지를 4 °C에서 6,000 G로 30분 동안 원심 분리하고, 0.22 micron steric cup vacuum filter 장치를 통해 여과하여 모든 입자성 물질을 제거합니다. 그런 다음 centra mate tangential flow filtration 시스템을 사용하여 상층액을 75 mL로 농축합니다.상층액을 농축한 후, 친화성 크로마토그래피를 통해 목적 단백질을 정제할 수 있습니다. 본 실험에서는 여기에 기술된 대규모 시스템을 사용하여 인간 AAL two 수용체 세포외 도메인의 HA 태그 부착 서브유닛을 정제하였으며, 이어서 고친화성 anti-HA 크로마토그래피를 수행하였습니다. 이는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 분석 결과에서 확인할 수 있습니다.인터루킨 2 수용체 알파 및 감마 서브유닛의 세포외 도메인은 각각 40 kilodaltons 및 46 kilodaltons의 분자량으로 이동합니다. IL two R alpha 및 IL two R gamma에 존재하는 EnLink 글리칸의 불균일성으로 인해 SDS page 젤에서 밴드 확장 현상이 나타났습니다. 더 높은 분자량의 밴드는 오염된 BSA를 나타냅니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 10층 셀 팩토리를 사용하여 인간 세포 배양으로부터 단백질을 발현시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. HEK 293 T 세포는 생물학적 위험 물질로 간주되므로 생물안전등급 2(biosafety level two)에서 취급해야 함을 잊지 마십시오. 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용해야 하며, 표면 소독은 기관 및 정부 지침에 따라 수행해야 합니다.

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연구

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신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

포유류 시스템에 의한 재조합 단백질의 발현은 구조 생물학을 위한 단백질 복합체를 생산하는 매력적인 방법이 되고 있습니다. 여기에서 우리는 구조 연구를 위해 단백질 복합체를 정제하기 위해 현탁액 성장 포유류 세포를 사용하는 간단하면서도 매우 효율적인 발현 시스템을 제시합니다.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

여기에서는 순수하고 완전히 글리코실화되었으며 효소 활성 프로테아제를 높은 수율로 생산하는 HEK293T 세포를 사용하는 비용 효율적인 그랜자임 발현 시스템을 설명합니다.

포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템

이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

학습하세요 인간 배아 신장 293T 세포를 이용한 분비 단백질 발현 방법을. 이 기술은 재조합 단백질을 효율적으로 생산하고 대규모 확장이 가능하여 구조 및 기능 연구에 필수적입니다.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

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