인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

이 비디오에서는 만들어진 Durant HEC 2 9 3 T 세포에서 분비된 단백질을 발현하기 위한 시간 및 비용 효율적인 절차에 대해 설명합니다. 초기에는 40% Cofluent HEC 2 9 3 T 세포 배양액을 6개의 월드 플레이트에서 준비합니다. 그런 다음 유전자 주스를 희석하여 형질주입 혼합물을 생성한 다음 무혈청 배지에서 플라스미드를 테스트합니다.

형질주입(transfection) 혼합물을 세포에 증착한 다음, 섭씨 37도에서 배양하여 단백질 발현을 가능하게 합니다. 수판제에서 단백질의 검출은 웨스턴 블롯으로 수행할 수 있습니다. 적절한 구조가 확인되면 10개의 레이어 셀 팩토리를 사용하여 절차를 확장할 수 있습니다.

세포는 PEI를 형질주입으로 사용하여 형질주입됩니다. 시약과 단백질은 접선 유동 여과 후 친화성 크로마토그래피를 사용하여 배양 상등액에서 수확할 수 있습니다. 궁극적으로 이 플랫폼은 광범위한 거대분자를 밀리그램 양으로 발현할 수 있습니다.

balo 바이러스 기반 곤충 세포 발현과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 구조체를 스크리닝하고 발현을 위해 확장할 수 있으며 3주 만에 결과를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 Shada Zini와 Jonathan Cook의 Hello Aiden입니다. 내 연구실의 대학원생 3 명은 6 개의 웰 플레이트에 1 밀리리터의 부피로 웰 당 250, 000 HEC 2, 9, 3 T 세포를 파종하는 것으로 시작하고, 10 % FBS pentre, 보충제 DMEM 및 S swir의 웰 당 1 밀리리터를 추가하여 세포를 고르게 분산시킵니다.

그런 다음 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 세포가 약 40%의 유창성에 도달하면 SUP natum을 2ml의 새로운 배지로 교체하여 transfection 혼합물을 준비합니다. 먼저 90마이크로리터의 무혈청 DMEM을 엔드 고아관에 분취합니다.

그런 다음 3마이크로리터의 유전자 주스를 첨가하고, 트랜스펙션 시약이 튜브의 내용물을 부드럽게 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 10 마이크로 리터 당 100 나노 그램의 미니 분취 정제 플라스미드 DNA를 추가합니다. 트랜스펙션됩니다.

튜브의 내용물을 섞어 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다. transfection을 수행하려면 혼합물을 HEC 2 9 3 T 세포에 증착합니다. 한 방울 한 방울 플레이트를 부드럽게 팽창시켜 transfection 혼합물을 고르게 분배합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 24시간 후, 각 웰에 1ml의 신선한 배지를 추가하고 추가로 48시간 동안 배양합니다. transfection 3일 후, supinate를 수확하고 western blot에 의해 관심 단백질의 발현 수준을 검출합니다.

적절한 구조가 확인되면 transfection 절차를 확장할 수 있습니다. 10개의 레이어 셀 공장을 사용하여 5%FBS가 보충된 1.2리터 DMEM으로 셀 공장을 채웁니다. 그런 다음 2억 개의 HEC 2 9 3 T 세포를 추가하여 세포를 모든 층에 고르게 분포시킵니다.

100% Co 유창성으로 성장한 4개의 T 225cm 정사각형 세포 배양 플라스크에는 약 2억 개의 세포가 포함되어 있습니다. 세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 840 마이크로그램의 DNA를 84 밀리리터의 멸균 용액에 1회 희석하여 T 75 플라스크에 형질 주입 혼합물을 준비합니다. PBS입니다.

2.5 밀리리터 당 1 밀리리터, 폴리에틸렌 이온 용액 또는 PEI를 첨가하고 혼합물을 실온에서 15 분 동안 배양합니다. 솔루션이 흐려져야 합니다. 다음으로, transfection 혼합물을 cell factory에 천천히 붓고 철저히 분배합니다.

전체 레이어. 최종 농도인 4밀리몰에서 발프로산을 첨가합니다. 이는 transfection 혼합물이 추가되면 발현 수율을 증가시킵니다.

단백질 발현을 위해 섭씨 37도에서 4일 동안 배양합니다. transfection 후에 4 일 매체를 가을걷이하고 즉각 재사용을 위한 세포 공장을 청소하고, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 6, 000 G에 모은 매체를 원심 분리기하고 어떤 미립자 물질든지 제거하기 위하여 0.22 미크론 입체 컵 진공 여과기 기구를 통해서 거른다. 그런 다음 centra mate 접선 흐름 여과 시스템을 사용하여 상층액을 75ml로 농축합니다.

상등액이 농축되면 관심 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있습니다. 이 실험에서는 여기에 설명된 대규모 시스템을 사용하여 인간 AAL 2개 수용체 세포 외 도메인의 HA tached subunit을 정제한 다음 고친화성 anti THA 크로마토그래피를 정제했습니다. 이 kumasi 염색 SDS 페이지 분석에서 볼 수 있듯이.

인터루킨 2 수용체 알파 및 감마 소단위의 세포 외 도메인은 40 킬로달톤과 46 킬로달톤의 분자량으로 이동합니다. IL 2 R 알파 및 IL 2 R 감마에 존재하는 EnLink 글라이칸의 이질성은 SDS 페이지 겔에서 띠 확장을 일으켰습니다. 분자량 대역이 높을수록 BSA가 오염되었음을 나타냅니다.

이 동영상을 시청한 후에는 10개의 레이어 세포 팩토리를 사용하여 인간 세포 배양에서 단백질을 발현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. HC 2 93 T 세포는 생물학적 유해성으로 간주되며 생물 안전성 레벨 2에서 처리해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 항상 적절한 개인 보호복을 착용하고 기관 및 정부 지침에 따라 표면을 소독해야 합니다.