바이오 - 래드 총 RNA 키트를 사용 Neuroprecursor 셀에서 RNA 추출

안녕하세요, 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스(University of California Irvine)의 Ed Maki 교수님 연구실 대학원생 Josh Sh입니다. 이번 시간에는 BioRad RNA mini kit를 사용하여 신경 전구세포에서 RNA를 추출하는 방법을 보여드리겠습니다. 저는 이 키트를 이미 몇 년 동안 이 연구실에서 사용해 왔으며, 항상 높은 수율로 일관된 결과를 얻을 수 있었습니다.

우리가 사용하는 세포는 배아 피질에서 급성 분리된 E14.5 신경 전구 세포이며, 보통 PDL 및 라미닌이 코팅된 24웰 조직 배양 처리 플레이트에 웰당 100,000 Cells의 밀도로 플레이팅합니다. 시작하기 전에, RNA 작업을 위해 지정된 벤치에서 작업해야 한다는 점을 말씀드립니다. 가장 먼저 해야 할 일은 RNA 벤치가 깨끗한지 확인하는 것입니다.

실험대를 청소하는 적절한 방법은 RNA zap을 사용하는 것입니다. 기본적으로 이는 모든 RNA를 제거하는데, 그 이유는 RA가 기본적으로 RNA를 파괴하기 때문입니다. 또 다른 주의 사항은 추출 작업을 수행할 때 항상 장갑을 착용하는 것이며, 이는 피부에 이러한 RNA가 많이 분포해 있기 때문입니다.

따라서 이는 절대 해서는 안 되는 일입니다. 자, 여기 제가 준비한 것은 BioRad total RNA mini kit입니다. 구성품을 꺼냈으니 무엇이 들어있는지 보여드리겠습니다.

먼저 X dep C로 처리된 PBS와 70% DEP 처리된 에탄올이 준비되어 있습니다. 또한 에탄올이 첨가된 총 RNA 용출 용액이 있습니다. 다음으로 100% 에탄올이 첨가된 저스트링전시 세척액, 고스트링전시 세척액, DNA 희석 용액, DNA 자체, 그리고 총 RNA 용출액이 있습니다.

70°C 가열 블록에 넣을 용액입니다. 그 외에 필요한 것은 1.5 mL 캡 튜브입니다. 이 튜브에는 DNA나 RNA가 포함되어 있지 않아야 하므로, 해당 성분이 없는 튜브를 준비하시기 바랍니다.

그리고 2 mL 캡리스 튜브 두 개가 있습니다. 그리고 무엇보다 가장 중요한 것은 RNA 컬럼 그 자체입니다. 이것 없이는 RNA 추출을 수행할 수 없습니다.

따라서 이 컬럼들을 조립하려면, RNA 컬럼과 2 mL 캡리스 튜브가 필요하며, 이를 다음과 같이 결합하면 준비가 완료됩니다. 마지막으로 항상 필요한 것은 세포입니다. 여기서 사용하는 세포는 ETON 1.5 신경 전구세포입니다.

배아 피질에서 급성으로 분리한 세포들입니다. 이 세포들은 며칠 동안 배양액에서 배양되었습니다. 현재 37°C 인큐베이터에서 세포를 꺼낸 상태입니다.

본 프로토콜은 부착 세포에 특화되어 있습니다. 이 세포들은 PDL 및 라미닌이 코팅된 조직 배양 처리된 0.4 well 플레이트에서 배양되었습니다. 이제 진공 호스를 사용하여 배지를 제거하겠습니다.

다음 단계는 dep SEA PBS 약 500 µL를 첨가하는 것입니다. 이때 역시 필터 팁을 사용해야 합니다. PBS는 기본적으로 배지를 세척하는 역할을 합니다.

배지 성분이 RNA 컬럼에 들어가거나 RNA 추출을 방해하지 않도록 해야 하며, 그렇지 않으면 수득률이 좋지 않을 것입니다. 아시겠습니까? 신경 줄기세포는 PBS를 선호하지 않으므로 PBS를 빠르게 흡입하여 제거하겠습니다. 이제 각각에 350 µL의 용해 버퍼를 추가하겠습니다.

다시 한번, lysis buffer에 beta-mercaptoethanol이 포함되어 있는지 확인하십시오. 이제 세포가 완전히 용해되어 RNA 성분을 추출할 수 있도록 lysis buffer를 15회 파이펫팅하여 섞어줍니다.

이제 각 웰에 70% 에탄올을 추가하겠습니다. 70% 에탄올 350 µL를 넣은 후, 각 웰에서 10회씩 피펫팅하여 섞어줍니다. 각 웰마다 10회씩 피펫팅하였습니다. 이제 각 웰의 총 부피가 700 µL이므로, 피펫을 700 µL 이상으로 설정하겠습니다.

그 다음 700 µL가 넘는 용액을 취해 RNA 컬럼에 분주합니다. 컬럼에 내용을 추가한 후, 원심분리기로 이동하여 최대 속도로 30초 동안 원심분리합니다. 용해물을 처음으로 30초간 원심분리한 후, 여과액을 빈 용기에 버려 제거합니다.

또는 다른 방법으로, 배킹 호스(backing hose)를 사용하여 여과액을 흡입하여 제거할 수 있습니다. 다음으로, 저강도 세척 버퍼(low stringency wash buffer) 700 µL를 첨가합니다. 이때 반드시 에탄올을 함께 첨가하십시오.

이제 최대 속도로 30초 동안 원심 분리하겠습니다. 저강도 세척 완충액을 원심 분리한 후, 여과액은 버리겠습니다. 아시겠나요? 그런 다음 DNA 용액을 준비하겠습니다.

따라서 각 샘플에 5 µL의 DNA를 첨가합니다. 저희의 경우, 이것이 효소이기 때문에 시작하기 전에 미리 DNA를 소분해 두었습니다.

이들은 분주(aliquot)하여 보관하는 것이 좋습니다. 전체를 통째로 보관할 경우, 반복적인 동결 및 해동으로 인해 효소 활성이 파괴됩니다. 따라서 5 µL의 DNA를 첨가한 후, 75 µL의 DNA 희석액으로 희석하겠습니다.

이를 추가하면 DNA 용액의 총 부피는 80 µL가 됩니다. 이제 각 샘플에 DNA 용액 80 µL를 추가하겠습니다. 용액이 컬럼의 멤브레인 위에 정확히 놓이도록 하십시오.

따라서 DNA 용액이 막에 흡착되도록 하여 DNA를 제거함으로써 RNA 수율을 높여야 합니다.

DNA를 첨가한 후, 효소가 작용할 수 있도록 컬럼을 상온에서 15분 동안 그대로 둡니다. 다시 한번 15분 동안 배양합니다. 이제 타이머가 종료되었습니다.

15분간의 배양 후, 원심분리기로 이동하여 DNA를 최대 속도로 30초 동안 원심분리하겠습니다. DNA를 침전시키기 위해 30초간 원심분리한 후, 여과액을 제거합니다. 이제 잔류 DNA를 씻어내기 위해 고엄격도 완충액 700 µL를 첨가하겠습니다.

그 후 이를 추가하고, 원심분리기로 30초 동안 다시 회전시킵니다. 원심분리가 끝나면 고stringency 여과액을 용기에 버려 제거합니다. 그리고 700 µL의 저stringency 버퍼를 추가합니다.

이번에는 Centri Beach에서 최대 속도로 1분간 원심 분리하겠습니다. 첫 번째 1분간의 저강도 세척 후, 여과액을 버립니다. 이번에는 아무것도 첨가하지 않고 다시 2분간 원심 분리하여 잔류 저강도 세척액을 제거하겠습니다. 저강도 세척액에는 에탄올이 포함되어 있어 RNA 수율을 낮출 수 있기 때문입니다.

이제 70°C 가열 블록에서 용출 버퍼를 꺼내겠습니다. 실험을 시작하기 전, RNA 회수 효율을 높이기 위해 용출 버퍼를 70°C로 가열하여 따뜻하게 유지해야 한다는 점을 다시 한번 기억하시기 바랍니다. 컬럼은 준비되었습니다.

원심분리기로 회전시킨 후, 다음 단계로 컬럼을 꺼냅니다. 이제 캡 튜브를 버리고 이 캡 튜브로 옮기겠습니다.

각 컬럼에 Lucian buffer 50 µL를 첨가합니다. 멤브레인이 buffer를 충분히 흡수할 수 있도록 buffer가 멤브레인에 정확히 도포되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 RNA 수율이 낮아질 수 있습니다.

이제 컬럼의 멤브레인에 용액이 충분히 흡수될 수 있도록 1~2분 동안 그대로 둡니다. 이제 1분이 지났습니다. 이제 원심분리기로 옮기겠습니다.

이제 컬럼을 원심분리기에 넣겠습니다. 최대 속도로 1분 동안 원심분리하겠습니다. 이것이 마지막 원심분리 단계이며, 정제된 오염물질 또는 RNA를 이 캡 튜브에 수집하게 됩니다.

마지막 원심분리가 끝나면 내용물을 꺼내고 컬럼을 제거하여 폐기한 다음, 튜브를 닫아 -80°C 냉동고에 보관하며 이후 필요할 때 사용하면 됩니다. 지금까지 BioRad RNA 키트를 사용하여 RNA를 추출했습니다. 이제 추출한 RNA의 농도를 측정하거나, 분광광도계를 사용하여 OD 값을 측정하겠습니다.

이제 제가 보여드릴 내용을 설명하겠습니다. 우선 희석 혼합물을 만들어야 합니다. 1:5 비율로 희석할 예정입니다.

RNA와 분자량 컷오프(MQ) 여과수를 혼합하겠습니다. 우선 공시료(blank)를 만들겠습니다. RNA를 용출할 때 사용했던 용출액 2 µL를 취한 다음, 분자량 여과수 8 µL를 추가하겠습니다.

이것이 블랭크입니다. 이제 샘플을 준비하겠습니다. 우리가 분석하려는 RNA 2 µL를 사용하겠습니다.

다시 한번 MQ water 8 µL를 추가하겠습니다. 이렇게 하면 1:5 희석이 됩니다. 샘플을 넣을 큐벳이 있으며, 이 큐벳을 분광광도계에 삽입하겠습니다.

이제 이를 측정해 보겠습니다. RNA 샘플의 OD를 측정하기 전에 큐벳을 세척해야 합니다. 여기 유리 큐벳이 있습니다.

앞면은 절대로 만져서는 안 됩니다. 지문이 남으면 측정값이 정확하지 않게 나오기 때문입니다. 따라서 먼저 double DI water로 글래스 큐벳을 세척하겠습니다.

그런 다음 진공 호스를 사용하여 물을 빨아들여 제거합니다. 세척 후에는 95% ethanol로 씻어내고, 다시 진공 호스를 사용하여 ethanol을 제거합니다.

이제 블랭크(blank)를 로딩하겠습니다. 측정값을 정규화하기 위해서는 먼저 블랭크가 필요합니다. 따라서 방금 만든 혼합액 10 µL를 취하겠습니다.

이제 용액을 위아래로 섞어 잘 혼합하겠습니다. 이 용액을 분광광도계로 가져가겠습니다. 이 기기는 Ultra Spec 3, 100 probe 장비이며, 이를 사용하여 RNA 농도를 측정하겠습니다.

기기를 열고, 이를 홀더 중 하나에 넣겠습니다. RNA만 읽도록 프로그램을 조작하겠습니다. 다시 말씀드리지만, 1:5 희석을 수행했습니다.

희석 배수를 5로 설정하겠습니다. 이제 준비가 되었으므로, 블랭크(blank)를 참조하기 위해 실행(run) 버튼을 누르겠습니다.

좋습니다, 이제 영점이 조절되었습니다. 이제 샘플을 측정할 준비가 되었습니다. 유리 큐벳을 꺼내겠습니다.

공백의 내용물을 빨아들여 제거하겠습니다. 다시, 2배의 DIS water로 세척하겠습니다. 5% ethanol로 9회 세척하겠습니다.

이제 분석 대상 샘플 10 µL를 분주할 준비가 되었습니다. 다시 한번, 샘플이 잘 섞였는지 확인하십시오. 그런 다음 유리 큐벳에 분주합니다.

이제 측정값을 읽을 준비가 되었습니다. OD(광학 밀도)를 측정한 후, 양호한 수율과 순도는 RNA 흡광 비가 2.60에서 2.80 사이여야 하며, 약 2.0 정도여야 합니다. 수율은 mL당 약 144 µg입니다.

기기에는 mil당 72 micrograms라고 표시되어 있지만, 우리 Vet의 절반 길이 때문에 이를 2배로 곱해야 합니다. 2 centimeters는 신경 전구 세포에서 RNA를 추출하는 방법을 보여주었습니다. 다시 한번 말씀드리면, BioRad의 total mini RNA kit를 사용하고 있습니다. 다른 키트들도 시도해 보았으나, 효율성 면에서 이 키트가 우리가 사용하는 가장 좋은 키트입니다.

그렇게 하면 고품질의 RNA를 얻을 수 있습니다. 이 키트를 사용하시면 저희가 항상 얻어내는 것과 동일한 고품질의 결과를 얻으실 수 있을 것입니다.