초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

본 실험의 전반적인 목표는 망간 증강 MRI를 사용하여 생쥐의 신경 세포 활동을 영상화하는 것입니다. 이는 한쪽의 진동 자극을 통해 반대측 배럴 필드 피질의 신경 반응을 매핑함으로써 수행됩니다. 첫 번째 단계는 신호 발생기와 증폭기로 구동되는 비집속 초음파 트랜스듀서로 구성된 초음파 시스템을 조립하고 실험을 위해 보정하는 것입니다.

망간을 복강 내 주입한 후, 초음파와 마이크로버블을 사용하여 혈뇌장벽을 개방함으로써 망간이 뇌 실질로 진입하도록 합니다. 다음으로, 마우스에 신경 자극 패러다임을 적용하면 뇌의 활성도가 더 높은 영역에 망간이 더 많이 축적됩니다. 마지막으로, 뇌 내 망간 축적 수준의 차이에 따른 T1 강조 MR 영상 강도의 지역적 차이를 보여주는 MRI 영상을 획득합니다.

신경과학에서 마우스는 뇌 발달 및 질환의 유전적, 분자적 기초를 연구하기 위한 지배적인 모델 시스템입니다. 본 기술은 이러한 마우스 모델에서 신경 활동을 매핑하기 위한 비침습적 도구를 제공합니다. 혈액-뇌 장벽의 초음파 파괴는 기능적 신경 영상 촬영을 목적으로 망간을 뇌 실질로 전달하는 데 사용될 뿐만 아니라, 가돌리늄 기반 조영제나 화학요법제 등 매우 다양한 다른 화합물을 뇌 실질로 전달하는 데에도 사용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 초음파 시스템을 보정하고 마이크로 루브(micro rubles)를 다루는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 우리 실험실의 모든 기술자에게 이 절차를 시연할 예정입니다. 초음파 시스템은 마우스 뇌를 덮을 수 있을 만큼 충분한 직경을 가진 단일 소자 초음파 트랜스듀서와 2MHz 범위의 중심 주파수로 구성됩니다.

트랜스듀서는 신호 발생기와 50데시벨 전력 증폭기에 의해 구동되어 초음파 펄스 시퀀스를 생성합니다. 수조 내에서 초음파 시스템을 교정하십시오. 하이드로폰을 수조 바닥에 배치하고 3축 이동 스테이지를 사용하여 그 위에 트랜스듀서를 위치시킵니다.

그런 다음 트랜스듀서에 짧은 정현파 펄스 열을 인가하고, 초음파 빔의 중심이자 트랜스듀서의 자연 초점 위치에서 최대 응답이 나타나도록 스테이지를 조정합니다. 이어서 다양한 입력 전압 범위에서 음압 측정을 여러 번 수행하고, 선형 회귀 분석을 통해 입력 전압과 음압 사이의 관계를 추정합니다. 약 0.36 megapascals의 최대 음압(negative acoustic pressure)을 생성하기 위한 펄스 진폭을 결정합니다.

이 단계에서는 노즈 콘(nose cone)을 통해 isof fluorine을 투여하여 동물을 마취합니다. 노즈 콘 장치는 동물의 머리를 매번 정확하고 안정적으로 동일한 위치에 고정해야 하며, 실험 중에 머리를 두개골 평면 상태로 유지하는 장치는 공압식 베개(pneumatic pillow)입니다. 호흡률을 모니터링하고 마취제 양을 조절하여 호흡률을 분당 85~125회 사이로 유지하십시오. 동시에 직장 프로브로 동물 체온을 모니터링하고, 가열 램프나 송풍기를 사용하여 체온을 유지하십시오.

그 후, 동물에게 꼬리 정맥 카테터와 복강 내 카테터를 삽입합니다. 다음 단계는 한쪽 VII의 일측성 자극을 입증하고 대측성 배럴 필드 피질의 신경 반응을 매핑하기 위해 털을 깎는 것입니다. 모낭이나 주변 피부를 자극하지 않으면서 대측성 VII를 피부 표면에 최대한 가깝게 절단하십시오.

그 다음 동물을 초음파 시스템으로 옮기고, 두피에 초음파 젤을 바른 후 물 기둥이 포함된 얇은 플라스틱 시트를 머리 위에 덮습니다. 면봉을 사용하여 물 기둥 내부의 초음파 젤에 갇힌 기포를 밀어내어 제거합니다. 이어서 초음파 트랜스듀서를 자연 초점 거리로 맞추어 마우스 뇌 바로 위 물속에 배치하고, 손가락으로 트랜스듀서를 닦아 갇혀 있는 기포를 모두 제거합니다.

그 후, 작업하는 동안 교반기에서 바이알을 45초 동안 흔들어 페린 지질 미세구체를 생성합니다. 실온에 보관하되, 하루의 마지막 사용 후에는 다음 첫 사용 전까지 냉장고에 보관하십시오. 다음 날에는 보관된 바이알을 교반기에서 다시 교반하십시오.

다음으로, 염화망간 0.5 millimole/kg을 복강 내로 주입하고, 약물이 분포될 수 있도록 10분 동안 기다립니다. 그 후, 마이크로버블 바이알을 1분 동안 수동으로 흔들어 마이크로스피어를 재현탁시킵니다. 이어서 30 µL와 카테터의 dead volume에 해당하는 양을 흡인합니다.

바이알 내에 공기가 주입되지 않도록 주의하십시오. 공기가 유입되면 남아 있는 마이크로버블이 분해될 수 있습니다. 즉시 초음파 펄스 시퀀스를 시작하고, 지체 없이 꼬리정맥 카테터를 통해 마이크로스피어를 주입하십시오. 초음파 조사를 3분 동안 계속하십시오.

그런 다음 초음파 시스템을 끕니다. 뇌 내 망간 수치가 약 40분 동안 안정된 후, 이소플루란을 끄고 노즈콘을 제거합니다. 이 시점에서 배럴 필드 피질(barrel field cortex)을 매핑하기 위한 신경 자극 패러다임을 시작합니다.

페인트 브러시를 약 1~5 Hz의 원형 동작으로 반대측 vibra array를 통해 90분 동안 움직입니다. 자극 후 마취를 재개하고, 체온을 계속 유지하며 호흡수가 분당 85~125회 수준이 되도록 isof fluorine 농도를 조절합니다. 다음으로, 마우스를 MRI 코일에 넣고 MRI 시스템으로 이동시킵니다.

그 다음, 여기 보이는 것과 같이 고해상도 3D T1 강조 영상을 획득합니다. 망간이나 가돌리늄 기반 제제와 같은 T1 단축 조영제를 투여한 후 혈뇌장벽이 파괴되면, BOMA를 수행하지 않은 뇌와 비교했을 때 T1 강조 영상의 뇌 실질에서 신호 증가가 나타납니다. 첫 번째 열은 7마리의 동물에서 리시(risi)를 일측성으로 자극하여 생성한 신경 활동 지도입니다.

두 군데의 서로 다른 위치에서 측정된 차이 맵(Difference maps)은 붓(brissy)으로 자극을 준 반대측에서 MRI 신호가 증가했음을 보여줍니다. 두 번째 열의 p-값 맵은 이러한 차이의 상대적 유의성을 나타냅니다. 세 번째 열의 해당 뇌 지도 도식은 이러한 활성 영역이 일차 감각 피질의 배럴 필드(barrel field)에 해당함을 보여줍니다.

숙련되면 이 기술은 시뮬레이션 시간을 제외하고 약 2시간 정도면 수행할 수 있습니다. 절차를 수행할 때, 주입 전 마이크로버블 바이알을 흔들어 섞어주어야 하며 바이알 내에 공기가 주입되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 초음파 겔 내부나 초음파 트랜스듀서 아래에 공기 방울이 갇혀 있지 않은지 확인하는 것이 중요합니다.

본 시연에서는 수염을 자극하는 방법을 선택하였으나, 이 기술은 관심 있는 모든 자극 연구에 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다. 해당 절차 이후 동물은 완전히 회복될 수 있어 종단적 연구가 가능합니다.