Name: 성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 성인 마우스 전뇌 급성 슬라이스에서 신경아세포 이동의 시간 경과 영상 기법을. 광역 실시간 형광 현미경을 활용하여 세포 이동 역학을 분석하고 신경 발달 메커니즘을 연구하는 방법입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 부분적으로 Université 라발의 교제에 의해 지원되었다 ASJK에 건강 연구 (CIHR) 교부금의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. AS 출생 후의 neurogenesis에 캐나다 연구 의자의 수신자입니다.

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Kaneko, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
<li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+neuronal+migration+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li>
<li>Snapyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
<li>Lledo, P. M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+new+neurons+into+the+adult+olfactory+bulb%3A+joining+the+network%2C+life-death+decisions%2C+and+the+effects+of+sensory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience.</a> Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).</li>
<li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+release+and+uptake+regulate+neuronal+precursor+migration+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li>
<li>Martini, F. J., Valdeolmillos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+contraction+at+the+cell+rear+drives+nuclear+translocation+in+migrating+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).</li>
<li>Murase, S., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Bovetti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+scaffold+for+neuroblast+migration+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

적절한 뇌 지역에 neuronal 전구체의 올바른 타겟팅은 신경 회로의 적절한 조립과 기능의 근간이 기본 과정입니다. 세포의 대부분은 배아 발달 동안 마이그레이션 만 등의 OB, 이가있는 이랑과 소뇌 등의 몇 지역에서 출생 후의 두뇌에 neuronal 변위는 아직 이루어집니다. 출생 후의 뇌의 세포 마이그레이션을 꾸미고 메커니즘이 저조한 이​​해하지만, 남아 있습니다. 성숙한 신경 조직에 세포 마이그레이션 가이드에 관여하는 메커니즘와 분자 경로에 대한 지식은 출생 후의 뇌 neuronal 타겟팅에 대한 우리의 이해를 개선하고 뇌의 병에 걸린 영역으로 neuronal 채용을 유도 할 수있는 새로운 전략의 개발을위한 임상 관련성이있을 수 있습니다. 이 원고에서, 우리는 성인 마우스 forebrain의 급성 조각의 모니터링 셀 마이그레이션을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 성인 SVZ-OB를 사용하는 동안모델 시스템과 같은 경로는 동일한 기술은 배아와 초기 출생 후의 두뇌뿐만 아...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 </td><td> S9378 </td></tr><tr><td> 포도당 (ACSF) </td><td> EMD </td><td> DX0145-3 </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 시그마 </td><td> S9625 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 시그마 </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> MgCI이 x6H 2 O </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> 아뇨 2 PO 4 xH 2 O </td><td> EMD </td><td> SX0710-1 </td></tr><tr><td> CaCI이 x2H 2 O </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C3881 </td></tr><tr><td> Dextran은 TexasRed </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Dextran CascadeBlue </td><td> Invitrogen </td><td> D1976 </td></tr><tr><td> 포도당 (40X 솔루션) </td><td> 시그마 </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 시그마 </td><td> D-5025 </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Gibco </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> Neurobasal 매체 </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> EMD </td><td> 2930 </td></tr><tr><td> 펜 / 패 혈성 </td><td> 생명 기술 </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 케타민 / Xylazine </td><td> CDMV </td><td> 5230 </td></tr><tr><td> 파스퇴르 피펫 </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 관 </td><tD&gt; Sarstedt </td><td> 62.553.205 </td></tr><tr><td> 50 ML 원뿔 관 </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.205 </td></tr><tr><td> 유리 모세관 (stereotaxic 분사) </td><td> WPI </td><td> 4878 </td></tr><tr><td> 파라핀 유 </td><td> EMD </td><td> PX0045-3 </td></tr><tr><td> Proviodine </td><td> Rougier </td><td> 65655-1370 </td></tr><tr><td> 상처의 봉합 </td><td> Stoelting </td><td> 50,487 </td></tr><tr><td> Anafen </td><td> CDMV </td><td> 11,508 </td></tr><tr><td> 20 CC의 주사기 </td><td> VWR </td><td> SS-20L2 </td></tr><tr><td> 페트리 접시 </td><td> VWR </td><td> 25384-094 </td></tr><tr><td> 한천 </td><td> Laboratoire 매트 </td><td> AP-0108 </td></tr><tr><td> 아교 </td><td> Permabond </td><td> 910 </td></tr><tr><td> 95% O 5분의 2 %의 CO 2 </td><td> Linde </td><td> 24068835 </td></tr><tr><td> 블레이드 &lt;/ TD&gt; <td> WPI </td><td> 501901 </td></tr><tr><td> 나일론 메쉬 </td><td> 워너 악기 </td><td> 64-0198 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5702 000.019 </td></tr><tr><td> 피펫 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Nanoliter 주입기 </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td></tr><tr><td> Stereotaxic 주입 장치 </td><td> WPI </td><td> 502900 </td></tr><tr><td> 마이크로 드릴 시스템 </td><td> WPI </td><td> 501819 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> 열 과학 </td><td> 920110 </td></tr><tr><td> 폭 넓은 분야 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX61WIF </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td> CS-HQ2-D </td></tr><tr><td> 울트라 조용한 이미징 챔버 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 64-1487 </td></tr><tr><td> PH-1시리즈 20 히터 플랫폼 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 64-0284 </td></tr><tr><td> 난방 시스템 </td><td> 워너 악기 </td><td> TC-344B </td></tr><tr><td> 40X 물 침지 목표 </td><td> 하늘 </td><td> 1 UM587 </td></tr><tr><td> 10X 물 침지 목표 </td><td> 하늘 </td><td> 1 UM583 </td></tr><tr><td> 람다 DG-4 </td><td> 셔터 악기 </td><td> DG-4/OF </td></tr><tr><td> MetaMorph 소프트웨어 </td><td> 분자 장치 </td><td> 40,000 </td></tr><tr><td> Imaris 소프트웨어 </td><td> Bitplane </td><td> BPI-IM70-F1 </td></tr></tbody></table>

성인 마우스 forebrain의 급성 슬라이스에 neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

새로운 기능 뉴런이 constitutively 성인 포유류의 뇌의 제한된 영역에서 신경 줄기 세포의 내생 풀에서 생성을 나타내는 증거의 상당한 몸이있다. subventricular 영역 (SVZ)에서 신생아 neuroblasts는 후각 망울 (OB) 1에서의 최종 목적지까지의 뱃 부리 장식이있는 철새 스트림 (RMS)을 함께 마이그레이션. RMS에서 neuroblasts은 구조 지원 및 마이그레이션 4,5에 필요한 분자 요소의 소스로 혈관을 사용하여 astrocytic 프로세스 2,3에 의해 ensheathed 체인에 tangentially 마이그레이션. OB에서 neuroblasts는 체인에서 분리하고 interneurons로 차별화하고 기존의 네트워크 1, 6에 통합 다른 안구 레이어로 방사상으로 마이그레이션됩니다. 이 원고에서 우리는 쥐의 뇌의 급성 조각의 모니터링 셀 마이그레이션에 대한 절차를 설명합니다. 급성 조각의 사용은 assessm 수 있습니다밀접하게 생체 조건과 생체 이미징에 대해 액세스하기 어렵 뇌 영역에서에 유사한하는 microenvironment의 세포 마이그레이션 다닐. 또한, 결국 세포의 이주 속성을 변경할 수도 있습니다 organotypic과 셀 문화의 경우에서와 같이 긴 배양 조건을 방지합니다. 급성 조각의 Neuronal 전구체는 DIC 광학 또는 형광 단백질을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 야생 형 생쥐의 SVZ에 기자 마우스에서 neuroblasts을 접목하고, neuroblasts에 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 쥐를 사용하여 SVZ의 neuronal 전구체의 바이러스 성 라벨은 neuroblasts을 표시하고 이전에 따라에 대한 모든 적합한 방법입니다. 나중에 방법은 그러나, 개별 셀 때문에 분류 세포의 높은 밀도의 장기간 추적 할 수 없습니다. 우리는 비교적 빠른 수집 간격 (한 IMA 달성하기 위해 CCD 카메라가 장착 된 넓은 분야 형광 수직 현미경을 사용GE 매 15 또는 30 초)가 안정적으로 고정와 철새 단계를 식별합니다. 고정와 철새 단계 기간의 정확한 식별 결과의 모호 해석에 매우 중요합니다. 우리는 또한 3D로 neuroblasts 마이그레이션을 모니터링하기 위해 여러 Z 단계 인수를 수행. 폭 넓은 분야 형광 이미징은 neuronal 마이그레이션에게 7-10를 시각적으로 광범위하게 사용되어왔다. 여기, 우리는 neuroblasts 라벨을 성인 마우스 forebrain의 급성 조각에 neuroblast 이주의 실시간 비디오 영상을 수행하고, 세포 마이그레이션을 분석에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜 성인 RMS의 neuroblasts의 마이그레이션을 예시 있지만, 또한 배아 및 조기 출생 후의 두뇌에 세포 이주를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

신경 줄기세포의 내인성 풀(pool)으로부터 새로운 기능적 뉴런이 지속적으로 생성된다는 상당한 양의 증거가 존재합니다...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 성체 마우스 뇌의 급성 절편에서 신경모세포(Neuroblast)의 이동을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 성체 뇌실하구역(subventricular zone)의 신경 전구세포를 표지하고, 신경모세포 표지 5~8일 후에 마우스 뇌의 급성 절편을 준비합니다. 그 다음으로, 신경모세포 이동의 타임랩스 이미징을 수행합니다.최종적으로 광시야 실시간 현미경(widefield realtime microscopy)을 사용하여 급성 절편 내 신경모세포 이동의 역동성을 보여줍니다. 이 방법은 세포 이동과 관련된 다양한 분자 단서 및 세포 기전의 역할을 연구함으로써 신경 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 이 방법은 성인 뇌에서 신경 이동을 조절하는 생리적 과정에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 허혈성 뇌의 신경 이동 연구 및 배아 발달 과정 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.먼저 슬라이스 절단용 설탕 기반 인공 뇌척수액(A CSF)과 이미징 전까지 슬라이스를 유지하기 위한 32 °C 염화나트륨 기반 A CSF를 준비한 후, 95% 산소와 5% 이산화탄소를 지속적으로 버블링하여 용액에 산소를 공급하십시오. 다음으로, 형광 표지된 신경모세포가 있는 마우스에 케타민-자일라진을 복강 내 투여하여 마취시키십시오. 그런 다음 액체 질소를 사용하여 젤 형태의 얼음처럼 차가운 절단 용액을 빠르게 준비하십시오.그 후, 20 cc 주사기로 얼음처럼 차가운 절편 제작 용액 15~20 milliliters를 취해 마우스의 심장 내로 관류합니다. 절편 제작 용액으로 관류하는 대신 혈관을 표지해야 하는 경우, 10 milligrams per milliliter 농도의 dextran Texas red 200 microliters를 심장의 좌심실에 심장 내 주사하고, 2~3분 동안 기다립니다. 심장 내 관류 후 마우스를 신속하게 안락사시켜 머리를 분리한 다음, 머리를 얼음처럼 차가운 절편 제작 용액에 담그고 진동 절편기(vibratome)로 옮깁니다. 가위로 소뇌부터 후각구까지 시상 봉합선을 따라 두개골을 절개합니다.그 다음, 포셉을 사용하여 두개골 플랩을 조심스럽게 제거합니다. 이후 메스로 뇌의 꼬리 부분을 절제하십시오. 그런 다음 각 뇌반구의 가장 외측 부분에 두 개의 시상 절개를 넣고, 뇌반구 사이 틈을 따라 뇌를 절개합니다. 이어서 스파튤라를 사용하여 뇌를 조심스럽게 제거한 후, 차가운 절단 용액에 넣습니다.두 뇌반구를 각각 4% agar 블록 위에 등쪽 면이 agar에 닿도록 놓습니다. 다음으로, 두 뇌반구의 가측 절단면이 Vibram 플랫폼에 닿도록 고정하며, 내측 면이 위를 향하게 합니다. 그 후, 플랫폼을 Vibram 챔버 안에 넣습니다.절단액을 채웁니다. 그다음 95% oxygen, 5% carbon dioxide 혼합 가스를 버블링하여 슬라이스 제작 과정 전반에 걸쳐 용액에 산소가 공급되도록 유지합니다. 이제 진동 절편기를 사용하여 250 micron 두께의 절편을 준비합니다.고품질의 절편을 얻기 위해서는 낮은 절단 속도와 높은 빈도의 블레이드 진동을 사용해야 합니다. 절편이 블레이드에서 분리되는 즉시 절단 용액에서 조심스럽게 꺼내어, 워터배스를 통해 32 °C로 유지되고 산소가 공급되는 A CSF가 채워진 배양 챔버에 넣습니다. 이 과정에서, 이미징 중에 절편이 밀려나지 않도록 현미경의 이미징 챔버에 신중하게 배치하십시오.그 위에 나일론 메쉬를 조심스럽게 올려 고정합니다. 슬라이스에 A CSF가 지속적으로 관류되고 있는지 확인하십시오. 다음으로, 10x 대물렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾습니다.metamorph 소프트웨어를 실행하고 나일론 메쉬가 이미징 영역을 가리지 않는지 확인하십시오. 그런 다음 40x 대물렌즈를 장착하고 초점을 조절하십시오. 대물렌즈와 절편 사이에 충분한 양의 용액이 있는지 확인하십시오.Metamorph 소프트웨어를 사용하여 자극 지속 시간, Z 평면 수, 각 Z 섹션 간 거리, 시간 간격 및 기록 지속 시간과 같은 타임랩스 획득 파라미터를 설정하십시오. 그런 다음 타임랩스 획득을 시작하십시오. 데이터는 Metamorph에 의해 tiff 파일로 자동 저장되며, 각 파일은 획득한 타임랩스 비디오의 한 시점에 해당합니다. 이후 ImageJ에서 영상을 엽니다.비디오의 첫 번째 시점 이미지를 프로그램 아이콘으로 드래그 앤 드롭하여 획득한 이미지를 불러옵니다. 동영상이 로드되면 디스플레이 조정 창에서 신호의 밝기와 대비를 조정합니다. 이미지 속성에서 복셀 크기와 시간 간격 등 획득한 비디오의 파라미터를 설정하고, 등간격의 시간 지점 윈도우를 설정합니다.복셀 크기를 지정한 후, 기록된 세포를 자동으로 추적하기 위해 프레임을 3D로 확인하고 비디오의 시간 및 스케일을 확인할 수 있습니다. surpass 창에서 spots 기능을 선택하여 시야 내의 각 세포에 대한 스폿을 생성하고, slice 창에서 추적할 세포의 직경을 측정하십시오. 추적 파라미터를 설정하고 진행하십시오.시간 경과에 따른 검출된 객체들의 신뢰성을 점검하십시오. 이동하는 모든 세포가 자동으로 검출되지 않은 경우, 검출 임계값을 변경하여 모든 시점에서 모든 세포가 스폿으로 선택되었는지 확인하십시오. 프로그램이 시점들을 연결할 수 있도록, 동일한 트랙의 인접한 시점을 나타내는 두 스폿 사이의 최대 거리와 최대 간격 크기를 지정해야 합니다.트랙이 생성되면, 불필요한 트랙을 단순히 삭제하여 필터링하고 제거할 수 있습니다. 모든 수정 작업이 완료되면, 서로 다른 트랙을 연결 또는 분리하거나 동일한 트랙의 서로 다른 시점을 조정하여 트랙을 보정할 수 있습니다. 트랙을 최종적으로 확인한 후, 시간당 세포 변위, 트랙 길이, 변위 길이 및 트랙 지속 시간을 포함한 데이터를 Excel 파일로 내보내십시오.이 영상은 dextran, Texas red로 표지된 혈관을 따라 이동하는 녹색 신경모세포(Neuroblast)의 타임랩스 이미징을 보여줍니다. 이동하는 신경모세포가 이동 단계와 정지 단계가 교차하며 나타나는 도약적 행동(saltatory behavior)을 보이는 점에 유의하십시오. 또한, 이 영상은 imas 소프트웨어를 이용한 신경모세포 이동의 추적 과정을 보여줍니다.구체와 선은 각각 개별 세포의 세포체와 이동 경로를 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때는 성체 마우스 전뇌의 고품질 급성 생체 슬라이스를 확보하는 것이 중요합니다. 또한, 이미징 중에 슬라이스가 밀리는 것을 방지하기 위해 나일론 메시를 조심스럽게 배치하여 이미징 챔버 내에서 슬라이스를 충분히 고정해야 합니다.A CSF 관류 속도의 변화, 불규칙한 관류, 또는 급격한 온도 변화는 이미징 중에 드리프트(drifting) 및 초점 평면의 변화를 유발할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 성체 급성 절편에서 신경모세포(neuroblast)의 이동을 기록하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이동 단계와 정지 단계의 시작과 끝을 확실하게 식별하기 위해 15~30초 정도의 짧은 촬영 간격을 사용할 것을 권장합니다.

time-lapse-imaging-neuroblast-migration-acute-slices-adult-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Source:&lt;span style='background-color:#f9f9f9;color:#1155cc;'&gt;Wiegreffe, C., et. al.,  배아 마우스 뇌의 유기형 슬라이스 배양에서 이동하는 뉴런의 타임랩스 공초점 이미징 자궁에서 Electroporation. J. Vis. 특급. (2017) 이 비디오는 심실하 영역에서 피질 뉴런 방사상 이동을 관찰하기 위한 타임랩스 컨포칼 현미경을 보여줍니다. 형질도입된 마우스 배아 뇌 절편에서 방사형 신경교골(radial glial scaffolds)을 통해 피질 플레이트(cortical plate)로.

transducted mouse embryonic brain slices에서 피질 뉴런 요골 이동의 타임랩스 이미징

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

자기 공명 영상 (MRI)은 유전자 조작 생쥐의 표현형을 조사를위한 점점 인기있는 도구가되고 있습니다. 이 문서는 여러 마우스 MRI를 사용하여 유전자 조작 생쥐의 높은 처리량 phenotyping을 달성하는 데 필요한 방법을 보여줍니다.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

기록 칼슘 활동을위한 칼슘 표시기 염료와 subventricular 영역 (SVZ) 세포를로드 할 방법이 설명되어 있습니다. 출생 후의 SVZ는 신경 전구 세포와 neuroblasts 포함 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 오히려 목욕로드를 사용하는 것보다 우리가 더 나은 염료 확산을 허용 조직 내부의 압력에 의해 염료를 주입했다.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

배우세요 성인 마우스 전뇌 급성 슬라이스에서 신경아세포 이동의 시간 경과 영상 기법을. 광역 실시간 형광 현미경을 활용하여 세포 이동 역학을 분석하고 신경 발달 메커니즘을 연구하는 방법입니다.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

더 많은 동영상 탐색