성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.

이 절차의 전반적인 목표는 성체 쥐 4개의 뇌의 급성 절편에서 신경아세포 이동을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 신경아세포 라벨링 후 5-8일 후에 성인 뇌실 아래 영역의 신경 세포 전구체를 라벨링하고 뇌를 위해 마우스의 급성 절편을 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 신경아세포 이동의 타임 랩스 이미징을 수행합니다.

궁극적으로 광시야 실시간 현미경은 급성 절편에서 신경아세포 이동의 역학을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법은 세포 이동과 관련된 다양한 분자 신호와 세포 메커니즘의 역할을 연구함으로써 신경 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이제 이 방법은 성인의 뇌를 위한 신경 이동을 조절하는 생리학적 과정에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 허혈성 뇌 및 배아 발달 중 신경 이동을 연구하는 것과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

슬라이스를 절단하기 위한 자당 기반 인공 대뇌 척수액과 이미징할 때까지 슬라이스를 유지하기 위한 섭씨 32도의 염화나트륨 기반 CSF를 준비하여 이 절차를 시작한 다음 95%의 산소, 5%의 이산화탄소로 용액을 지속적으로 거품을 만들어 용액에 산소를 공급합니다. 다음으로, 케타민 자일라진을 내부에서 사용하여 형광 표지된 신경아세포로 마우스를 마취합니다. 그런 다음 액체 질소를 사용하여 젤리 모양의 얼음 냉간 절단 용액을 빠르게 준비합니다.

그 후, 15cc 주사기로 20-20 밀리리터의 얼음 냉간 절단 용액을 취하고 마우스 인트라 카디를 관류합니다. 절단 용액으로 관류하는 대신 혈관에 표시를 해야 하는 경우, 1밀리리터당 10밀리그램 농도의 덱스트란 텍사스 레드 200마이크로리터를 주입하고, 심장의 좌심실에 트랜스 카디를 주입하고, 트랜스 카디를 심장 관류 후 마우스의 목을 베기 전에 2-3분 정도 기다렸다가 마우스의 목을 빠르게 베고 얼음 냉간 절단 용액에 머리를 담그고 비브라토로 이동합니다. 소뇌에서 후각구까지 시상 봉합선을 따라 가위로 두개골을 자릅니다.

그런 다음 한 쌍의 집게를 사용하여 두개골 덮개를 부드럽게 제거한 다음 메스를 사용하여 뇌의 유아 부분을 절제합니다. 그런 다음 각 반구의 가장 외측 부분에 두 개의 시상 절단을 만들고 반구 내 균열을 따라 뇌를 절단합니다. 그런 다음 주걱을 사용하여 뇌를 부드럽게 제거하고 얼음 냉간 절단 용액에 넣습니다.

두 반구를 등쪽이 한천에 닿도록 4% 한천 블록에 별도로 놓습니다. 다음으로, 두 반구의 측면으로 절단된 면이 있는 블록을 내측이 위를 향하도록 하여 Vibram의 플랫폼에 붙입니다. 그런 다음 Vibram 챔버에 플랫폼을 놓습니다.

절단 용액으로 채우십시오. 그런 다음 95%산소, 5%이산화탄소로 거품을 일으켜 슬라이스 준비 전반에 걸쳐 용액을 산소로 유지하십시오. 이제 바이브레이터로 250미크론 두께의 섹션을 준비합니다.

고품질 단면을 얻기 위해 낮은 절삭 속도와 고주파 블레이드 진동을 사용해야 합니다. 칼날에서 슬라이스가 분리되는 즉시 절단 용액에서 부드럽게 제거하고 수조에서 섭씨 32도로 유지되는 산소가 공급된 A CSF로 채워진 배양실에 넣습니다. 이 절차에서는 이미징 중에 슬라이스가 표류하지 않도록 현미경의 이미징 챔버에 슬라이스를 조심스럽게 배치했습니다.

그 위에 나일론 메쉬를 조심스럽게 올려 고정합니다. 슬라이스가 A CSF로 지속적으로 관류되는지 확인합니다. 다음으로, 10 x 대물렌즈를 사용하여 관심 필드를 찾습니다.

변형 소프트웨어를 열고 나일론 메쉬가 이미징 필드를 방해하지 않는지 확인합니다. 그런 다음 40 x 대물렌즈를 맞물리고 초점을 조정합니다. 목표와 슬라이스 사이에 충분한 솔루션이 있는지 확인합니다.

metamorph 소프트웨어를 사용하여 여기 지속 시간, Z 평면 수, 각 Z 섹션 사이의 거리, 시간 간격 및 녹음 지속 시간과 같은 타임 랩스 획득 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 타임랩스 획득을 시작합니다. 데이터는 자동으로 Metamorph에 의해 tiff 파일로 저장됩니다 각 파일은 획득 된 시간 경과 비디오의 한 시점에 해당하는 각 파일을 사용하여 Mrs.Load에서 동영상을 열고

프로그램 아이콘에서 비디오의 첫 번째 시점 이미지를 끌어다 놓기만 하면 획득 된 이미지를 열 수 있습니다. 동영상이 로드되면 디스플레이 조정 창에서 신호의 밝기와 대비를 조정합니다. 이미지 속성에서 복셀 크기 및 시간 간격과 같은 획득한 비디오의 매개 변수를 설정하고 등거리 시점 창을 설정합니다.

복셀 크기를 지정한 후 프레임은 물론 비디오의 시간과 스케일을 3D로 확인하여 기록된 셀을 자동으로 추적할 수 있습니다. spot 함수를 선택하여 surpass window의 필드에 있는 각 셀에 대한 spot을 만들고, slice window에서 추적할 셀의 직경을 측정합니다. 추적을 위한 매개변수를 설정하고 계속 진행합니다.

시간 경과에 따라 감지된 개체의 신뢰성을 검사합니다. 이동하는 모든 셀이 자동으로 감지되지 않는 경우 감지 임계값을 변경하고 모든 셀이 모든 시점에서 반점으로 선택되었는지 확인합니다. 동일한 트랙의 인접 시점을 나타내는 두 지점 사이의 최대 거리와 최대 간격 크기는 프로그램이 시점을 연결할 수 있도록 지정해야 합니다.

트랙이 만들어지면 간단히 삭제하여 트랙을 필터링하고 관련 없는 트랙을 제거할 수 있습니다. 모든 수정이 완료되는 즉시 동일한 트랙의 다른 트랙과 다른 시간 지점을 연결 및 분리하여 트랙을 수정할 수 있습니다. 트랙을 마지막으로 살펴보고 시점별 셀 변위, 트랙 길이, 변위 길이 및 트랙 기간을 포함한 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다.

이 비디오는 텍사스 적색 라벨이 붙은 혈관을 따라 녹색 신경아세포(Neuroblast)가 이동하는 타임랩스 이미징을 보여줍니다. 이동하는 신경아세포(neuroblast)는 이동 단계가 정지 기간으로 중단될 때 염분 행동을 보인다는 점에 유의하십시오. 그리고 이 비디오는 imas 소프트웨어에 의한 신경아세포 이동을 추적하는 방법을 보여줍니다.

구(sphere)와 선(lines)은 각각 개별 세포에 대한 세포체(cell body)와 이동 경로(migration track)를 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 성인 마우스 전뇌의 양질의 급성 생활 조각을 얻어야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 이미징 중에 슬라이스가 표류하는 것을 방지하기 위해 나일론 메쉬를 조심스럽게 배치하여 이미징 챔버에서 슬라이스가 잘 안정화되어야 합니다.

A CSF 관류 속도의 변화, 불규칙한 관류 또는 급격한 온도 변화는 이미징 중 초점면의 표류 및 변화를 유발할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 급성 성체 절편에서 신경아세포 이동을 기록하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 15초에서 30초 정도의 짧은 의사 간격을 사용하여 이동 및 정지 단계의 시작과 끝을 안정적으로 식별하는 것이 좋습니다.