Name: RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석 현장에서 하이브리드 (물고기) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 배우세요 형광 원위치 하이브리드화(FISH)를 사용하여 Plasmodium falciparum 감염 적혈구에서 단일 세계 mRNA 전사를 분석하는 방법을 학습하세요. 이 기술은 말라리아 기생충의 다중 유전자 발현을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 우수한 기술 지원을 위해 기생충과 크리스티나 Holm이의 genotyping을 위해 마이클 Alifrangis과 Ulla Abildtrup 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (보조금 55,005,511), Lundbeck 재단 (부여 R9-A840)와 닐스 Bohr 국제 교류 재단이 지원되었습니다.

1. 갓 선정 감염된 적혈구의 생성 PfEMP1 단백질의 표면 표현 신선한 선택 문화를 사용하는 경우이 분석은 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 특정 실험 3D7 P.에서 falciparum의 일족이 이전에 1 설명한 바와 같이 특정 항체를 사용하여 선정되었습니다. 1 일 <ol><li> P.의 포장 혈액 세포의 수확 200 μl falciparum 문화는 실온에서 8 분 800 XG에서 원심 분리하여 2~5% 늦게 무대 IE를 포함. </li><li> 37 2 ML에서 피 펠렛를 다시 일시 중지 ° C 따뜻한 0.75 % 젤라틴 14 ML 멸균 튜브에 솔루션 및 침전에 감염되지 않은 및 링 단계 IE를 허용하도록 37 ° C 15-20 분에 출발합니다. </li><li> 말기 IE를 수확, 새로운 14 ML 튜브로, 위의 단계를 즉 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어. </li><li> 특정 항 PfEMP의 50 μl를 희석37의 2 ML ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어와 살균 필터 1 항체. </li><li> 37 번 30 분에 14 ML 멸균 튜브와 배양에서 살균 희석 antisera ° 부드러운 교반과 C와 함께 바랜 말기 IE를 섞는다. </li><li> 상온에서 8 분 800 XG에 스핀 다운, 그리고 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어. </li><li> DynaMaq-15 자석을 사용하여 RBC - 세탁 미디어와 중지 두 번 Dynabead 단백질의 50 μl를 씻으십시오. </li><li> 300 μl RBC - 세탁 미디어에서 Dynabeads을 Resuspend하고 바랜 말기 IE에 추가​​합니다. 부드러운 교반과 37 ° C에서 30 분에 품다. </li><li> DynaMaq-15 자석에 튜브를 전송합니다. 1-2 분을 위해 남겨 모든 액체를 제거합니다. </li><li> RBC - 세탁 미디어의 4-5의 ML에 Dynabeads을 Resuspend. 자석에 튜브를 다시 전송하고 모든 액체를 제거하기 전에 1-2 분을 위해 출발합니다. 한 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 25cm 두 멸균 문화 F에 씻은 구슬을 전송200 μl 갓 포장 적혈구를 포함하는 lask. 문화에 Albumax 미디어의 5-6 ML을 추가합니다. 37 5 % CO 2에서 하루 아침에 저장 ° C. </li></ol> 2 일 <ol start="12"><li> 선택한 IE는 14 ML 멸균 튜브에 대한 모든 문화를 전달하여 새로운 적혈구를 reinvaded 한 문화에서 Dynabeads를 제거합니다. DynaMaq-15 자석에 튜브를 넣고 1-2 분 동안 둡니다. 그런 다음, 문화 플라스크에 모든 액체를 다시 흘려. </li><li> 와 같은 몇 5~10%의 parasitemia 때까지 가능한 한주기와 기생충에 대한 문화 ringstage 이용하실 수 있습니다. </li><li> IE는 올바른 표면 표현형이 중 PFD1235w의 and/orPF11_0008의 즉, 단백질 표현이 1를 획득되었는지 확인하기 위해 FACS에 의해 분석해야합니다. </li></ol> 2. 프로브의 작성 안티센스 RNA 프로브는 PFD1235w과 PF11_0008 VAR의 가장 변수 지역에서 생성 된 &lt;P.에서 / em&gt;는 유전자 falciparum 3D7의 게놈의 DNA. DNA는 제조업체의 설명 (로슈)에 따라 각각 PCR에 의해 증폭 및 해독을 위해 pSPT18 또는 19 벡터로 복제되었습니다. 프로브 (580 기본 쌍 (BP)와 길이 590 BP)이 각각 파 RNA 라벨 키트 또는 비오틴 RNA 라벨 믹스를 사용하여 Digoxigenin (파) 또는 비오틴으로 표시되었습니다. 우리는 모두 북부 얼룩 분석 의해 단일 레이블 생선 분석 (1)에 의해 프로브의 특이성을 확인했습니다. 3. 현장 하이브리드 화에 얇은 문질러과 이전 기생충 고정 1 일 모든 단계는 RNase없는 환경에서 수행하고 모든 시약은 RNase 무료 또는 디 에틸 pyrocarbonate (DEPC) 또는 RNase 해치 (Invitrogen)로 사전 처리 있습니다. 슬라이드와 커버 용지는 잔여 제조 그리스를 제거하려면 알코올로 세척해야합니다. 이 단계들 사이에서 일시 정지하지 않고 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다nuclease 오염의 위험을 최소화하기 위해 인치 <ol><li> 표준 확산 방법 3 얇은 혈액 필름을합니다. 현미경의 100x 오일 목적 렌즈를 사용 IE를 계산하고 문화 IE의 비율을 계산합니다. 기생충 단계는 링과 IE주기의 초기 trophozoite 단계에서, 대략 synchrony에 있는지 확인합니다. 다음은 미리 복제, 단일 핵 단계, 표현 VAR 유전자 mRNA와 이런 종류의 단세포 생선 전사 assays에 적합합니다. </li><li> 1.5 ML RNase 무료 Eppendorf 튜브에 5-10 %의 parasitemia에서 기생충 문화의 50 μl를 전송합니다. 상온에서 2,000 rpm으로 1 분에 원심 분리기. </li><li> 미디어를 제거하고 DEPC - 처리 된 물 50 μl PBS의 pH를 7.2을 추가합니다. 부드럽게 튜브를 선동. 미디어 및 세포 잔해에서 무료로 세포를 씻어 두 번 원심 침강 단계를 반복합니다. </li><li> 넷 품질 얇은 얼룩을합니다. 각 비방를 들어,에 한 도말 표본을잘 RNase-자유 후드에서 4도 슬라이드, 총 즉, 네 유리 슬라이드 (중요한 단계) 중 하나에 11mm 직경. 파도가 건조 할 수있는 공중으로 간단히 슬라이드. 특정 프로브, RNase 처리 및 관심 유전자를 표현하지 IE 포함 삼분의 일 슬라이드의 또 다른 슬라이드를 사용하여 다른 관련이없는 유전자에 대한 단일 프로브 착색을위한 컨트롤 - 하나의 제외 슬라이드하기위한 세 가지 여분의 슬라이드를 확인합니다. 10-20 분 동안 벤치에 건조 할 수있는 슬라이드를 둡니다. </li><li> 우물에 4 % paraformaldehyde 5 % 빙하 아세트산을 포함하는 고정 솔루션을 60 μl를 추가하여 박막을 수정합니다. 실온에서 벤치에 10 분 동안 둡니다. </li><li> 실온에서 부드럽게 교반 5 분 동안 2 배 SSPE 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. 간단히 종이 휴지로 부드럽게 세포를 포함하는 우물을 터치하여 초과 액체를 제거합니다. </li><li> 37 ° C (매우 중요한 단계에서 2 분에 0.01 M HCL에 0.01 %의 펩신과 함께 슬라이드를 커버). 상온에서 5 분을 위해 2 배 SSPE에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 μg / ML의 최종 농도에 RNase 솔루션을 희석. RNase 솔루션의 60 μl로 대조군의 얼룩을 다룹니다. 37 ° C에서 30 분 동안 배양 한 후 실온에서 5 분을 위해 2 배 SSPE에 슬라이드를 씻어. </li><li> 하이브 리다이 제이션 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 4. 고정 슬라이드로 RNA 프로브의 하이브리드 1 일 <ol><li> 이러한 ThermoStar 100 HC4 또는 RNase 해치와 함께 분사하고 종이 휴지로 깨끗이 닦고하여 깨끗한 오븐에 넣어 빈 피펫 팁 상자 하이브 리다이 제이션 챔버을 준비합니다. 하이브 리다이 제이션 챔버 또는 슬라이드가 하이브리드 동안 밖으로 건조하지 않도록하기 위해 DEPC - 처리 물 상자 하단의 채널을 입력합니다. 48 챔버 및 예열을 닫으 ° C. </li><li> 12 NG / μl의 최종 농도에 하이브 리다이 제이션 용액에 프로브를 희석. 가열 블록의 5 분에 65에서 프로브 솔루션 ° C를 변성. 즉시 얼음에 진정 하라구. </li><li> 간단히 공기는 2 배 SSPE 세척 후 슬라이드를 건조. 조심스럽게 종이 휴지로 우물 주변에 초과 액체를 제거합니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 챔버를 열고 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 하나 또는 잘 60 μl의 총 볼륨의 두 프로브를 적용 할 수 있습니다. 조심스럽게 무균 집게를 사용하여 RNase 무료 커버 슬립이있는 액체 방울을 다룹니다. </li><li> 챔버를 닫고 밤 동안 적어도 16 시간 48 ° C에서 슬라이드를 잡종을 만들다. </li></ol> 5. 항체 활용 및 형광 증폭 2 일 다음 단계는 Perkin 엘머에서 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템을 기반으로합니다. 모든 단계는 실온에서 이루어집니다. <ol><li> 부드러운 교반 5 분 동안 TNT 버퍼에 슬라이드에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 30 분에 TNB 버퍼 150 μl에 우물을 차단. </li><li> 1:500의 비율로, TNB 버퍼에 1:100의 비율과 HRP-복합 α-비오틴 항체에 TNB 버퍼에 HRP-복합 α-파의 항체를 희석. 종이 조직과 슬라이드에서 초과 TNB 버퍼를 제거합니다. 동시에 두 스크립트를 감지하면, 두 항체는 한 번에 이동할 수 있습니다. 물론 당 항체 - TNB 솔루션 100 μl의 총 금액을 적용하고 신중하게 커버 슬립을 다룹니다. 2 시간에 슬라이드를 품다. </li><li> 조심스럽게 커버 용지를 제거합니다. 5 분에 3 회 TNT 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 1:500의 비율에 tyramide 증폭 시약에 FITC-형광을 희석하여 각도에 대한 해결책의 100 μl를 적용 할 수 있습니다. 커버 용지로 우물을 커버하고 12 분에 품다. </li><li> 조심스럽게 커버 미끄러를 제거하고 부드러운 교반에 의한 TNT 버퍼의 5 분의 슬라이드에게 3 번 씻는다. </li><li> 1:500의 비율로 tyramide 증폭 시약의 Cyan3 - 형광을 희석. 100 μl를 추가합니다이 솔루션의 잘. 커버 용지로 우물을 커버하고 12 분에 품다. </li><li> 커버를 제거주의 깊게 미끄러 후 TNT 버퍼에 빠져 신속하게 슬라이드를 씻어. </li><li> 5 분을위한 TNT 버퍼로 슬라이드에게 3 번 씻으십시오. </li><li> DEPC - 처리 물에 빠르게 슬라이드를 빠져. </li><li> 건조 방송에 슬라이드를 둡니다. DAPI를 포함하는 안티 - 페이드 시약으로 슬라이드를 탑재합니다. 매니큐어와 커버 용지의 모서리를 밀봉합니다. </li><li> 슬라이드 이제 현미경을위한 준비가되어 있습니다. 계속 4에 알루미늄 호일 및 매장으로 덮여 슬라이드 ° C 실험 다음 날 완료 될 경우. 슬라이드의 측면의 완전한 밀폐는 안티 - 페이드 시약을 적용한 후 24 시간을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜이 완료 된 후 슬라이드가 일주일에 이미징 될 수 있습니다. </li></ol> 6. Hybridized 프로브의 시각화 <ol><li> 현미경을 사용합니다. 표준 immunofluorescence 현미경 suffic입니다당신은 공 촛점 현미경에 대한 액세스 권한이있는 경우 실험이 종류의 ient,하지만 당신은 또한 3D 이미지이를 사용할 수 있습니다 또는 귀하의 스테인드 세포의 비디오를 얻을 수 있습니다. 현미경은 15-30 분에 따뜻하게 할 수 있습니다. 컴퓨터와 소프트웨어에 전환합니다. </li><li> immunofluorescence 현미경에 착색의 품질을 확인합니다. 몇 기생충을 포함하는 장소를 선택합니다. </li><li> 수동으로 각 레이저의 게인을 조정합니다. 픽셀이 4-6m -1의 -1과 512 X 512 픽셀의 단계에 머물러 조정합니다. </li><li> 프레임 람다를 사용하여 테스트 사진을보세요. 레이저 게인을 다시 조정. </li><li> 형광 단일 세포의 20 좋은 사진 최소보십시오. 5-20 기생충을 포함하는 필드의 적어도 2-5 사진은 긍정적 인 기생충의 비율 공정 개요를 얻기 위해 필요합니다. </li></ol>

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RNA 물고기 분석 등 북부 blotting과 RT-PCR 등의 방법에 대조적으로, 단일 세포 수준에서 특정 mRNA의 성적 차별을 할 수 있습니다. 이 P.,이 예에서는이 가능 transcriptionally 운영 중 및 운영 중지 세포 구별 할 수 있습니다 falciparum은 기생 인간의 적혈구 내부 원생 동물. 이러한 모든 세포 관찰은 종종 필요하고 중요하고 새로운 전사 패턴에게 1 낼 수 있습니다. 다른 RNA 물고기 방법은 4-10에 설명 된 있지만, P.의 동시 VAR mRNA 전사의 연구에 대한 새로운 세련된 프로토콜의 개발을위한 필요가있다 falciparum. 검색 도구로 asRNA 프로브를 사용하여 mRNA 활동의 특별한 시간적 패턴은 쉽게 셀에 지역화 할 수 있습니다. 또한, asRNA 프로브들은 구체적인 일을 지원하는...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 아세트산 </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> 338826 - 100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax 미디어 : RPMI 1640 글루타민 솔루션 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ML RPMI 1640 5 ML의 글루타민 솔루션 </td></tr><tr><td> Albumax 미디어 : Gentamycin 황산염 Albumax - 솔루션 </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 ML gentamycin 황산염 50 ML Albumax - 솔루션 </td></tr><tr><td> Albumax - 솔루션 : 하이포 잔틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g 하이포 잔틴 </td></tr><tr><td> Albumax - 솔루션 : AlbuMAX II </td><td> 나는nvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax - 솔루션 : RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4리터 RPMI 1640 최대의 자석과 디졸브. 50 ° C. 필터 살균 및 aliquots에서 -20 ° C에 저장합니다. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> 시그마 </td><td> A5710-110G </td><td> 포름 아미드를 deionize하는 수지. </td></tr><tr><td> 안티 - 비오틴 염소 PAB 퍼 옥시 데이즈의 공액 </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 잘 해봐 항체 </td><td> Novus 생체 </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI와 안티 - 페이드 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> 설치 미디어는 완전히 슬라이드를 씰링까지 24 H에 대한 치료가 있습니다. </td></tr><tr><td> 비오틴 RNA 라벨 믹스 </td><td&gt; 로슈 </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> 카메라 디지털 </td><td> 니콘 디지털 시력 DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Menzel - glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> 문화 플라스크 25cm 2 Nunclon 표면 </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / 시그마 </td><td> 32490-100ml </td><td> 1000 ML deinonized 물 1 ML DEPC. 저어 바 추가 및 12 H에 젓는다. 30 분에 압력솥. </td></tr><tr><td> 디지털 카메라 </td><td> 니콘 디지털 시력 DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads 단백질 </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 마그넷 </td><td> Invitrogen </td><td> 123 01D </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 bioultra 99% </td><td> Fluka/ 시그마 </td><td> 4만7천6백71-1리터-F </td><td> Deionized 포름 아미드 : 포름 아미드의 100 ML 당 이온 교환 수지의 5g. 30 분 저어. 워트 먼지 종이를 필터링 할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> . 젤라틴 0 75 % 솔루션 : 젤라틴 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G2500 </td><td> 500 ML RPMI 1640에 3.75 g의 젤라틴. 56 열 ° C 분해합니다. 때 56 ° C. 소독 필터 aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. </td></tr><tr><td> . 젤라틴 0 75 % 솔루션 : RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ML RPMI 1640에 3.75 g의 젤라틴. 56 열 ° C 분해합니다. 때 56 ° C. 소독 필터 aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. </td></tr><tr><td> 글루타민 용액 : L-glutamin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G3126 </td><td> 500 ML 0,9 % NaCl에서 14.6 g L의 글루타민. 용해, 필터의terilize과 aliquots에서 -20 ° C에 저장합니다. </td></tr><tr><td> 글루타민 솔루션 : HCL </td><td> 시그마 </td><td> H1758 </td><td> 500 ML 0,9 % NaCl에서 14.6 g L의 글루타민. 용해, 살균 필터링 및 aliquots에서 -20 ° C에 저장합니다. </td></tr><tr><td> 하이브리드 솔루션 : 포름 아미드 바이오 초 99% SSC 20x </td><td> Fluka / 시그마 </td><td> 4만7천6백71-1리터-F </td><td> 총 20 ML, -20에서 냉동 상태로 유지 ° C를 aliquots에 10 ML deionized 포름 아미드 </td></tr><tr><td> 하이브리드 솔루션 : Denhardt의 50x 원액 </td><td> 시그마 </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> 하이브리드 솔루션 : 효모 tRNARoche 차단 시약 </td><td> 시그마 </td><td> R-6750 </td><td> 2 ML 50x Denhardt의 ML 효모 tRNA 당 250 μl 20 밀리그램 </td></tr><tr><td><s연어 정자 DNA :&gt; 하이브 리다이 제이션 솔루션을 trong </td><td> Fluka / 시그마 </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g 로슈는 시약을 차단 ML의 연어 정자 DNA 당 10 밀리그램 (: 변성 연어 spermDNA 96 5 분에 대한 ° C 하이브 리다이 제이션 솔루션에 추가하기 전에 중요) 1 ML </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil 악기 GmbH의 </td><td> 1004-0011 </td><td> 하이브 리다이 제이션 오븐과 DEPC 물에 패드를 물렸다 RNase 무료 하이브 리다이 제이션 챔버로 대체 할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 집중 기름 UV 투명 형광 무료 </td><td> 시그마 </td><td> 10976 - 1EA </td><td></td></tr><tr><td> Immunofluorescence 또는 공 촛점 현미경 </td><td> 니콘 D-이클립스 (Eclipse) TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> 모든 약국에서 사용 가능 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x : NaCl KCl NA 2 HPO 4 X 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionized H 2 O </td><td></td><td></td><td> 7.4에 Ajust 피에이치 160g 4g 23g 4g 1리터 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4퍼센트 </td><td> Fluka / chemika </td><td> 76,240 </td><td> 80 ML PBS / DEPC에 4g PFA. PFA는 해체 ° C까지 65 열. 20 ML PBS를 추가 솔루션은 냉각 할 수 있습니다. 7.4로 산도를 조정합니다. 필터링 할 수 있습니다. -20 ° C.에서 aliquots에 저장 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4퍼센트 / 산성 아세트산 5% </td><td></td><td></td><td> 950 μl paraformaldhyde + 50 μl 아세트산 </td></tr><tr><td> 펩신 </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> 퍼 옥시 데이즈 - 복합 항비오틴 </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC - 세탁 미디어 : RPMI 1640 글루타민 솔루션 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ML RPMI 1640 5 ML의 글루타민 솔루션 </td></tr><tr><td> RBC - 세탁 미디어 : Gentamycin 황산 </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 ML gentamycin 황산염 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td></td><td> 10 MG / ML 주식 솔루션을합니다. </td></tr><tr><td> RNase 무료 1.5 ML 튜브 </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase 해치 </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> 11mm 4 우물을 슬라이드 </td><td> 열 과학 </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x : NaCl </td><td> 시그마 / 알drich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175g / L) 0.3M 오세영 3 구연산 X H 2 O는 (88 G / L) 1M HCL과 산도 7.0으로 조정 </td></tr><tr><td> SSC 20x : 나트륨 구연산의 탈수 </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175g / L) 0.3M 오세영 3 구연산 X H 2 O는 (88 G / L) 1M HCL과 산도 7.0으로 조정 </td></tr><tr><td> SSPE 20x : NaCl </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> S9625 </td><td> 175.3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x : 아뇨 2 PO 4 </td><td> 시그마 / 올드리치 </td><td> S0751 </td><td> 27.6 g 아뇨 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x : 4 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 분말 </td><td></td><td></td><td> 9.4 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 분말 DEPC 물을 추가 산도 7.4을 조정할 수 있습니다. 자동20 분에 clave </td></tr><tr><td> TNB 버퍼 : TNT 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 10 ML TNT 버퍼 </td></tr><tr><td> TNB 버퍼 : 차단 시약 </td><td></td><td></td><td> 0.05g 차단 시약 차단 시약을 분해하려면, 감동과 하나가 시간 60 ° C에 솔루션을 가열. -20 ° C.에 저장 (Perkin 엘머 TSA 프로토콜에서 파생.) </td></tr><tr><td> TNT 버퍼 : 트리스 / HCL </td><td> 시그마 </td><td> T1503 </td><td> 1M 트리스 / HCL, pH를 8.0 </td></tr><tr><td> TNT 버퍼 : NaCl </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> S9625 </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> TNT 버퍼 : Tween20 </td><td> 시그마 </td><td> 93,773 </td><td> 5 M NaCl 30 ML 한 ML DEPC DH 2 O869 랑 MI 실온에서 7.5로 산도를 조정합니다. (Perkin 엘머 TSA 프로토콜에서 파생.) </td></tr><tr><td> TSA 플러스 Cyanine3 / Fluorescein 시스템 </td><td> Perkin 엘머 </td><td> NEL753000IKT </td><td> 실험을 시작하기 전에주의 깊게 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템에서 프로토콜을 참조하십시오. </td></tr><tr><td> 멸균 튜브 14 ML </td><td> Almeco - CM LAB APS </td><td> 91,016 </td><td></td></tr></tbody></table>

rna 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

말라리아 감염 동안 인간의 내피 수용체에 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (IE)의 접착은 VAR 유전자에 의해 인코딩 PfEMP1 단백질 변형의 표현에 의해 중재됩니다. haploid P. falciparum 게놈은 하나가 감염 혈액 단계에서 한 번에 셀 당 베꼈 것으로되어있는 약 60 가지 VAR 유전자를 비호. 어떻게 VAR 유전자 전사의 이러한 상호 배타적 인 규제가 달성하는 것은 명확하지 않다, 개별 VAR 유전자 또는 P.의 임상 결과에 대한 서로 다른 수용체 및 차동 바인딩의 결과와 관련된 VAR 유전자의 하위 그룹의 식별이 falciparum 감염. 최근 상호 배타적 인 전사 패러다임은 개별 P.에 따라 전사 assays에 의해 의심을하게되었습니다 단일 INF의 falciparum 대본 확인P.의 개별 핵에있는 기생충에 의한 VAR 유전자 전사의 원위치 하이브리드 화에 RNA 형광을 사용하여 ected erythrocytic 전지 (물고기) 분석 falciparum IE 1. 여기, 우리는 P.의 단일 핵에 VAR 유전자 전사의 분석을 위해 RNA - 물고기 방법론을 수행하기위한 세부 프로토콜을 제시 falciparum은 인간의 적혈구를 감염. 방법의 사용을 기반으로 digoxigenin 및 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템 2 (Perkin 엘머), 미세 분석 갓 선택한 P.를 사용하여 안티센스 RNA 프로브에게 비오틴 - 표시 falciparum IE. 현장 하이브리드 방식의는 P.의 다른 단계에서 표현 전사와 유전자의 다양한 규제를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 falciparum 수명주기와는 다른 말라리아 기생충 종과 다른 생물과 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

그림 1은 주요 단계와 RNA 물고기 방법론의 시간 기간의 순서도를 보여줍니다. 단일 P.를 사용하여 잘하고 제대로 보존 스테인드 mRNA 생선 실험을 대표하는 일련의 이미지 falciparum IE는 그림 2에 표시됩니다. 이 세포 protozoan는 DAPI와 푸른 물들어있는 작은 (1-1.5 μm 직경) 핵이 있습니다. 배란 후 24 시간 P.의 적혈구 침공 후 falciparum은 schizogony, 즉 핵분열의 과정이 시작됩니다. VAR 유전자 전사의 최적 생선 검색이 48 시간 간 erythrocytic lytic주기를 10-22 주위에 시간에 발생합니다. 프로브는 일반적으로 아마도 핵 봉투 - 관련 endoplasmic 소포체 무엇에, 주요 핵 몸 옆에 표시 종을 mRNA에 잡종을 만들다. 행에서 좋은 품질...

형광성의<em&gt; 현장에서</em개별 셀의 mRNA 성적 증명서를 확인하는&gt; 하이브리드 (물고기) 등의 하나 이상의 회원의 동시 전사로 polygenic 활동의 분석을 할 수 있습니다<em&gt; VAR</em&gt; multigene 가정에서<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; 감염된 적혈구<sup&gt; 1</sup&gt;. 기술은 적응력이 있으며, 유전자, 세포와 생물의 다른 유형에 사용할 수 있습니다.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

말라리아 감염 중 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구(IE)가 인간 혈관 내피 수용체에 부착되는 과정은 var 유전자에 의해 인코딩되는 PfEMP1 단백질 변이체의 발현을 통해 매개됩니다. 반수체 P. falciparum 게놈은 약 60개의 서로 다른 var 유전자를 보유하고 있으며, 감염의 혈액 단계 동안 한 세포당 한 번에 하나의 유전자만 전사되는 것으로 믿어져 왔습니다. 이러한 var 유전자 전사의 상호 배타적 조절이 어떻게 이루어지는지는 아직 불분명하며, 서로 다른 수용체와 연관된 개별 var 유전자 또는 var 유전자 하위 그룹의 식별, 그리고 차별적 결합이 P. falciparum 감염의 임상 결과에 미치는 영향 또한 명확히 밝혀지지 않았습니다. 최근, P. falciparum IE의 개별 핵 내에서 기생충의 var 유전자 전사를 분석하는 RNA 형광 인시튜 하이브리다이제이션(FISH) 분석을 통해 단일 감염 적혈구 세포 내의 개별 P. falciparum 전사체를 식별하는 전사 분석법이 시행되었으며, 이로 인해 상호 배타적 전사 패러다임에 의문이 제기되었습니다. 본 논문에서는 P. falciparum에 감염된 인간 적혈구의 단일 핵 내 var 유전자 전사 분석을 위한 RNA-FISH 방법론의 상세 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 TSA Plus Fluorescence Palette System(Perkin Elmer)을 이용한 digoxigenin 및 biotin 표지 안티센스 RNA 프로브의 사용, 현미경 분석, 그리고 갓 분리한 P. falciparum IE를 기반으로 합니다. 이 인시튜 하이브리다이제이션 방법은 P. falciparum 생애 주기의 다양한 단계에서 발현되는 여러 유전자의 전사와 조절을 모니터링하는 데 사용될 수 있으며, 다른 말라리아 기생충 종 및 기타 유기체와 세포 유형에도 적용 가능합니다.

제 이름은 Elena Rand이며, 덴마크 코펜하겐 대학교의 의학 병리학 센터에서 근무하고 있습니다. 이곳에서는 전 세계 다양한 지역에서 온 약 60명의 인원이 말라리아 연구를 수행하고 있습니다. 저희 연구 그룹은 기생충인 plasmodium foci를 연구하고 있습니다.이들은 인간에게 말라리아 질병을 일으키는 가장 강력한 병원체입니다. *Plasmodium falciparum*은 숙주 세포에 대한 부착과 같은 다양한 기능을 수행하는 표면 단백질을 발현합니다. 부착 단백질 중 가장 큰 그룹은 소위 *Plasmodium falciparum* 적혈구 막 단백질 1, 즉 PfMP1이라고 불리는 단백질들입니다.적어도 60가지의 변이체가 존재하며, 감염의 혈액 단계 동안 한 번에 하나의 변이체만이 세포에서 전사된다고 믿어져 왔습니다. 본 학과에서는 기생충 내에서 동시에 하나 이상의 단백질이 전사될 수 있다고 생각합니다. 이러한 활성을 검출하는 한 가지 방법은 mRNA 형광 인시투 하이브리다이제이션(fluorescent in situ hybridization)입니다.본 연구에서는 odum FCI에 감염된 적혈구의 단일 핵 내에서 두 가지 서로 다른 유전자의 전사체인 mRNA를 검출하기 위한 맞춤형 방법을 제시합니다. 이 방법은 완료까지 이틀이 소요됩니다. 첫째 날에는 RNA 프로브를 준비하고, 이를 유리 슬라이드 상의 고정된 기생충에 첨가한 후 야간 동안 하이브리드화를 진행합니다.둘째 날에는 항체 집결, 형광 증폭 및 공초점 현미경을 통한 염색된 기생충의 시각화 과정이 진행됩니다. 실험의 개요를 제공하기 위해, 실험에 사용된 주요 시약 및 재료의 작업 흐름도가 제시되어 있습니다. RNA zap dig labeling kit biotin, RNA, labeling mix, paraform aldehyde, glacial acetic acid, pepin anti dig antibody, anti biotin antibody, TSA PL plus fluorescence palate system, DPI RNAs, free micro tubes, ETH ethanol, wiped glass slides, autoclaved cover slips, 가위 및 포셉과 같은 멸균 도구, coupling glass jar.감염된 적혈구가 적절한 발달 단계에 있는지 확인하기 위해 Giemsa 염색을 통해 점검해야 합니다. 즉, VAR 전사가 일어나는 링 단계(ring stages)가 동기화되어 있으며 상태가 양호한지 확인하는 것입니다. 전사가 일어나는 생애 주기 중 정확한 발달 단계를 선택하는 것이 매우 중요합니다.개별 RNA 종은 단계별로 생성되고, 특이적으로 전사되며, 빠르게 분해되므로, 깨끗한 유리 슬라이드 위에 매우 고품질의 얇은 혈액 도말 표본을 만들기 전에 세포를 부드럽게 세척해야 합니다. 유리 슬라이드 위에 감염된 적혈구가 균일한 단층으로 도말되면 4% paraform aldehyde 및 5% glacial acetic acid 용액에서 10분 동안 고정합니다. 그 후 유리 슬라이드를 PBS로 두 번 세척하고, 조직을 이용해 슬라이드 위의 액체를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 Pepsi를 첨가하기 전에 예열된 10 millimolar hydrogen chloride 용액으로 세포를 투과화합니다.하이브리다이제이션 전, 이를 37 °C에서 2분 동안 인큐베이션합니다. 프로브를 65 °C에서 5분 동안 변성시킨 후, 얼음에 빠르게 냉각하여 유리 슬라이드 위에 고정된 세포에 첨가합니다. 세포 위에 커버슬립을 덮고, 작은 피펫 팁을 사용하여 기포를 제거합니다. 슬라이드가 챔버 내에서 습윤한 상태를 유지할 수 있도록, 하이브리다이제이션 챔버의 주변부에 2중 증류수를 몇 방울 떨어뜨려 습도를 조절합니다.하이브리드화 과정 동안, 유리 슬라이드를 챔버에 넣고 48 °C에서 하룻밤 동안 하이브리드화합니다. 16~17시간의 하이브리드화 후, 슬라이드를 하이브리드화 챔버에서 조심스럽게 꺼냅니다. 이 단계부터는 RNase-free 환경이 절대적으로 요구되지 않습니다.TNT 버퍼가 채워진 유리 병에 슬라이드를 넣고 세척하며, 이때 커버 슬립이 유리 슬라이드에서 분리되는지 확인하십시오. 세척 과정을 3회 반복한 후, TNB 버퍼에서 30분 동안 블로킹합니다. HRP 결합 anti dig 또는 anti biotin 표지 항체를 세포에 첨가하십시오.두 종류의 표지 항체를 동시에 첨가할 수 있습니다. 세포 내에서 두 가지 mRNA 전사체를 검출하고자 하는 실험의 경우, 항체를 미리 희석해야 합니다. TNB 완충액에서 1~2시간 동안 배양하고 TNT 완충액으로 3회 세척한 다음, 세척된 세포에 희석된 FSE 또는 cyan과 같은 형광색소를 하나 첨가합니다.세 가지 용액을 즉석에서 준비해야 합니다. 이 단계부터는 슬라이드가 강한 빛에 직접 노출되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 유리 슬라이드를 형광색소와 함께 10분에서 15분 동안 배양합니다.첫 번째 배양 후 두 개의 mRNA 전사체를 검출하는 경우, 첫 번째 염료를 씻어내고 두 번째 염료를 추가하십시오. TNT Buffer로 최종 세척을 수행합니다. 슬라이드를 공기 중에서 건조시키기 전에 2중 증류수에 담그십시오.적하하고 슬라이드 위에 커버 슬립을 덮습니다. 기포를 모두 제거하고 커버 슬립의 가장자리를 빨리 마르는 매니큐어나 투명 폴리시로 밀봉합니다. 여기서는 하나의 기생충이 포함된 단일 감염 적혈구를 볼 수 있습니다.파란색인 DPE는 기생충의 DNA를 나타내며, 녹색은 전사되고 있는 한 유전자의 mRNA를 나타냅니다. 다른 이미지에서 빨간색은 또 다른 유전자의 mRNA를 나타내며, 세 번째 이미지에서는 두 유전자 전사의 이중 염색을 확인할 수 있습니다. 또한 이 이미지들은 부착된 mRNA가 핵 DNA 위에 단순히 놓여 있거나 옆에 위치하는 것이 아니라, 핵 DNA와 중첩되어 있다는 것을 보여줍니다.감염된 적혈구의 99%에서 두 유전자의 mRNA가 전사되는 것을 검출할 수 있습니다. 이 실험의 중요한 측면은 프로브가 다른 유전자에 어닐링되지 않는지 확인하는 것입니다. 이 이미지에서는 감염된 적혈구를 두 프로브와 함께 배양했지만, 하나의 프로브만 IE에 결합해 있습니다. 여기에서 다른 유전자들은 전사되고 있지 않습니다.시각화된 감염 적혈구의 다른 이미지들에서는 이러한 상황이 반대로 나타납니다. *Plasmodium falciparum* 기생충은 일반적으로 막이 잘 보존되어 있으며, DNA와 RNA 모두 뚜렷하게 염색됩니다. 어떤 이유로든 세포의 품질이 좋지 않은 경우, 염색 상태 또한 불량해집니다.이 이미지에서 보는 바와 같이, DNA와 RNA는 확산되고 뿌옇게 보이며 상대적으로 경계가 불분명하게 나타납니다. 결론적으로, 이 방법은 다른 혈액 매개 기생충에도 쉽게 적용될 수 있다고 할 수 있습니다. 또한, 우리의 전사 데이터는 감염된 세포의 표면에 발현된 pf EMP1 단백질을 표적으로 하는 특이 항체를 사용하여, 분석된 mRNA로부터 번역된 단백질을 검출하는 실험을 통해 뒷받침되었습니다.

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