Name: Picoeukaryote의 게놈 변환 Ostreococcus 타우 리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 배우세요 해양 피코 진핵류 Ostreococcus tauri의 전기천공법을 이용한 유전자 변환 기법입니다. 안정적인 형질전환주를 생성하고 선별하는 방법으로 식물 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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BBSRC과 EPSRC 수상 D019621에 의해 자금 지원 통합 시스템 생물학을위한 센터 SynthSys. FYB에 우수 &#39;마린 지​​노 믹스 &quot;보조금의 유럽 연합 (EU) FP6 네트워크는 유전자 변형 방법의 개발 자금을하고있다.

1. Algal 재료의 준비 <ol><li> Ostreococcus 전지는 인공 해수 (ASW)에서 배양해 있습니다. 바다 소금이 (리터당 일반적으로 약 40g) 30의 염분에 deionised 물속에 녹아있다 PPT 등 염도 측정기를 사용하여 측정. 1-3 테이블에 설명된대로 농축 매체 11,12, 미량 금속 원소와 비타민이 추가됩니다. 미디어는 0.22 μm의 필터를 통해 다음 필터 소독입니다. </li><li> 유지 보수의 경우 Ostreococcus 변형 OTTH95의 세포는 신선한 ASW 매 7 일 이내에 1백분의 1의 희석에 무균 하위 교양이며, 문라이트 블루 필터를 들으며 식물 성장 배양기에서 지속적인 불빛 아래에서 성장. 광 강도 가까운 20 μmol m -2 s의 -1에 있어야하며 온도는 20 ° C.에서 관리하고 있습니다 세포는 지속적인 교반이 필요하지 않지만 모든 2-3일가 집계를 방지하기 위해 한 번 흔들리고있다. </li><li> 각 변환의 경우 세포의 50 ML는 셀 드에 필요합니다하위 culturing 따라 5-7일 획득하여야 20-30 X 10 6 ML -1의 nsity. 대략 셀 밀도와 axeny는 x40의 배율의 최소한 유동세포계측법 또는 혈구계 중 하나를 사용하여 확인할 수 있습니다. </li></ol> 2. Electroporation <ol><li> 변환을 위해 DNA를 준비합니다. 각 변환의 경우 순수한 플라스미드 DNA를 linearised 5 μg은 멸균 deionised 물 1 μg / μl의 농도가 필요합니다. 다른 방법은 동일하게 잘 작동 수도 있지만이 DNA를 얻으려면, 저자, Qiagen MIDI 준비 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 사용된 벡터의 중추에서 차단 된 것을 효소 아니라 transgene 또는 선택 유전자와 제품을 소화. 또한 정화 및 에탄올 침전에 의해 결과로 선형 DNA를 집중하고, 고품질 무균 deionised 물의 적절한 볼륨의 제품을 resuspend. </li><li> 각 변형에 5 μg의 DNA를 포함하는 microcentrifuge 튜브를 준비합니다. contro각 세포주를 변환할 수 있도록없이 DNA와 나 필요합니다. 각각의 변환을위한 2 밀리미터의 electroporation cuvette과 함께 얼음이 튜브를 유지. </li><li> 변환 당 resuspension 버퍼의 2.2 ML을 준비합니다. ddH 2 O에서 1 M 솔루션에 대한 Sorbitol 디졸브, 0.1 %의 pluronic 산 F68 및 필터 - 소독을 추가합니다. </li><li> 원뿔 바닥과 50 ML 관에 최종 세포에 0.1 %의 농도 및 10에서 8000x g에서 10 분 펠릿 그들 ° C로 pluronic 산 F68을 추가합니다. 즉시 아래로 pipetting 및하여 resuspension 버퍼 1 ML에서 세포를 resuspend하고 microfuge 튜브로 전송할 수 있습니다. 10 ° C에서 8,000 XG에 10 분 동안 다운 던가, 그리고 신속하게 작업을 한번 더이 세차 단계를 반복하십시오. </li><li> 컷 팁으로 resuspension 버퍼의 40 μl 각 최종 펠렛을 resuspend. 얼음 linearised DNA의 모든 튜브에 resuspended 세포의 40 μl를 추가, 부드럽게 믹스 앤 electroporation의 cuvette에 전송할 수 있습니다. </li><li> electrop에 cuvette을 넣고연설 기계. 6 kV cm -1, 600 Ω, 25 μF로 설정을 변경합니다. 세포를 Electroporate. </li><li> 10 분 동안 상온에서 cuvettes의 electoporated 세포를 부화하고, 조직 문화 flasks를 준비하는 그 시간을 사용합니다. 그들을 분류하고 각각 신선한 ASW의 30 ML에 추가합니다. 각 플라스크 1 ML을 타고 부드럽게 해당 cuvette에 추가합니다. 2 분 동안 품어 부드럽게 ASW을 제거, 지금 부드럽게 세포의 작은 구체를 포함하고 천천히 문화 플라스크에 ASW에 직접 피펫. </li><li> 세포는 일반적으로 소구에 남아 있습니다. 이 순간 집계 세포를 흔들거나 방해하지 않도록주의를 기울입니다. 세포 1-2 시간 동안 인큐베이터에 복구하도록 허용 후 flasks 흔들어하여 resuspend. 이때 세포 자유롭게 resuspend해야하며 어떤 대단히 짧은 볼 수 없습니다. 배양기에서 하룻밤 복구하는 문화를 남겨주세요. </li></ol> 3. 세미 솔리드 중간에있는 접시에 세포의 포함 <ol><lI&gt; 그 다음날에, 저어 막대가 들어있는 병에 ddH 2 O의 2.1 % 낮은 용융 점 아가로 오스의 솔루션을 압력솥. 가열 자기 활동가에 물이 들어있는 큰 비커에 65-90 ° C에서 용융 유지. 각각의 변환 9 ASW의 ML 플러스 필요한 선택을 포함하는 8 페트리 요리 (55 밀리미터 직경), 8 X 15 ML 튜브 각각 준비합니다. Nourseothricin 또는 G418를 사용하는 경우, 2 밀리그램 / ML을 사용합니다. </li><li> 인큐베이터에서 변형 세포를 수집합니다. 멸균 flowhood에서 근무, 튜브 하나에 9 ML에 끓는 LMP 아가로 오스의 1 ML을 추가합니다. 튜브를 닫고 반전으로 섞는다. 그런 다음, 갓 변형 세포의 0.5 ML을 추가 신속하게 믹스 앤 접시에 붓는다. 나머지 7 튜브와 함께이 과정을 반복하고 다음 변환 플라스크로 진행합니다. </li><li> 아가로 오스가 설정하기 위해 번호판, 1 시간 동안 유동 후드에서 열어 둡니다. 그런 다음 접시를 닫고 4 접시를 각각 개최됩니다 커다란 사각형 배양 접시에 그들을 전송합니다. 사각형 접시의 지혜를 밀봉H parafilm. 접시가 완전히 설정되지 않습니다, 그리고 그 결과로 젤은 매우 불안정합니다. 케어는 접시를 다룰 때 젤을 깰하지 않도록 촬영해야합니다. 인큐베이터에있는 모든 사각형 접시를 놓습니다. </li></ol> 4. 변환 콜로니의 선택 <ol><li> 식민지가 변환 접시에 10~21일 후 아니라 모의 변형 접시에 나타납니다. 식민지 컷 - 오프 조언과 함께 200 μl 피펫을 사용하여 선택합니다. 간단하게 무료로 식민지를 선택하고 녹색 식민지를 빨아. 인근의 식민지에서 모든 세포를 포함하면 안됩니다. </li><li> 24 우물 판에, 선택을 포함하는 액체 매질의 2 ML로 세포를 전송합니다. Nourseothricin을 사용할 때, 1.75 밀리그램 / ML을 사용합니다. 아래로 pipetting 및하여 섞는다. 변환 당 24-50 식민지를 선택합니다. parafilm 및 보육에 대한 전송과 함께 번호판을 밀봉합니다. </li><li> 일주일 후, 24 웰스 플레이트의 선택과이 ML 신선한 ASW 각도 100 μl를 전송하고 additiona위한 성장리터 칠일. 살아남은 세포 라인들은 더욱 연구에 사용될 수 있습니다. 게놈 및 삽입 숫자로 안정적인 통합은 PCR 및 남부 얼룩을 사용하여 분석해야한다. 게놈 DNA가 식물의 DNA 추출을위한 다운 스케일 표준 방법을 사용하여 이러한 목적을 위해 얻을 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 셀 1 / 100은 7 일 동안 성장 후 밀리리터 당 25,000,000 세포 밀도에 도달 나누었습니다. 적절한 설정으로 세포 Electroporation은 시간 상수를 10 ~ 14 밀리초 결과. 세포 배양 flasks의 매체로 전송하면, 세포의 소구가 형성됩니다. 가볍게 시간 이후에 떨면서 때, 세포는 쉽게 resuspend한다. 0.2 % LMP 한천 개를 1 ML 변형 세포의 포함은 일관되지만 세미 솔리드 겔을 초래한다. 식민지는 10-21일 후에 나타납니다. 변환 당 위의 프로토콜을 사용 linearised DNA 5 μg를 변형, 50-100 식민지번호판은 일반적으로 부정적인 컨트롤 플레이트 함 비해, 예상되었다. ~ 고른 식민지의 80 %가 긍정적으로 액체 매질에서 항생제 저항에 의해 선정되었으며 후속 연구에 사용되었다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 최종 농도 </td><td> 증권 솔루션 </td><td> 1리터위한 볼륨 </td></tr><tr><td> 나노 3 </td><td> 8.83 × 10 -4 M </td><td> 75g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> NH 4 망할 CIA </td><td> 3.63 × 10 -5 M </td><td> 2.68 G / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> β-glycerophosphate </td><td> 1 × 10 -5 M </td><td> 2.16 G / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td> 1 × 10 -8 M </td><td> 1.29 MG / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 트리스베이스 (산도 7.2) </td><td> 1 × 10 -3 M </td><td> 121.1 g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> K 추적 금속 용액 </td><td></td><td> 표 2 </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> F / 2 비타민 용액에게 </td><td></td><td> 표 3 </td><td> 0.5 ML </td></tr></tbody></table> 표 1. O에의 성장을위한 매체 성분 타우 리 11, 12. 30 PPT의 염분에 인공 해수 1 리터 총 볼륨을 확인하고 표시로 주식 솔루션에서 위의 구성 요소를 추가합니다. 주내 매체 및 사용을 필터링 - 소독. 비타민 솔루션을 제외한 모든 화합물의 주식은 매체의 모든 리터를 위해이 솔루션 중 6 ML을 추가할 풀링된 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 최종 농도 </td><td> 증권 솔루션 </td><td> 1리터에 대한 금액 </td></tr><tr><td> 나이 </sUB&gt; EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) • 2 시간 2 O </td><td> 1 × 10 -4 M </td><td></td><td> 41.6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 × 10 -5 M </td><td></td><td> 3.15 g </td></tr><tr><td> 나 2 무 4 • 2 시간 2 O </td><td> 1 × 10 -8 M </td><td> 6.3 G / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 × 10 -9 M </td><td> 22.0 g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 × 10 -9 M </td><td> 10.0 g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 × 10 -8 M </td><td> 180.0 g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 × 10 -8 M </td><td> 9.8 G / L DH <sub&gt; 2 O </td><td> 한 ML </td></tr></tbody></table> 표 2. 금속 용액 11,12를 추적. DH 2 O 1 리터의 총, 그리고 해산하는 열을까지합니다. 저장 나누어지는 솔루션 및 동결. 최종 농도는 최종 매체가 아닌 추적 금속 솔루션을 참조하십시오 지적했다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 최종 농도 </td><td> 증권 솔루션 </td><td> 1리터에 대한 금액 </td></tr><tr><td> 비타민 B 12 </td><td> 1 × 10 -10 M </td><td> 1g / L DH 2 O </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 비오틴 </td><td> 1 × 10 -9 M </td><td> 0.1 G / L DH 2 O </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 티아민 • HCL </td><td> 1 × 10 -7 M </td><td></td><td> 200 MG </td></tr></tbody></table> 표 3. F / 2비타민 용액 11. DH 2 O, 필터 소독, 나누어지는 및 동결 1 리터의 총까지합니다. 최종 농도는 최종 매체가 아닌 비타민 솔루션을 참조하십시오 지적했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> 1 그림. 변환 절차의 그래픽 개요가. 유전자 electroporation에 의해 Ostreococcus 타우 리를 변환하기위한 절차의 도식 표현. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> 그림 2. 문화의 성장. 세포는 신선한 ASW의 1백분의 1의 희석 매 7 일마다에서 무균 하위 교양이며, 문라이트 블루 필터를 들으며 식물 성장 배양기에서 지속적인 불빛 아래에서 성장. 광 강도 가까운 20 μmol m -2의 -1과 온도 ° C의 세포가 일정한 교반이 필요하지 않은 20에서 관리하고 있습니다 있겠지만의 위치해야합니다집합을 방지하기 위해 모든 2-3일 회 haken. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> 그림 3. 0.2 % LMP 아가로 오스의 콜로니 형성. 큰 사각형 배양 접시에 전송 4 접시, 그리고 parafilm (맨 왼쪽)과 인감. 콜로니가 형성되면, 단순히 무료 (이상적으로 conically 모양의) 식민지 (오른쪽 위)를 선택하고 p200의 피펫과 접시 밖으로 빨아. 부정적인 컨트롤 (오른쪽 하단)에는 식민지이 없어야합니다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

세포 주 및 문화 axeny은 변환 과정에 중요한 중요하다. 세포는 일반적으로 빛의 12 시간주기에서 유지되고 있지만, 12 시간 어둡고, 이러한 조건 하에서 성장 세포의 변환 효율이 부족한 것으로 밝혀졌다. 반복 pelleting / resuspension 단계 동안, 세포는 항상 쉽게 resuspend한다. 세포의 집계, 또는 가래 같은 물질이 존재할 경우, 다시 처음부터 절차를 시작하는 것이 좋습니다. 일반적으로 ~ 50 콜로니는 부정적인 컨트롤 접시 없음 비해, 각 변환 접시에 기대할 수 있습니다. 낮은 변환 효율 경우에는 culturing 조건은 세포가 최적의 상태에 있도록 다양한되어야합니다. 변환 효율에 영향을 미치는 변수는 주위 실험실에서 온도 (주변 20 ° C로 함) 및 처리 속도를 (세포에게 [2.3] 회복에 대한 [2.7]을 pelleting의 절차 ~ 1 시간 정도 소요됩니다)가 있습니다. 그것은 또한 중요하다 모든 솔루션다시 각각의 변형 전에 신선했다. 접시에 포함시킬 경우, LMP 아가로 오스의 농도는 Ostreococcus 전지는 높은 아가로 오스의 농도에서 성장하지 않습니다. 중요하고, 낮은 농도로 확산됩니다. Ostreococcus 위해 만세 변환 벡터는 이전에 다음 여섯 출판되었으며, 더 많은 벡터가 생성하고 곧 출판할 예정이다. Potox 벡터 6 Ostreococcus에서 촬영한 강력한 inducible 13 promotor를 전해준 반면 기존의 벡터 주전자 룩 6, 빠른 유전자 변형 라인 선택 플러스 다루기 쉬운 표현 패턴을 허용 C-단자 반딧불 루시페라제 태그와 함께 선택의 promotor의 사용을 허용 관심있는 유전자의 overexpression에 대한 고친 화성 인산 수송 (HAPT) 유전자. Potox 룩 벡터는 overexpression 라인 간접 선택에 사용할 수있는 추가 루시페라제 마커를 들고, Potox에서 유래 <s14&gt;까지. 이러한 벡터에 대한 성공적인 선택 마커 Nourseothricin와 G148입니다. 그러나 Ostreococcus 세포는 여러 항생제에 높은 내성이며, 유전자 변형 Ostreococcus 전지의 선정에 필요한 화합물의 농도는 기존 모델 시스템 (2 밀리그램 / ML)에 비해 높다. 프로세스가 비효율적 보이지만 세포이 절차에 필요한 플라스미드 DNA의 다수는 더 큰 장애물을 포즈 없습니다. 큰 제한은 선택 마커에 강한있는 모든 생성된 라인 전체 구조는 DNA에 통합되어 있는지 확인하기 위해 개별적으로 분석해야한다는 것입니다. 우리는 선택할 수있는 마커를 성공적으로 표현 관심의 실제 유전자의 삽입에 해당하지 않은 것들에 예제를 감찰하러 온 적도, 즉 부분적인 통합이 발생할 수 있습니다. 결국, 게놈에 무작위로 삽입도이 방법을 사용하여 삽입 사이트에 대한 통제가 없다는 것을 의미하고, 방법 B동종 재조합에 ased 현재 개발되고있다. 그러나, 방법은, 우리의 가장 중요한 지식까지, 여기 유전자 변형 Ostreococcus 세포를 생성하는 현재 유일한 특성화 방법을 설명했다. Ostreococcus 타우 리가 최근에 실험적인 모델 생물로 사용되고 마찬가지로,이 전지 작업에 대부분의 방법은 진화와 관련된 성장 연구 커뮤니티에 의해 세련되지 가능성이 높습니다. 이 프로토콜은 사람들이 Ostreococcus 함께 작업을 시작할 수 있도록하기위한, 그런데 방법으로이 microalga의 게놈 변이에 대해 알고있다 모두를 설명하는 데 있다고 주장한다. 독자가 작은 incubators의 차이 (조명 수준이나 품질) 및 기타 매개 변수가 존재합니다로서 자신의 요구에이 프로토콜을 적응하고 가능성이 필요한 건강한 문화를 얻기 위해 모든 개별 연구실에 최적화해야 할 수있을 것이라고 저자 신뢰 프로토콜. 습득 후 기술, 여기에 설명된벡터는 promotors의 범위의 통제하에 발광, 형광 또는 기타 태그가 퓨전 라인을 생성하는 건설 수 있습니다. 이 흥미 진진한 소설의 실험 플랫폼은 복잡한 생화 학적 문제 pharmacological 접근은 고도 3 촉진되는 감소 복잡도의 진핵세포 생물에서 해결하는 방법을 공부하는 것이 유용할 것이다.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 중간 성분 </td></tr><tr><td> 화학 </td><td colspan="2" > 카탈로그 번호 </td><td> 공급 </td></tr><tr><td> 인스턴트 오션 마린 솔트 </td><td colspan="3"> 에서 <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> 또는 <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> 나노 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> NH 4 망할 CIA </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 글리세롤 2 - 포스 페이트 나트륨 소금 하이드 레이트 </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 울트라 순수 트리스 </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 나이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) • 2 시간 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157,740 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 나 2 무 4 • 2 시간 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31,277 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 비타민 B 12 (cyanocobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 비오틴 </td><td colspan="2"> 47,868 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 티아민 • HCL </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> 네오 마이신 </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td colspan="4"> culturing위한 소모품 </td></tr><tr><td colspan="2"> 아이템 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 공급 </td></tr><tr><td colspan="2"> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T25 서스펜션 문화 </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T75 서스펜션 문화 </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starsted티 </td></tr><tr><td colspan="2"> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T175 서스펜션 문화 </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP 병 톱 필터, 1L, 완료 </td><td> 99950T </td><td> Bioscience 헬레나 </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP 병 상단 필터, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience 헬레나 </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP 병 톱 필터, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience 헬레나 </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP 병 톱 필터, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience 헬레나 </td></tr><tr><td colspan="2"> 해양 수족관을위한 염도 측정기 </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > 변환을위한 화학 물질 </td></tr><tr><td> 화학 </td><td> 카탈로그번호 </td><td> 공급 </td></tr><tr><td> D-Sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 솔루션 </td><td> P5556-100ML </td><td> 시그마 </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51,000 </td><td> 베르너 </td></tr><tr><td> 낮은 용융 점 아가로 오스 </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> 변환을위한 소모품 </td></tr><tr><td> 아이템 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 공급 </td></tr><tr><td> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T25 서스펜션 문화 </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> 채널을하고 있는걸과 통풍 조직 배양 플라스크 T75 서스펜션 문화 </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> 조직 배양 플라스크는 T175 서스펜션 잘라내기ltures는 채널을하고 있는걸과 통풍 </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner의 원심 분리기 튜브 50ml </td><td> 227,261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> 진 Pulser / MicroPulser Cuvettes 0.2 cm 간격, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> 바이오 방사선 </td></tr><tr><td> 페트리 접시 둥근 PS 3 통풍구 H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR 인터내셔널 </td></tr><tr><td> 조사 맑은 120mm 의한 멸균 네 통풍구의 폴리스티렌과 페트리 접시 광장 </td><td> FB51788 </td><td> 피셔 과학 </td></tr><tr><td> 문라이트 블루 라이트 필터 </td><td> 183 </td><td> 리 조명 </td></tr></tbody></table>

picoeukaryote의 게놈 변환<em&gt; ostreococcus 타우 리</em

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

식물 과학의 급속한 발전을 방해 일반적인 문제는 세포, 조직과 전체 유기체의 복잡하고 높은 식물의 간단한 유전자에 영향을 미치는 게놈 중복 특히 높은 수준을 포함​​합니다. 소설 모델 유기체 Ostreococcus 타우 리가 날짜로 알려진 작은 자유 생활 진핵세포 생물이며, 당 가장 organelles 중 하나 (mitochondrion, 엽록체, 잠돌군 Zz 스택)의 존재에 의해 나타냄 크게 감소 게놈의 크기와 셀룰러 복잡성 1,2를 가지고 셀, 오로지 ~ 8000 유전자를 포함하는 게놈. 또한, unicellularity 쉽게 문화의 결합 화학 생물 접근 의무가 플랫폼을 제공합니다. 최근 Ostreococcus이 성공적으로 circadian 측정 3-6 근본 기본적인 메커니즘을 연구하기 위해 고용되었다. 이 모델 생물의 결과는 또한 포유류의 생물학 7 식물 과학뿐만 아니라 영향을했지만. 이 예제에서 얼마나 빠른 실험을 강조녹색 혈통에서 간단한 진핵세포 생물은 낮은 복잡도의 배경으로 기술적으로 실현 가능한 방법을 사용 testable 가설을 생성하여보다 복잡한 유기체의 연구를 가속화할 수 있습니다. 게놈과 유전자를 수정하기위한 가능성에 대한 지식은 어떤 모형 수종에 필수적인 도구입니다. 유전자 Ostreococcus를 변환하기 이전에 보고된 방법 6,10가 전세계적으로 몇 가지 실험실로 알려진 반면 게놈 1, Transcriptomic 8이 종족에 대한 Proteomic 아홉 정보는 자유롭게 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 실험 방법은 유전자 electroporation에 의해 구조가 자세히 설명뿐만 아니라 변형 라인의 선택에서 발생하는 허용하는 낮은 비율 아가로 오스의 변형 세포를 포함하는 방법있다 overexpression로이 소설을 모델 유기체를 변환하는 방법 하나는 휴대폰을 바꾸었다. Ostreoco의 성공적인 응용 프로그램에 따라circadian 연구 ccus, Ostreococcus에 관심이 점점이 biotechnological 분야를 포함하여 식물의 과학, 내 및 외부의 다양한 연구 분야에서 기대할 수 있습니다. 보존 생화 학적 경로에서 작동 생물 학적 및 의료 과학의 광범위한 범위에서 연구가 더 큰 모델 종의 게놈과 organismal 복잡도에서 해방 Ostreococcus에서 추구하는 연구를하는 것이 좋습니다.

이 문서는 단세포 해양 alga의 유전자 변형을 설명합니다<em&gt; Ostreococcus 타우 리</em&gt; electroporation에 의해. 이것은 진핵 생물은 크게 감소 게놈 및 세포 복잡 possesing과 세포 배양 및 화학 생물학 모두에게 쉽게받을 수있는 권력으로 높은 식물을위한 효과적인 모델의 플랫폼입니다.

Picoeukaryote의 게놈 변환<em&gt; Ostreococcus 타우 리</em

식물 과학에서 신속한 진전을 저해하는 일반적인 문제로는 세포, 조직 및 개체 전체의 복잡성과 특히 높은 수준의 게놈...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 새로운 모델 생물체이자 해양 피코 진핵 조류 종인 Austria Occus Tori의 안정적인 형질전환 라인을 생성하고 선별하는 것입니다. 이는 먼저 회당 50 milliliters의 고농도 ALG 배양물로부터 세포 펠릿을 생성함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 세포를 선형화된 DNA와 혼합한 후 전기천공법을 실시하는 것입니다.신선한 배지에 형질전환된 세포를 희석하여 하룻밤 동안 배양한 후, 0.2% 저융점 아가로스와 선택제를 첨가하고 이 혼합물을 작은 페트리 접시에 붓습니다. 마지막 단계는 지속적인 청색광 하에서 2~3주 동안 배양한 후 생성된 콜로니를 선별하는 것입니다. 최종적으로 액체 배지에서의 선별과 PCR 및 서던 블롯과 같은 후속 분자 분석을 통해 생성된 형질전환 라인의 게놈에 구성물이 성공적으로 삽입되었음을 확인합니다.Arabidopsis와 같은 기존 모델 생물 대신 이 생물을 사용하는 주요 장점은 유전체 복잡성을 크게 줄여 유전적 중복이 거의 없는 배경에서 조절 네트워크를 연구할 수 있다는 점입니다. 저희 실험실에서는 식물 생체 시계를 연구하기 위해 osteo occus를 사용해 왔지만, 이는 다른 많은 복잡한 세포 네트워크 연구에도 활용될 수 있습니다. 따라서 이 기술의 함의는 식물 생물학의 영역을 훨씬 넘어 확장됩니다.개별 단계는 상당히 간단해 보이지만, 세포의 적절한 처리와 효율적인 작업 흐름이 좋은 결과를 얻는 데 필수적이므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차의 일부는 실험실 연구 보조원인 Culin Kish가 시연할 예정입니다. Austria Occus 세포는 인공 해수 또는 SW에서 배양하며, SW를 준비하려면 리터당 40g을 용해합니다.탈이온수에 해염을 첨가하여 측정 염분 30 ppt(parts per thousand)가 되도록 합니다. 염도계를 사용하여 농축액, 배지 미량 금속 원소 및 비타민을 추가한 다음, 0.22 micron 필터로 여과 멸균하여 지속광 하의 해수(SW)에서 Austria cocus strain O TT H 95의 조세포를 배양합니다. 문라이트 블루 필터가 장착된 식물 성장 배양기 내의 광강도는 20 micromoles per meter square per second에 가깝게 설정하고, 온도는 20 degrees Celsius로 유지합니다. 세포에 지속적인 교반은 필요하지 않으나, 응집을 방지하기 위해 2~3일마다 한 번씩 흔들어 줍니다.유지 관리를 위해, 7일마다 신선한 SW에 1:100 희석 비율로 세포를 무균적으로 계대 배양하십시오. 각 형질전환에는 세포 밀도가 20~30 × 10⁶ cells/mL인 세포 50 mL가 필요합니다. 이 밀도는 계대 배양 후 5~7일 후에 도달해야 합니다.대략적인 세포 밀도와 축은 최소 40배율의 혈구계수기(hemocytometer)로 추정하거나, 가급적 유세포 분석법(flow cytometry)으로 측정하는 것이 좋습니다. 여기 건강한 배양 상태와 그렇지 않은 배양 상태의 예시가 나와 있습니다.각 바이오 파라미터 플롯은 y축에 측방 산란광(side scatter) 또는 SSC를, xaxis에 세포당 적색 형광 또는 FL3를 나타냅니다. FL3는 엽록소 적색 형광을 나타내며, SSC는 상대적인 세포 크기를 나타냅니다. 건강한 세포는 Austria Occus 윈도우 내에 위치하는 반면, 사멸하는 세포나 오염된 박테리아는 이 윈도우 밖에 위치합니다.이상적으로는 99% 이상의 세포가 Austria Occus 윈도우 내에 위치해야 합니다. 효율적인 유전자 형질전환을 위해, 각 형질전환에는 1 µg/µL 농도의 1 µg 순수 선형화된 플라스미드 DNA가 필요합니다. 멸균된 탈이온수 내에서, 사용된 벡터의 백본 부위를 절단하지만 트랜스진이나 선택 유전자는 절단하지 않는 효소에 의해 플라스미드를 선형화하였습니다.각 형질전환을 위해 DNA가 포함된 마이크로 원심분리 튜브를 2mm 전기천공 큐벳과 함께 얼음 위에 보관하십시오. 형질전환할 각 세포주마다 DNA가 없는 대조군이 필요합니다. 각 형질전환 시, 50 milliliters의 세포를 원뿔형 바닥 튜브로 옮기고 0.1%onic acid F 68을 첨가한 후, 10 °C에서 8,000 ×g로 10분 동안 원심분리하십시오.세포를 펠릿화하려면 즉시 상층액을 제거하고 세포에 Resus suspension buffer 1 mL를 추가합니다. 피펫팅으로 세포를 재부유시킨 후 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 10 °C에서 8,000 ×g로 10분간 원심분리합니다. 빠르게 작업하여 두 번째 원심분리 후 세포를 한 번 더 세척합니다.P 200 팁 끝을 잘라 각 펠릿을 40 µL의 Resus suspension Buffer에 재현탁합니다. 재현탁된 세포 40 µL를 얼음 위에 둔 선형화된 DNA가 들어있는 각 튜브에 넣습니다. 부드럽게 섞은 후 전기천공 큐벳으로 옮깁니다.큐벳을 전기천공 장치에 넣습니다. 설정을 6 kV/cm, 600 Ω 및 25 µF로 조정합니다. 전기천공 후 세포를 처리합니다.큐벳에 담긴 세포를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이 시간 동안 조직 배양 플라스크에 라벨을 붙이고, 각 플라스크에 신선한 a SW 30 milliliters를 넣습니다. 각 플라스크에서 a SW 1 milliliter를 꺼내 해당 큐벳에 조심스럽게 넣고 2분 동안 배양합니다.다음으로, 세포 덩어리가 들어 있는 a SW를 조심스럽게 제거하고, a SW로 천천히 그리고 부드럽게 옮겨줍니다. 배양 플라스크 내에서 세포들은 보통 커다란 Glo 형태로 유지됩니다. 이때 응집된 세포들을 흔들거나 자극하지 않도록 주의하십시오. 인큐베이터에서 1~2시간 동안 세포를 회복시킵니다.마지막으로, 플라스크를 수동으로 흔들어 세포를 재현탁합니다. 이 시점에서 세포는 자유롭게 재현탁되어야 하며 덩어리가 보이지 않아야 합니다. 전기천공법 다음 날까지 배양물을 인큐베이터에서 하룻밤 동안 회복시킨 후, 마그네틱 바가 들어 있는 병에 2.1% 저융점 agarose 용액을 2차 증류수에 만들어 오토클레이브합니다.가열 교반기가 있는 물이 담긴 더 큰 비커 내에서 65 to 90 °C의 온도로 용융 상태를 유지하십시오. 각 형질전환마다, 9 mL의 SW+ 선택 배지가 각각 들어 있는 50 mm 페트리 접시 8개와 50 mL 튜브 8개를 준비하십시오.배양기에서 형질전환된 세포를 수집합니다. 이 과정에서 가장 어려운 부분은 세포가 과도한 열에 노출되어 손상되지 않도록 하면서 형질전환된 세포를 저농도 agros 겔에 포함시키는 것입니다. 따라서 멸균 클린벤치 내에서 다음 몇 단계의 과정을 신속하고 효율적으로 수행하는 것이 중요합니다.끓는점에 가까운 저융점 한천(low melting point agarose) 1 mL를 SW 9 mL에 추가합니다. 튜브 중 하나를 닫고 뒤집어 섞어줍니다. 다음으로, 갓 형질전환된 세포 0.5 mL를 추가합니다. 튜브를 빠르게 닫고 뒤집어 섞은 후, 그 내용을 페트리 접시에 붓습니다.남은 7개의 튜브에 대해 이 과정을 반복한 후, 다음 형질전환 플라스크로 진행하십시오. 어레이가 굳을 수 있도록 흐름 후드(flow hood) 내에서 접시를 한 시간 동안 열어두십시오. 그런 다음 접시를 덮고, 원형 접시 4개를 담을 수 있는 커다란 정사각형 페트리 접시로 조심스럽게 옮기십시오.디쉬가 완전히 굳지 않았으므로 젤이 매우 취약합니다. 디쉬를 다룰 때 젤이 깨지지 않도록 주의하십시오. 사각 디쉬를 파라필름으로 밀봉하여 인큐베이터에 넣으십시오.콜로니가 나타나면, 컷오프 팁이 장착된 200 µL 파이펫을 사용하십시오. 멸균 후드 내에서 콜로니를 선택하려면, 서로 떨어져 있는 콜로니 중에서 녹색 콜로니를 선택하여 흡입합니다. 이때 주변 콜로니의 세포가 포함되지 않도록 주의하십시오.선별제가 포함된 2 mL의 액체 배지로 세포를 옮깁니다. 24-웰 플레이트에서 피펫팅하여 혼합합니다. 형질전환당 24개 또는 48개의 콜로니를 선별한 후, 플레이트를 파라필름으로 밀봉하여 배양기로 옮깁니다.일주일 후, 각 웰에서 100 µL를 취해 선택 배지가 포함된 2 mL의 신선한 SW로 옮깁니다. 24-웰 플레이트에서 7일간 더 배양합니다. 생존한 세포주는 5 µg의 선형화된 DNA를 형질전환하여 후속 연구에 사용할 수 있습니다.본 프로토콜을 사용하면, 2~3주 후 형질전환 플레이트당 20~60개의 콜로니가 나타나야 합니다. 선택한 콜로니의 약 80%가 액체 배지에서 항생제 내성을 통해 양성으로 선택되었으며, 이 절차에 따라 후속 연구에 사용되었습니다.형질전환 후에는 PCR이나 Southern blot과 같은 다른 방법을 통해 trench 유전자의 삽입 횟수와 위치를 확인할 수 있습니다. 이 기술을 통해 생체 시계 및 세포 주기 분야의 연구자들은 새로운 모델 생물인 Austria Caucus. Tori의 각 시스템이 가진 복잡한 구성 요소와 동작 방식을 이해할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 형질전환 Austria caucus 라인을 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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연구

JoVE Journal

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생물학

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출처: Stefan, A., et al., 대장균에서 단백질 공동 발현의 다면적인 이점. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 세포 준비, 전기천공, 회수 및 형질전환체 선택을 포함하여 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드로 대장균 을 형질전환하는 절차를 보여줍니다.

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엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

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단백질 동시 발현은 단백질 복합체의 in vitro 재구성에 대한 강력한 대안이며 in vivo에서 생화학 및 유전자 검사를 수행하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 얻고 세포의 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 대장균에서 단백질 공동 발현을 사용하는 것에 대해 보고합니다.

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배우세요 해양 피코 진핵류 Ostreococcus tauri의 전기천공법을 이용한 유전자 변환 기법입니다. 안정적인 형질전환주를 생성하고 선별하는 방법으로 식물 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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