Name: Prions의 단백질 Misfolding의 순환 증폭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 단백질 미스폴딩 순환 증폭(PMCA) 기법을 사용하여 햄스터 적응 프리온 균주를 시험관 내에서 증폭하는 방법을. 이 기법은 프리온 전환 메커니즘과 종 간 장벽 연구에 활용됩니다.

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우리는 원고의 중요한 읽기에 대한 박사 개밥 바라기 철 마리 라모스 감사드립니다. 이 작품은 연구 자원에 대한 국립 센터 (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 및 G20RR024001)과 국립 신경 질환 연구소와 스트로크 (2R01 NS052609)에 의해 지원되었다.

1. 장비 준비 <ol><li> Misonix 3000이나 37 일정 온도를 유지하기 위해 열 전자 Neslab EX-7 물 목욕 (이케아, NH)에 연결 Misonix 4000 sonicator (Farmingdale, NY) ° C.를 사용하여 열 과학 (Waltham, MA)에서 얻은 돔 캡 200 μl 얇은 벽 PCR 관 스트립의 샘플을 Sonicate. </li><li> 새로운 sonicator는 지속적인 작동 9 &#39;브레이크에서 &quot;기간이 필요합니다. 두 달간 브레이크의 기간은 10로 설정 진폭 수준 40 초 sonication 버스트 10 분 부화 사이클 구성되어 있습니다. 하나는 티타늄 microplate 뿔 (그림 1, 패널 B)의 표면에 걸쳐 침식을 준수해야합니다. 순환 물은 티타늄 microplate 뿔의 침식으로 인해 흰 유탁을 찾습니다. 매일이 물을 교체합니다. </li><li> PRP SC의 증폭은 microplate의 뿔에 걸쳐 다양합니다. 가장 PRP SC 증폭 효율에서 구할 수 있습니다microplate 뿔 (그림 1, 패널 C 참조)의 중심에서 5cm의 반경입니다. </li><li> PMCA 중 하나 라운드는 144 사이클을 구성되어 있습니다. 각주기는 5 초 sonication과 10 분 부화로 구성됩니다. 이 약 PMCA의 원형 당 24 시간에 수반합니다. </li><li> sonicator의 제어판에 표시 sonication의 전원 출력은, sonicator의 랙과 물 목욕에서 순환 물 온도에 존재하는 PCR 튜브의 수에 따라 다릅니다. 물이 37 ° C에서 equilibrated 있는지 확인하고, sonicator의 튜브 랙 (그림 1, 패널 C)의 약 30 % 이상을 입력하지 않습니다. microplate의 뿔을 통해 PCR 튜브를 분산. PCR 관 스트립 사이의 빈 공간의 적어도 하나의 행을 가지고 (그림 1, 패널 C) 스트립 당 서로 연결 더 이상 사 이상 튜브를 할 수 있습니다. </li><li> sonication의 힘은 성공적으로 prion 변형 증폭을위한 중요합니다. sonicating 동안 전원 출력을 가지고 진폭을 조정155 ~ 170w 사이에 이르기까지. 저희 연구실에서 전력 수준은 각각 여섯 Misonix 3000 및 Misonix 4000 7로 설정되어 있습니다. </li><li> 하드 물 얼룩을 축적 방지하기 위해 물 욕조에 증류수를 사용합니다. 이 물 주간를 교체합니다. 부화와 sonication 사이클 동안, 물 응축의 microplate 통 뚜껑 안쪽에 발생합니다. 그림 1, 패널 A. 같이 결로를 방지하려면 sonicator의 인클로저 상자의 상단에 작은 수족관 열 패드를 부착 </li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 동물을 포함한 모든 절차가 크 레이튼 대학 기관 동물 케어의 승인을위원회를 사용하여 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수했다. 조직의 수집하기 전에 동물이 anesthetized 및 transcardially 얼음처럼 차가운 인산염을 사용하여 perfused해야합니다은 뇌에서 피를 제거하고의 억제를 방지하기 위해 산도 7.4에서 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 생리 식염수를 버퍼혈액에 7 PMCA 반응. 무균 기술을 사용하여 빠른 속도로 동물 조직을 수집하고 각 prion 변형을위한 전용 분해 도구를 제공합니다. 절개 후, 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 조직을 배치, 플래시 드라이 아이스에 고정하고, -80에서 보관 ° C를 균질화까지. </li><li> PMCA 기판 (PRP C) 솔루션을 준비하려면 Tenbroeck 조직 분쇄기를 사용하여 얼음 차가운 변환 버퍼와 10 %의 중량 / 부피 (w / V) 솔루션 (3 부 참조)에 감염되지 않은 햄스터 뇌를 (UN BH) 균질화. homogenizing 있지만, 솔루션의 거품 과도한 방지하기 위해 그라인더 내부에 공기를 얻을하지 마십시오. 30 초와 나누어지는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 표면에 뜨는 500 XG에 centrifuging하여 솔루션을 명확히하십시오. -80에서 저장 ° C 더 사용까지. </li><li> PMCA 씨 (PRP SC) 솔루션을 준비하려면, 얼음 차가운 wate하는 10 % w / V 솔루션으로 전염성 물질 (뇌, 비장, 림프절, 다른 조직이나 오염 된 토양)을 균질화0.6 ML의 microcentrifuge 튜브의 연구와 나누어지는 솔루션입니다. -80에서 저장 ° C 더 사용까지. </li></ol> 3. 변환 버퍼를 준비 <ol><li> 50 ML의 용적 플라스크 (결과는 트라이 튼 X-100의 1 % 최종 농도)을 (; Steinheim, 독일 시그마 - 알드리치 GmbH의)에서 트리톤 X-100의 0.5093 g 무게. </li><li> 하나의 완전한 단백 분해 효소 억제제 태블릿 (, 만하임, 독일 로슈 진단 GmbH가)를 추가합니다. </li><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.0931 g (이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 MM 최종 농도가 높아집니다) (, Phillipsburg, NJ Mallinckrodt 베이커 주식회사)를 추가합니다. </li><li> 1N NaOH를 7.4로 산도를 조정합니다. </li><li> Dulbecco의 인산과 50 ML에 볼륨을 조정합니다 (, Manassas, VA Mediatech 주식회사) (DPBS) 식염 버퍼링. </li><li> 진공 여과 장치와 0.45 μm의 니트로 셀룰로스 막 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. 변환 버퍼는 더 이상보다 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 4. PMCA를 사용 Prion의 변종의 증폭 <ol><li>PCR 튜브에 1시 20분의 비율 (PMCA 씨와 PMCA 기판의 95 μl의 예 혼합 5 μl)에 PMCA 기판에 PMCA의 씨앗을 희석. -80에서 15 μl 나누어지는을 제거하고 저장 ° unsonicated 제어를위한 C,이 unsonicated 제어는 서양 얼룩 (WB) 분석에 의해 다음 proteinase K (PK) 소화를 통해 PRP SC 증폭을 수량화하는 데 사용됩니다. 추가 unsonicated 제어는 PMCA 반응의 기간 동안 37 ° C에서 두 번째 15 μl 나누어지는을 배치에 의해 생성 될 수 있습니다. 세 반복의 최소 통계 목적을 위해 필요합니다. </li><li> 제목 그림 1에 설명 된대로 PMCA 중 하나 라운드에 샘플의 나머지 (70 μl), 패널 A. 흔들어서는 튜브 PCR 튜브의 돔 뚜껑에 물 응축을 방지하기 위해 매 5 시간입니다. </li><li> 샘플의 튜브는 아래 돌다가 부드럽게 homog 보장 할 절차 후 열기 전에 (솔루션 돔 모자에 가서하지 않는 것이 조심하는) vortexed해야eneity하고 잠재적 인 오염을 피할 수 있습니다. </li><li> 짧은 잠복기의 변종 (예 : HY TME, HaCWD, 또는 263K)의 시리얼 PMCA (sPMCA)의 경우, 신선한 감염되지 않은 95 μl로 라운드에서 sonicated 샘플의 5 μl를 전송하여 1시 20분의 비율에 sonicated 자료를 희석 뇌 homogenate (그림 2, 패널 B). </li><li> 긴 잠복기의 변종 (예 : DY TME, 139H, 22CH, 22AH, 또는 ME7H)의 sPMCA를 들어, 신선한 감염되지 않은 50 μl로 라운드에서 sonicated 샘플의 50 μl를 전송하여 1시 1분의 비율에 sonicated 자료를 희석 뇌 homogenate (그림 2, 패널 B). </li><li> 이전에 희석 sonicated 혼합물 (단계 4.4 또는 4.5)에서 두 15 μl aliquots를 제거하고 -80에서 둘 중 하나를 저장하는 37 번 ° C와 다른 ° C (PMCA 2 회전 unsonicated 제어 솔루션). PMCA 두번째로 생물 될 수 있습니다. </li><li> 이 절차는 무한정 반복 할 수 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는변경되지 않은 나머지 변형 특성 15 PMCA 라운드까지 수행했습니다. </li><li> PK는 샘플을 소화. 전형적인 WB의 경우, 5 샘플의 PK 80 μg / ML 5 μl (이 솔루션은 40 μg / ML의 최종 PK 농도를해야합니다)의 μl 한 시간 동안 37 ° C에서 배양을 섞는다. 겔로드 버퍼의 10 μl를 추가합니다. 10 분에이 솔루션을 끓일. 솔루션은 냉각과 젤에 10 μl를로드 보자. </li><li> 증폭의 성공을 계산하는 것은 하나에 비교하여 증폭 PRP SC의 양을 추정하기 위해 PK-소화 샘플에 WB 분석을 수행 unsonicated 컨트롤 20,21 그림 2, 패널 C 또는 알려진 금액으로는 재조합 PK-소화되지 않은 PRP. </li></ol> 5. 교차 오염을 방지 중요한 단계는 교차 오염 및 단백 분해 효소 방지 제품의 드 노보 형성으로 인해 잘못된 반응의 발생을 최소화하기 위해 이동해야합니다. </P&gt; <ol><li> 각 prion 변형에 대한 샘플 수집을 위해 분해 도구 전용 세트를 (즉, 집게, 핀셋, 가위)를 사용하십시오. </li><li> PMCA 기판으로 사용할 감염되지 않은 머리를 homogenizing하기 전에, 1 %의 표백제와 피펫을 닦으십시오. 10 분에 1 %의 표백제와 sonicator의 PCR 튜브 랙, 조직 homogenizers, 그리고 PCR 튜브 스토리지 랙을 만끽하고 증류수로 철저히 씻어. </li><li> 신선한 Versi - 드라이 랩 뱅이 새로운 샘플 균질 할 수있는 모든 시간과 작업 공간을 커버, 새로운 PMCA 실험이 준비되어야하는 때 또는 sPMCA 라운드 사이에 aliquoting. </li><li> 새로운 장갑에게 새로운 샘플 (sPMCA 라운드 사이의 aliquots를 전송할 특히) 처리 할 때마다 사용합니다. </li><li> 각 PMCA주기에 짧은 sonication의 폭발을 사용합니다. 10 분 부화와 함께 5 초에서 sonication의 사이클이 드 노보 PRP SC 1,20,21,23,24를 생성하지 않고 prions를 증폭하기에 충분한 것입니다. 다른 연구소가 게재 한 바와 같이, 증가sonication 시간은, sonication의 진폭을 증가하고, PMCA 사이클의 수를 확장하는 데 노보 PRP SC 형성 2에 대한 가능성을 증가시킵니다. </li></ol>

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</ol>

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증폭기 전염성 prion 단백질의 과제는 생체 실험의 긴 잠복 기간 및 비용입니다. PMCA 기술은 전염성 prion 요원을 증폭 할 수있는 비용 효과적인 수단입니다. 여러 실험실 정확하게 체외 7, 9, 12, 14, 19,24에 prion의 긴장을 증폭 할 수 PMCA의 능력을 확인하고 있습니다. Prion 질환은 종 사이에 전염 될 수 있습니다. Bessen 및 습지 효과적으로 두 개의 햄스터 파생 prion의 변종 5 제작 보낼 수있는 밍크 뇌병증와 햄스터를 주사했습니다. 우아한 연구에서, 말하기 및 동료는 마우스 파생 prion 변형, RML을 확대하려면 sPMCA를 사용 cervid PRP C 표현 형질 전환 생쥐를 사용 - PMCA 기판으로 (TG (CerPrP) 1536 + /)를. 질병의 빠른 발병은 TG의 접종 (CerPrP) 이후에 관찰 된 1,536...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td> 제조업 자 </td><td> 고양이. 수 </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck의 조직 그라인더 </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab EX-7 물 목욕 </td><td> 열 전자 </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> 0.2 ML PCR 튜브 스트립 </td><td> 열 과학 </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> 전체 프로테아제 억제제 </td><td> 로슈 </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> JT 베이커 </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt 베이커 Mediatech </td><td> 21-031 CV </td></tr><tr><td> Versi - 드라이 랩 Soakers </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Repti 칼로리 히터 </td><td> 동물원 메드 랩 주식회사 </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

prions의 단백질 misfolding의 순환 증폭

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions 동물과 인간 9,18에 필연적으로 치명적인 전도 할 수있는 해면상 뇌병증 (TSE)을 일으킬 전염성 대리인입니다. prion 단백질은 두 개의 isoforms, 비 전염성 호스트 인코딩 단백질 (PRP C) 및 전염성 단백질 (PRP SC), PRP C 8 비정상적으로 - 접힌 이소 형이 있습니다. prion 에이전트 작업의 과제 중 하나는 이전의 호스트 접종 13 다음 임상 증상의 발전에 긴 잠복기입니다. 이 전통적으로 길고 비싼 동물 bioassay 연구를 위임. 또한, PRP SC의 생화학 및 biophysical 속성이 제대로 자신의 특이한 형태와 집계 상태로 인해 특징을 가지고 있습니다. PRP SC는 체외 14 PRP SC에 PRP C의 씨앗 변환 할 수 있습니다. PMCA은 adva 소요의 체외 기술이다PRP C와 PRP SC의 씨앗 19 분 금액을 초과하는 금액을 포함하는 시스템에서, 가속 속도로, PRP SC 많은 양의 생산 sonication과 부화주기를 사용하여이 능력을 ntage. 이 기술은 효과적으로 prion 변형 간섭을 에뮬레이션하기 위해 PRP C에서 PRP SC 전환의 종과 변형 특성을 요점을 되풀이하고, 감염된 조직, 체액, 환경 샘플 6,7,16에서 PRP SC의 매우 낮은 수준을 증폭하기 위해 증명되었습니다 23. , 오염을 최소화 일관된 결과를 생성하고, 그 결과를 정량화에 대한 권장 사항을 포함 본 논문은 내용 PMCA 프로토콜을. 우리는 또한 전염성 prion의 변종, prion 변형 간섭 및 환경에서 prions의 감지의 생성 및 특성 등 여러 PMCA 응용 프로그램을 논의합니다.

단백질 misfolding의 순환 증폭 (PMCA)는 체외 7 PRP SC, 12, 14, 19, 24을 증폭하는 데 사용됩니다. 성공적으로 PRP SC 증폭은 그림 3과 같이 PK 방지 prion 단백질 (햄스터 파생 prion의 변종이 19 ~ 30 kDa를 마이그레이션)의 서양 blots에 밴드 강도의 증가에 의해 표시됩니다.의 밴드 강도의 증가는 이후 PMCA는 PK 방지 PRP SC 소재의 증폭을 나타냅니다. 햄스터 - 파생 prion 단백질, HaCWD와 DY TME의 성공 증폭는 PMCA 전에 (레인 5, 7) 및 (레인 4 6) 후 밴드 강도를 비교하여 그림 3의 WB 분석에 표시됩니다. PRP SC의 PK는 소화 각각 디 -, 모노, 그리고 unglycosy...

단백질 misfolding의 순환 증폭 (PMCA)는 prion 변환과 변형 및 종 장벽의 연구에서 시험 관내 분석이다. 또한 prion 검출 분석으로 사용할 수 있습니다.

Prions의 단백질 Misfolding의 순환 증폭

프리온(Prions)은 동물과 인간에게 치명적인 전염성 해면상 뇌증(TSE)을 유발하는 감염성 인자입니다9,18. 프리온 단백질은...

본 절차의 목적은 햄스터 적응형 PreOn 균주를 in vitro에서 성공적으로 증폭시키는 것입니다. 이는 우선 기질로 사용할 감염되지 않은 햄스터 뇌를 균질화하고, 시드로 사용할 감염 조직을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 PCR 튜브에 기질과 시드를 혼합한 후, 초음파 처리와 배양 사이클을 통해 단백질 미스폴딩 주기적 증폭 또는 PMCA를 수행하는 것입니다.다음으로, 증폭된 물질을 신선한 기질로 희석하여 인비트로(in vitro)에서 연속적으로 증폭시킨 후, PMCA를 수행합니다. 마지막으로, 시료를 proteinase K로 소화시킨 다음 웨스턴 블롯으로 분석합니다. 최종적으로, 웨스턴 블롯에서 밴드 강도의 증가는 프리온 변종의 인비트로 증폭 여부를 판단하는 데 사용될 수 있습니다.이 방법은 PreOn 증폭에 관여하는 중요한 보조 인자는 무엇인가와 같이 PreOn 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 기술과 관련된 작지만 중요한 세부 사항을 다루는 데 어려움을 겪을 수 있으며, 샘플 간 교차 오염을 방지하는 것 또한 중요합니다. 균질화 전에는 피펫을 1% bleach로 닦아내고, 초음파 처리 PCR 튜브 랙, 조직 균질기 및 PCR 튜브 보관 랙 또한 bleach로 충분히 소독하십시오.10분 후, 각 장비를 증류수로 충분히 헹구고 작업 영역을 새 Verly dry lab Soaker로 덮습니다. 이제 10 buric 조직 분쇄기와 새로 준비한 ice cold conversion buffer를 사용하여 감염되지 않은 햄스터 뇌를 10% weight per volume 용액으로 균질화합니다. PMCA substrate solution을 사용한 다음, 균질액을 15 milliliter 원추형 튜브에 넣고 500 times G에서 30초 동안 원심분리하여 균질화된 용액을 투명하게 만듭니다.다음으로, 큰 펠릿 분획이 섞이지 않도록 주의하면서 결과물을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. PMCA 시드 용액을 준비하려면, 방금 시연한 것과 동일하게 수확한 감염성 물질을 10% weight per volume 용액으로 균질화하되, 변환 버퍼 대신 daros 인산염 완충 식염수 또는 DPBS를 사용하고, 그 후 용액을 0.6 milliliters 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 증폭 절차를 시작하기 전에 작업 영역을

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

SDD - 나이가 세포에서 고분자와 같은 아밀로이드의 감지 및 특성화를위한 유용한 기법입니다. 여기 우리는 대규모 응용 프로그램에이 기술을 의무하게 적응을 보여줍니다.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을...

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

단백질 분해 효소로 배양하여 정상적인 프리온을 소화하고 저항성 응집체는 그대로 둡니다.

웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 이용한 마우스 뇌 조직에서 잘못 접힌 프리온 단백질 응집체 검출

이 비디오는 세제 분획법과 함께 시클로헥시미드 처리를 사용하여 잘못 접힌 단백질에 대한 분해 분석을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 단백질의 역학을 연구하고 단백질 회전율의 심층적인 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다.

Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

단백질 응집체의 프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

여기, 우리는 간단, 신속 하 고 효율적인 프리온 증폭 기술, 실시간 떨게 유발 변환 (RT-QuIC) 메서드를 설명 하는 프로토콜을 제시.

실시간 떨게 유발 CWD Prions 지저분한 자료의 검색을 위한 변환 분석 결과

병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.

초파리 Melanogaster 에서 프리온과 같은 단백질의 셀 전송 모니터링

여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

배우세요 단백질 미스폴딩 순환 증폭(PMCA) 기법을 사용하여 햄스터 적응 프리온 균주를 시험관 내에서 증폭하는 방법을. 이 기법은 프리온 전환 메커니즘과 종 간 장벽 연구에 활용됩니다.

Prions의 단백질 Misfolding의 순환 증폭

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