November 1st, 2007
비켜 electroporation의 여자는 조류 배아의 유전자 조작을 허용하는 기법입니다. 이 기법의 일반적인 응용 프로그램은 유전자와 putative 향상제 요소의 기능 분석을 포함합니다. 이 동영상은 HH 10 여자는 배아에서 신경 튜브 electroporation을 보여줍니다. 사출 기술과 적절한 계란 처리는 설명합니다.
병아리는 배아가 조작에 매우 순응하고 크기가 커서 다른 배아보다 훨씬 쉽게 작업할 수 있기 때문에 좋은 모델 시스템입니다. 병아리 전기천공법(chick electroporation) 실험은 또한 단기간에 많은 수의 유전자를 스크리닝할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 마리사 블랭크입니다.
저는 시카고 대학의 인간 유전학과 Kathy Millon의 연구실에서 일하는 대학원생입니다. 오늘 저는 병아리와 난자 전기천공법을 수행하는 방법에 대해 이야기할 예정인데요, 저희는 일렉트로 햄버거와 해밀턴의 10기 닭 배아를 대상으로 할 것입니다. 이 절차는 우리 실험실에서 일상적으로 수행되며, 우리가 중추 신경계의 발달에 관여하는 유전자에 관심이 있기 때문에 일반적으로 우리가 연구하는 것은 척수에 있는 유전자의 과발현 또는 쓰러짐의 영향입니다.
그래서 제가 오늘 난자 전기천공법에서 보여드릴 기술은 몇 가지 단계를 포함합니다. 첫 번째 단계는 달걀의 창을 만드는 것입니다. 두 번째 단계는 실제로 신경관의 내강에 DNA를 주입하는 것입니다.
세 번째 단계는 전기장을 사용하여 DNA를 신경관의 한쪽으로 밀어 넣는 것입니다. 그런 다음 알을 닫는 방법을 보여 드리고 부화기에 다시 넣을 것입니다. 자, 시작하기 전에 적절한 계란 취급에 대해 조금 말씀드리고자 합니다.
그래서 알은 닭 사육사에게서 구입하여 수정될 것입니다. 이 난자에는 배아가 포함되어 있기 때문에 배아를 다루는 방법에 주의해야 합니다. 따라서 부화하기 전에 알을 13도로 유지해야 합니다.
이를 위해 우리는 작은 와인 쿨러를 사용하고 알을 부화할 준비가 되면 실제로 부화기에 넣기 전에 실온에 도달하도록 해야 합니다. 그런 다음 인큐베이터에 넣으면 인큐베이터는 약 섭씨 57도인 화씨 100도로 유지되어야 합니다. 인큐베이터를 가습하는 것도 중요합니다 습도는 적절한 배아 발달을 위해 정말 중요합니다.
전기천공을 위해 이 난자를 준비하기 위해 가장 먼저 하는 일은 창문을 만드는 것입니다. 그리고 이 과정의 첫 번째 단계는 난자에서 알부민을 약간 제거하는 것입니다. 그래서 저는 난자 끝에 작은 테이프를 붙이고 큰 구멍이 뚫린 바늘로 끝에 구멍을 뚫은 다음 매우 조심스럽게 배아나 난황을 방해하지 않도록 바늘이 난자 바닥을 향하도록 할 것입니다.
그리고 주사기를 사용하여 약 5ml의 알부민을 제거할 것입니다. 그런 다음 다른 스카치 테이프를 사용하여 계란을 다시 밀봉합니다. 그리고 전기천공법의 경우 스카치 테이프는 무독성이기 때문에 사용하기 좋은 테이프입니다.
다음 단계는 창문이 만들어지는 달걀 위에 다른 테이프를 붙이는 것입니다. 배아가 난황 위로 떠오르기 때문에 알을 품는 동안 난자를 옆으로 눕히는 것이 중요합니다. 그래서 옆으로 눕혀져 보관되어 온 이 난자 안에서, 배아는 실제로 바로 이 근처에 있습니다.
나는 난자를 인큐베이터에 넣기 전에 난자의 윗부분을 표시하여 난자를 자르기 전에 배아가 어디에 있을 것인지 알 수 있도록 했습니다. 이제 구부러진 가위를 사용하여 작은 구멍을 만든 다음 창을 자릅니다. 작업할 수 있도록 가능한 한 작은 창을 자르고 싶고 필요한 경우 나중에 언제든지 더 크게 만들 수 있습니다.
이제 난자의 창을 만들었으므로 실제 주입 및 전기천공법을 진행할 준비가 되었습니다. 이를 위해 현미경으로 이동하겠습니다. 그래서 배아를 시각화하기 위해 배아 아래에 인도 잉크를 주입할 것입니다.
이것은 사실 우리 실험실에서 정기적으로 하지 않는 일입니다. 이러한 실험을 마치고 나면 실제로 콘트라스트 없이 배아를 볼 수 있을 것이지만 보기가 조금 어렵습니다. 따라서 잉크가 배아 아래로 퍼져나가면 신경관을 아주 명확하게 볼 수 있게 됩니다.
그러니까 신경관은 배아의 중간에 있는 밝은 색의 영역이고, 배아가 방향을 잡는 방식은, 현재 머리가 저에게서 위쪽을 향하고 있습니다. 이 단계는 해머 헤드 스테이지라고도 합니다. 당신은 아마도 배아가 망치 머리를 가지고 있는 것처럼 보이기 때문에 알 수 있을 것입니다.
그래서 주사를 맞을 때는 보통 배아를 돌려서 머리가 나를 향하도록 합니다. 그리고 제가 배아를 주입할 때, 제가 목표로 삼는 것은 머리가 팽창하는 바로 아래 영역입니다. 그래서 저는 집중하고, 바로 이 부근에서 바늘을 가리키고 이 단계에서 주사를 놓을 것입니다.
여기에서 신경관의 측면을 따라 형성되는 소체도 볼 수 있습니다. 자, 다시 말하지만, 머리는 척수가 될 신경관입니다. 이제 배아가 준비되었습니다.
우리는 실제로 주사를 맞을 것입니다. 따라서 주사를 맞기 위해 필요한 도구는 첫 번째 유리 모세혈관입니다. 우리는 이러한 유리 모세관을 가지고 있으며 모세관 당김으로 유리 바늘로 당깁니다.
그런 다음 이 유리 바늘을 가져갑니다. 그리고 주입을 위한 적절한 조리개를 얻으려면 바늘 끝을 부러뜨려야 합니다. 이것은 실제로 현미경으로 또는 눈으로 수행할 수 있습니다.
그래서 저는 보통 표준 5번 집게를 사용하고 모세혈관에서 끝을 끊습니다. 팁을 너무 뒤로 또는 너무 높게 부러뜨리면 조리개의 크기가 적절하지 않을 수 있습니다. 조리개를 너무 크게 만들면 모세관에 액체를 끌어들이려고 할 때 저항이 없기 때문에 알 수 있습니다.
따라서 일반적으로 뚜껑 액체를 모세관으로 당길 때 받는 저항의 양으로 조리개가 올바른 크기인지 알 수 있습니다. 우리가 사용하는 또 다른 장비는 입 피펫입니다. 따라서 입 피펫은 세 부분으로 구성됩니다.
마우스피스, 튜브에 라텍스 또는 타이 조각, 유연한 것, 그리고 실제로 모세혈관을 고정하는 부분이 있습니다. 그래서 바늘을 가져다가 고무 개스킷에 삽입하여 고정하기만 하면 됩니다. 그래서 이 유리바늘은 매우 날카롭기 때문에 조심해야 하고, 자신을 찌르면 유리 조각이 깨져서 피부 밑에 남게 되어 아프
기 때문입니다.그래서 저는 빠른 녹색 염료로 혈장 DNA를 담을 수 있는 가장 좋은 튜브는 작은 PCR 튜브라는 것을 알게 되었습니다. 그래서 저는 지금 당장 모세혈관에 염료를 약간 빨아들일 것입니다. 그래. 그리고 이 작업을 수행할 때 바늘 바닥을 튜브 바닥에 만지지 않도록 주의하면 바늘이 부러지고 다시 시작해야 하므로 주의해야 합니다.
자, 이제 바늘이 로드되었습니다. 주입할 준비가 되었습니다. 그래서 나는 이제 배아를 내시경 아래로 향하게 하여 머리가 나를 향하도록 합니다.
그리고 저는 DNA뿐만 아니라 빠른 녹색 염료가 들어있는 유리 바늘을 얕은 각도로 가져갈 것입니다. 팁을 신경관의 신경관에 넣고 신경관의 내강에 넣습니다. 그리고 실제로 반대쪽을 통과하지 않도록 주의해야 하는데, 그러면 염료가 배아 아래에 주입되기 때문입니다.
그래서 나는 이제 배아를 현미경 아래 두었고 머리가 나를 향하도록 했다. 빠른 녹색 염료와 DNA로 채워진 바늘을 얕은 각도로 가져갈 것입니다. 신경관의 내강을 채울 수 있도록 신경관에 구멍을 뚫을 것입니다.
그리고 이 작업을 할 때 실제로 너무 멀리 가서 신경관의 다른 쪽을 밀어 넣지 않도록 주의해야 합니다. 이제 신경관이 이 빠른 녹색 염료로 약간 채워져 있는 것을 볼 수 있습니다. 이상적으로는 그런 일이 일어나지 않기를 원합니다.
신경관을 채우고 싶을 뿐이지만 머리에서 꼬리까지 신경관을 채울 수 있어야 합니다. 이제 우리는 실제로 DNA를 신경관에 주입했으므로 전기 천공을 할 준비가 되었습니다. 그리고 전기천공법은 여기 제 바로 옆에 있습니다.
따라서 여러 부분으로 구성됩니다. 첫 번째 부분은 백금 전극입니다. 전극은 전극 홀더에 고정되어 있으며, 적절한 위치를 유지하면서 전극을 올리거나 내리는 데 사용할 수 있는 마이크로 매니퓰레이터에 의해 고정됩니다.
전극은 케이블에 부착되고 케이블은 펄스 발생기에 부착됩니다. 그리고 펄스 발생기는 전극 사이에 짧은 전기 펄스를 생성하여 실제로 DNA를 신경관의 한쪽으로 밀어 넣는 데 사용됩니다. 배아에 펄스를 쥘 때 일반적으로 25볼트 펄스를 사용합니다.
우리는 50밀리초 동안 지속되는 5개의 펄스를 수행하며, 이는 5초 동안 지속됩니다. 따라서 5개의 짧은 전기 펄스일 뿐입니다. 이제 우리는 배아 바로 위에 있는 마이크로미터 매니퓰레이터에 전극을 배치했습니다.
저는 전극을 배아 위로 부드럽게 내려서 신경관과 평행하게 움직이도록 할 것입니다. 그런 다음 전기의 전도도를 돕기 위해 약간의 매체를 적용할 것입니다. 그런 다음 실제로 배아 Rio에 펄스를 보냅니다.
전극에 기포가 형성되는 것을 볼 수 있습니다. 그것은 전극 사람이 실제로 작동했고 당신이 만들어야 할 연결을 만들었다는 것을 나타내는 좋은 신호입니다. 이제 배아에서 전극을 부드럽고 부드럽게 당겨 올리면 배아를 밀봉할 준비가 되었습니다.
이제 달걀을 일렉트로 퍼레이드하는 방법을 보여 드렸습니다. 마지막 단계도 매우 중요한데, 그것은 난자가 계속 발달할 수 있도록 난자를 다시 밀봉하는 것입니다. 앞서 말씀드렸듯이 습도는 배아의 발달에 매우 중요합니다.
따라서 배아를 제대로 밀봉했는지 확인해야 합니다. 따라서 이렇게하려면 다른 테이프 조각을 가져 와서 구멍 위에 놓되 계란 내부의 습기를 잃지 않도록 가장자리 주위에 테이프 조각을 완전히 밀봉했는지 확인하도록주의해야합니다. 그런 다음 난자를 인큐베이터에 다시 넣고 분석하려는 단계까지 발달시키기만
하면 됩니다.결론적으로, 오늘은 햄버거와 해밀턴의 10기 닭 배아를 먹는 방법, 특히 이 배아의 신경관을 먹는 방법을 보여드렸습니다. 제가 방금 보여드린 프로토콜의 중요한 측면은 배아를 손상시키지 않고 먼저 배아를 창으로 만드는 것입니다. 둘째, 배아를 손상시키지 않고 신경관에 DNA를 다시 주입하는 것입니다.
셋째, 전극의 적절한 배치는 전기천공법 단계에서 DNA를 원하는 곳에 실제로 넣는 데 중요합니다. 마지막으로, 알을 인큐베이터에 다시 넣기 전에 알을 제대로 밀봉하는 것이 중요하다는 점을 상기시켜 드리고 싶습니다. DNA를 먹을 때, 우리는 GFP 리포터가 있는 플라스미드를 사용하며, 일반적으로 그 GF 리포터를 관심 유전자의 발현 지표로 사용합니다.
electroporation 후에, 당신은 보통 6 12 시간 안에 GFP 표정을 볼 것을 기대할 수 있습니다. 그러나 이것이 반드시 관심 단백질이 최적의 수준으로 발현되었음을 의미하지는 않습니다. 따라서 이러한 실험을 수행할 때 최적의 발현 수준을 얻기 위해 전기천공법 후 하루에서 이틀 사이에 배아를 분석할 수 있습니다.
여러분의 실험에 행운을 빌며, 시청해 주셔서 감사합니다.
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이 동영상은 조류 배아의 유전자 조작을 위한 기술인 난내 병아리 전기침투법을 보여줍니다. HH 10 병아리 배아의 신경관 전기침투법에 초점을 맞추고, 주사 기술 및 적절한 알의 취급에 대해 논의합니다.
In ovo electroporation of chicken embryos provides a rapid, cost-effective system for functional gene analysis in developmental biology, enabling high-throughput screening of genetic constructs relevant to neurodevelopmental target validation. The technique supports early-stage mechanistic de-risking by allowing overexpression or knockdown studies in a physiologically relevant vertebrate model, informing go/no-go decisions in target selection pipelines. Its scalability and reproducibility make it suitable for integration into discovery workflows focused on central nervous system biology and translational biomarker exploration.
In ovo electroporation fits within the early discovery continuum, supporting target validation through functional gene screening and informing lead identification by providing mechanistic insights in a disease-relevant system prior to mammalian preclinical work.