을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜 ¹⁵ N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

다음 실험의 전체적인 목표는 수용성 및 막 단백질을 포함하는 세포 추출물 내에서 특정 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 단백질을 식별하는 것입니다. 먼저, 질소 14와 질소 15를 사용하여 클라미도모나스(chlamydomonas) 세포의 완전한 대사 표지를 수행하고, TP가 포함된 세포 용해물과 포함되지 않은 세포 용해물을 생성합니다. 선택적인 가교 결합 단계는 일시적인 단백질-단백질 상호작용을 안정화하는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 세포 용해물을 분획하여 불용성 및 막 단백질을 농축하며, 여기에서 표적 단백질과 그 특이적 상호작용 파트너를 분리합니다.

대조군 단백질과 오염 단백질을 면역 침전시키고 용출합니다. 이제 면역 침전된 단백질을 혼합하여 3중 소화시킨 후 탠덤 LCMS로 분석합니다. 그 결과, 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 단백질의 경우 14N 및 15N 펩타이드 비율이 다르게 나타나고, 그렇지 않은 경우에는 동일하게 나타나므로 이를 통해 실제 상호작용 파트너와 가짜 상호작용 파트너를 구별했습니다.

표적 단백질, 대조 단백질 및 오염 단백질에 대한 14개 질소 15 펩타이드 비율입니다. 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위한 최적의 방법은 두 단백질이 천연 구조와 농도로 존재하는 세포 추출물로부터 선택한 단백질과 그 상호작용 파트너를 직접 면역침전시키는 것입니다.

하지만 이 과정에서 오염 단백질 또한 침전되는데, 이는 현대의 질량 분석기가 매우 민감하여 항체와 상호작용하는 오염 단백질까지 명확하게 식별해내기 때문입니다. 따라서 실제 상호작용 파트너와 오류로 인한 단백질을 구별하는 것이 불가능합니다. 이러한 문제는 본 영상에서 소개하는 기술을 통해 해결할 수 있으며, 이는 15 N 대사 표지 면역침전 친화성 조절(ATP 상태에 의해 매개됨) 및 정량적 질량 분석법을 기반으로 합니다.

해당 기술은 본 실험실의 박사 과정 수석 연구원인 Stefan SCH Malinger가 시연하겠습니다. 10세대 동안 세포 라벨링을 마친 후, 질소 14 및 질소 15로 라벨링된 클라미도모나스(chlamydomonas) 세포를 각각 두 개의 aliquot씩 4G SA 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 수확하고, 펠렛을 2 mL의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼(lysis buffer)에 재현탁한 뒤, 현탁액을 15 mL Falcon 튜브로 옮깁니다. 각 aliquot에서 남은 세포를 1 mL의 용해 버퍼로 추가 수집합니다. 여기에 50 µL의 25x 프로테아제 억제제(protease inhibitor)와 12.5 µL의 1 M 염화마그네슘(magnesium chloride)을 첨가합니다. 완전한 세포 용해를 위해 얼음 위에서 20초씩 4회 초음파 처리(sonication)하며, 냉각을 위해 처리 사이에 20초의 휴지 시간을 둡니다.

SW 41 TI 박벽 튜브에 6 mL 수크로스 쿠션을 4개 준비합니다. 세포 용해물 전체 부피를 수크로스 쿠션 위에 조심스럽게 층이 지게 올립니다. 용해 버퍼로 무게를 맞춘 후 원심분리하여 막 성분으로부터 가용성 단백질 복합체를 분리합니다.

구배 상단에 있는 수용성 단백질 복합체를 4개의 15 milliliter 팔콘 튜브에 옮깁니다. 이때 sucrose cushion 부분이 포함되지 않도록 주의하십시오. 그 다음 각 시료에 최종 농도가 0.5%가 되도록 10% Triton X 100을 첨가합니다. 조심스럽게 혼합한 후, lysed buffer를 넣어 총 부피를 7 milliliter로 맞춥니다.

SDS page 및 면역 혈액 분석을 위해, 각 가용성 세포 추출물 70 µL를 새로운 1.5 mL 원심 튜브에 옮기고 2X SDS 샘플 버퍼 70 µL를 추가합니다. 다음으로, SW 41 TI 박벽 튜브에서 sucrose cushion을 제거하고 각 펠렛에 용해 버퍼 3 mL를 추가합니다.

최종 농도가 2%가 되도록 10% Triton X 100 1 mL를 첨가합니다. 초음파 처리를 통해 각 펠렛을 용해시킨 후, 용해 버퍼를 추가하여 전체 부피를 5 mL로 맞추고 원심분리합니다. 이전과 동일하게, 막 단백질 복합체의 상층액 분획을 15 mL 팰콘 튜브에 수집합니다. 2% Triton X 100이 포함된 용해 버퍼를 추가하여 최종 부피를 7 mL로 맞춥니다.

SDS page 및 면역 혈액 분석을 위해 이 샘플 70 µL를 사용하십시오. 먼저 항체가 결합된 단백질을 평형화합니다. 용해 버퍼로 4 mL씩 두 번 세척한 후 8 mL로 희석하여 분주하십시오.

TP가 충분한 세포와 TP가 결핍된 세포(질소 14 및 질소 15 표지)에서 유래한 수용성 또는 막 단백질 복합체가 포함된 8개의 15 mL 팰콘 튜브 각각에 현탁액 1 mL를 넣습니다. 단백질 복합체를 침전시키기 위해 튜브 롤러를 사용하여 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 비드를 펠릿화하고, 상층액을 제거하되 플라스틱 벽면에 부착된 단백질에 의한 오염을 방지하기 위해 비드 위에 소량의 액체를 남겨둡니다. 팰콘 튜브에 남아 있는 모든 비드를 수집하기 위해 샘플을 새로운 1.5 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 0.1% Triton이 포함된 용해 버퍼 0.8 mL를 각 튜브에 추가하고, 볼텍싱 후 가볍게 원심분리하여 잔류 비드가 포함된 버퍼를 에이너(einor) 튜브로 옮깁니다. 여러 단계의 세척 과정 후, 4 °C에서 16,100 ×g로 15초 동안 샘플을 원심분리합니다.

먼저 일반 피펫으로 샘플 상층액을 제거합니다. 그 다음 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 남은 상층액을 완전히 제거합니다. 각 샘플에 갓 준비한 용출 버퍼 100 µL를 첨가하고, Thermo mixer에서 800 RPM으로 인큐베이션한 후, 16,100 ×g 및 25 °C에서 15초 동안 샘플을 원심분리합니다.

이제 깨끗한 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 각 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이전 샘플들과 동일한 방식으로 비드 공정에 50 µL의 용출 버퍼를 추가하고, 각각의 용출액을 모읍니다. 모든 샘플 EIT의 30 µL는 SDS page 및 면역 혈액 분석을 위해 남겨두어야 함을 기억하십시오.

이제 +A TP 및 -A TP 처리된 nitrogen 14 및 nitrogen 15 표지 수용성 및 막 단백질에서 용출된 침전물을 결합합니다. 그 다음, 동반된 원고에 기술된 대로 환원 알킬화 및 초기 고농도 urea 소화를 수행합니다. 회전 휠에서 최소 16시간 동안 triptych 소화를 진행합니다.

37 °C에서 반응시킵니다. 4 °C, 16,100 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 트립신 비즈를 펠렛화합니다. 상층액을 새로운 2 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.

기존 튜브를 50 µL의 20 mM 중탄산암모늄과 0.5% acetic acid로 세척하고, 이를 첫 번째 상층액과 합칩니다. 샘플의 탈염을 위한 자체 제작 C 18 팁을 준비하려면, 주사 바늘로 emcor C 18 재료에서 디스크 두 개를 잘라내어 200 µL 피펫 팁에 삽입합니다. 그다지 2 mL einor 튜브 4개의 뚜껑에 구멍을 뚫고 팁을 삽입합니다. C 18 스테이지 팁을 50 µL의 용액 B로 전처리하고 800 G, 25 °C에서 3분 동안 원심분리합니다.

다음으로, C 18 스테이지 팁에 100 µL의 용액을 넣고 25 °C에서 800 G로 3분 동안 원심분리하여 평형화합니다. 이 평형화 단계를 한 번 더 반복합니다. 이어서 triptych 소화를 통해 얻은 샘플 상청액 100 µL를 C 18 스테이지 팁에 로딩하고 25 °C에서 800 G로 3분 동안 원심분리합니다.

샘플 상층액을 완전히 적용하기 위해 컬럼 로딩을 반복합니다. C 18 스테이지 팁을 세척한 후, 50 µL의 용액 B를 사용하여 트립신 처리된 펩타이드를 새로운 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 용출시키고, 25 °C에서 800 G로 3분 동안 원심분리합니다. 용출 단계를 한 번 더 반복한 다음, SpeedVac 진공 농축기로 펩타이드를 완전히 건조시킵니다.

건조된 펩타이드를 20 µL의 용액 A에 현탁하고 얼음 위에서 최소 1시간 동안 배양하며, 그 과정 중 4 °C, 16, 100 times G에서 20분 동안 소니케이트 배스 원심분리기(sonicate bath centrifuge)로 15분씩 두 차례 배양을 수행하고, nano C-M-S-M-S HSP 70에 Senna를 적용합니다. 열충격단백질은 ATP가 없는 상태에서만 특정 공동 샤페론 및 기질과 상호작용하는 것으로 알려져 있습니다. 이 질소 14 표지 세포 추출물에서 hs P 70 B와 CGE 1은 ATP 상태와 관계없이 거의 대부분 가용성 분획에 국한되어 존재합니다. 반면, CF 1 beta는 가용성 분획과 막 농축 분획 모두에 존재합니다.

초음파 처리 시 ATP synthase에 위치한 막에서 CF1 beta의 일부가 전단되므로, 이는 두 분획 모두에 대한 로딩 컨트롤로 사용됩니다. ATP 상태와 관계없이 nitrogen 14 및 nitrogen 15로 표지된 가용성 추출물에서 anti-HSP 70 B 항체에 의해 유사한 양의 H HSP 70 B가 침전되었습니다. 이와 대조적으로, HSP 70 B 단백질은 막 분획에서 낮은 수준으로 침전되었으며, CGE E one의 hs에 대한 예상 친화도와 같이 ATP 결핍 막 분획이 ATP 충족 분획에 비해 약간 더 많은 양이 침전되었습니다.

HSP70B는 맥락 의존적입니다. TP가 풍부한 가용성 또는 막 분획에서는 CGE1이 HSP70B와 함께 공침되지 않았습니다. TP가 결핍된 가용성 분획 및 TP가 결핍된 막 분획에서 HSP70B와 함께 공침된 CGE1 단백질의 양은 침전된 HSP70B의 양과 정량적으로 상관관계가 있습니다. 질량 분석법을 통한 분석에서도 ADP 상태에서만 CGE1과 HSP70B의 상호작용이 관찰되었습니다.

본 실험에서는 TP가 결여된 $^{14}\text{N}$ 표지 추출물과 A TP를 포함하는 $^{15}\text{N}$ 표지 추출물의 혼합물에 대해 침전물을 준비하였습니다. HS P 70 B 펩타이드의 중쇄 및 경쇄 표지 형태는 동일한 강도로 검출된 반면, A TP가 고갈된 추출물에서 유래한 CGE one 펩타이드는 경쇄 표지 형태만 검출되었습니다. 상호 표지된 가용성 세포 추출물 혼합물에서 유래한 anti HS P 70 D DB 침전물의 동일한 펩타이드들이 여기에 제시되어 있습니다. 이에 따라, TP가 고갈된 추출물에서는 CGE one 펩타이드의 중쇄 표지 형태만 검출되었으며, HSP 70 B 펩타이드는 경쇄와 중쇄 표지 형태가 모두 검출되었습니다.

이 영상을 시청한 후, 질량 분석 분석을 위한 시료 준비를 포함한 공동 침전 실험 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 단백질, 특히 케라틴에 의한 오염은 질량 분석기의 분석 결과에 영향을 줄 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 장갑 착용, 청결한 환경 유지, LCMS 등급 시약 사용과 같은 안전 예방 조치가 매우 중요하다는 점을 잊지 마십시오.