Name: 을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜 15 N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: 배우세요 15N 대사 라벨링과 면역침전, 질량 분석을 이용한 단백질-단백질 상호작용 확인 방법을 Chlamydomonas 세포에서 적용하여 진짜 상호작용과 오염물질을 구분하는 기술입니다.

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우리는 CF1β에 대한 항혈청을위한 올리비에 Vallon 감사드립니다. 이 작업은 최대 플랑크 사회와 독일 Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1)와 Bundesministerium 털 Bildung 숙녀 Forschung (시스템 생물 이니셔티브 FORSYS, 프로젝트 GoFORSYS)에서 보조금에 의해 지원되었다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

과도 단백질 단백질 상호 작용 (QUICK-X)를 캡처하기위한 crosslinking 단계, 그리고 불평등 침전 효율 6 정상화 할 수있는 제어 강수량 : 우리는 최근 QUICK 방법 두 가지 개선을 도입했습니다. 다음은 QUICK의 두 개선이 포함 된 프로토콜 제시 : 먼저, 우리는 15 N 신진 대사 라벨링에 대한 SILAC 5 바꿉니다. 장점은 15 N은 단순 무기 소금으로 제공되는 경우 15 N 신진 대사 라벨이 SILAC보다 훨씬 저렴하다고합니다. 또한, 15 N 신진 대사와 QUICK 라벨 대부분의 식물, 곰팡이 및 박테리아처럼, 모든 아미노산에 대한 생물의 prototrophic에 적용 할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, SILAC 5,6에 내재 아르기닌 - 투 - 프롤린 interconversion 15 N이라는 펩티드의 정량화에 대한 문제를 제시하지 않습니다. 15 N의 단백질 체학 데이터의 양적 평가에 적합한 도구 예를 들면 MSQUANT 12 I 아르OMIQS 13. 둘째, 우리는 특별히 다른 비해 한 샘플에서 주어진 목표 단백질과 상호 작용하는 단백질의 양을 감소시키기위한 수단으로 친화력 변조를 소개합니다. 이 방법의 장점은 일부 모델 시스템을 생성하기가 어렵습니다 또는 모든 필수 대상 단백질의 경우에서 생성 할 수없는 최저의 돌연변이의 건설을 circumvents한다는 점입니다. 또한, 잠재적 대상 단백질을 쓰러 뜨린에 세포의 응답으로 발생하는 차동 단백질 발현에 의한 misinterpretations을 방지 : 다른 단백질뿐만 아니라 다운 규제하고 immunoprecipitation에 사용 된 항혈청과 교차 반응하는 경우, 그들은 해석 될 대상 단백질의 진정한 상호 작용 파트너 있습니다. 마지막으로, 화성 변조는 적절한 항체 - 투 - 항원 비율을 찾는 필요성을 시킨다는. 우리는 모델 생물로 Chlamydomonas reinhardtii의 우리의 프로토콜을 적용되지만, 그것은 쉽게 세포 배양에서 재배 및 질소 소스로 암모니아 또는 질산을 사용 할 수 있습니다 할 수있는 다른 생물체에 적용 할 수 있습니다. ATP / ADP에 의한 단백질 단지의 연관성 변조는 직접 GroEL/HSP60/Cpn60 또는 HSP90 자야 시스템 14,15 같은 그의 상호 작용 기판과 일대 단백질과 ATP 상태에 따라 다른 보호자에 적용, 또는 다른 시스템에 위치 할 수 있습니다 바인딩 동질성은 ATP에 의해 조절됩니다. 화성 변조는 또한 단백질 상호 작용 사이의 동질성이 HSP90 시스템 (15)의 경우 radicicol 또는 geldanamycin 같은 특정 약물에 의해 변경 된 경우에 작동합니다. 우리 프로토콜의 명확한 제한이 필요하다는 것입니다 친화 - 정화 특정 치료 / 파트너 단백질위한 친화력을 변조 약물에 민감한 것으로 알려진 대상 단백질에 대한 항체를. 따라서 더 높은 처리량 방법이다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> ProteinA 세 파로스 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (디메틸 pimelimidate) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D8388 </td><td> -20 ° C에서 말라 저장, 사용하기 전에 직접 분해 </td></tr><tr><td> (전체, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료) 프로테아제 억제제 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> 칼 로스 </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> 크레아틴 인산 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 27,920 </td><td></td></tr><tr><td> 크리 phosphokinase </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [succinimidyl 프로 피오 네이트] </td><td> Sientific 열 </td><td> 22,585 </td><td> 4에 말라 저장 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 망할 CIA </td><td> 캠브리지 동위 원소 실험실, 앤도버, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> LYS-C (Endoproteinase LYS-C) </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 비즈 (Poroszyme는 트립신을 고정) </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> 직접 사용하기 전에 힘차게 믹스 </td></tr><tr><td> Empore C 18 47mm 디스크 </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; n 신진 대사 라벨링, immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

단백질 - 단백질 상호 작용은 세포의 많은 생물학적 과정에 대한 기본입니다. 따라서, 그들의 특성은 조사 1 확인할 수 있습니다 방법을 현재의 연구 및 과다에 중요한 역할을합니다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 종종 매우 역동적이며, subcellular 지방화, 포스트 병진 수정과 지역 단백질 환경이에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 그들은 공동 immunoprecipitation 접근 방식이 선택 (3)의 방법입니다있는 그들의 자연 환경에서 조사해야합니다. 공동 시켰던 상호 작용 파트너는 타겟이 불분명 한 방식으로 타겟팅 된 접근, 또는 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 의해 immunoblotting 중 하나로 식별됩니다. 후자의 전략은 종종 부정적인 주로 자신 unspecifically precipitating 단백질의 흔적을 감지 현대적인 질량 분석기의 높은 감도에서 파생 된 잘못된 긍정적 인 발견의 많은에 의해 영향을받습니다. recen이 문제를 극복 할 수 t의 접근 방식은 아이디어에 기초 unspecifically precipitating 단백질의 양이 영향을받지 않습니다 동안 특정 상호 작용 파트너의 감소 금액은, 세포 농도 RNAi에 의해 감소​​ 주어진 대상 단백질과 공동 침전물 할 것입니다. 이 방법은, 최저 4 결합 양적 Immunoprecipitation에 대한 QUICK 칭했다 야생 유형과 노크 다운 긴장에서 immunoprecipitated 단백질의 양을 정량화하는 안정적인 동위 원소 전지 문화에 아미노산의 라벨링 (SILAC) 5 MS을 사용합니다. 1:1 비율에서 발견 된 단백질은 오염 물질, 대상 단백질의 특정 상호 작용 파트너로 야생 유형에서 침전물에 풍부한 사람들로 간주 될 수 있습니다. 혁신, QUICK 일부 제한이지지하지만 : 먼저, SILAC 비용이 많이 이상적 아르기닌 및 / 또는 리신에 대한 auxotrophic 아르 생물로 제한됩니다. addit에 또한, 무거운 아르기닌이 공급 될 때, 아르기닌 - 투 - 프롤린 interconversion 결과ional 질량이 펩타이드 각 프롤린에 대한 연속 근무 약간 정량화 더 지루하고 5,6 정확도가 떨어질 수 있습니다 빛 아르기닌과 무거운 dilutes. 둘째, QUICK는 항체 그들이 노크 다운 뮤턴트에서 추출의 대상 단백질과 포화가되지 않는 등 titrated되어 있어야합니다. 여기 15 N 신진 대사 라벨에 SILAC을 대체하여, 단백질 - 단백질 상호 작용의 연관성 변조에 대한 RNAi로 인한 똑 다운 대체하여 QUICK의 abovementioned 한계를 극복 수정 QUICK 프로토콜을 소개합니다. 우리는 단세포 녹색 alga의 Chlamydomonas이 모델 생물 및 대상 단백질 7 (그림 1)과 엽록체의 HSP70B의 보호자로 reinhardtii 사용하여이 프로토콜의 적용을 보여줍니다. HSP70s는 특정 공동 보호자 만 ADP 상태 8 기판과 상호 작용하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 특정을 확인하는 수단으로이 속성을 이용의 염기 교환 요소 CGE1 9 HSP70B의 상호 작용.

우리는 TRUE와 FALSE 단백질 단백질 상호 작용을 구별하기 이전에 도입 된 QUICK (최저과 결합하여 정량 Immunoprecipitation) 접근 방식의 변화를 제시한다. 우리 접근 방식은 기반으로합니다<sup&gt; 15N</sup&gt; 신진 대사 라벨, ATP, immunoprecipitation, 그리고 양적 질량 분광법의 존재 / 부재에 의한 단백질 단백질 상호 작용의 동질성의 변조.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

단백질-단백질 상호작용은 세포 내 많은 생물학적 과정의 기초가 됩니다. 따라서 이러한 상호작용의 특성 규명은 ...에서 중요한 역할을 합니다.

다음 실험의 전체적인 목표는 수용성 및 막 단백질을 포함하는 세포 추출물 내에서 특정 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 단백질을 식별하는 것입니다. 먼저, 질소 14와 질소 15를 사용하여 클라미도모나스(chlamydomonas) 세포의 완전한 대사 표지를 수행하고, TP가 포함된 세포 용해물과 포함되지 않은 세포 용해물을 생성합니다. 선택적인 가교 결합 단계는 일시적인 단백질-단백질 상호작용을 안정화하는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 세포 용해물을 분획하여 불용성 및 막 단백질을 농축하며, 여기에서 표적 단백질과 그 특이적 상호작용 파트너를 분리합니다.대조군 단백질과 오염 단백질을 면역 침전시키고 용출합니다. 이제 면역 침전된 단백질을 혼합하여 3중 소화시킨 후 탠덤 LCMS로 분석합니다. 그 결과, 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 단백질의 경우 14N 및 15N 펩타이드 비율이 다르게 나타나고, 그렇지 않은 경우에는 동일하게 나타나므로 이를 통해 실제 상호작용 파트너와 가짜 상호작용 파트너를 구별했습니다.표적 단백질, 대조 단백질 및 오염 단백질에 대한 14개 질소 15 펩타이드 비율입니다. 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위한 최적의 방법은 두 단백질이 천연 구조와 농도로 존재하는 세포 추출물로부터 선택한 단백질과 그 상호작용 파트너를 직접 면역침전시키는 것입니다.하지만 이 과정에서 오염 단백질 또한 침전되는데, 이는 현대의 질량 분석기가 매우 민감하여 항체와 상호작용하는 오염 단백질까지 명확하게 식별해내기 때문입니다. 따라서 실제 상호작용 파트너와 오류로 인한 단백질을 구별하는 것이 불가능합니다. 이러한 문제는 본 영상에서 소개하는 기술을 통해 해결할 수 있으며, 이는 15 N 대사 표지 면역침전 친화성 조절(ATP 상태에 의해 매개됨) 및 정량적 질량 분석법을 기반으로 합니다.해당 기술은 본 실험실의 박사 과정 수석 연구원인 Stefan SCH Malinger가 시연하겠습니다. 10세대 동안 세포 라벨링을 마친 후, 질소 14 및 질소 15로 라벨링된 클라미도모나스(chlamydomonas) 세포를 각각 두 개의 aliquot씩 4G SA 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 수확하고, 펠렛을 2 mL의 얼음처럼 차가운 용해 버퍼(lysis buffer)에 재현탁한 뒤, 현탁액을 15 mL Falcon 튜브로 옮깁니다. 각 aliquot에서 남은 세포를 1 mL의 용해 버퍼로 추가 수집합니다. 여기에 50 µL의 25x 프로테아제 억제제(protease inhibitor)와 12.5 µL의 1 M 염화마그네슘(magnesium chloride)을 첨가합니다. 완전한 세포 용해를 위해 얼음 위에서 20초씩 4회 초음파 처리(sonication)하며, 냉각을 위해 처리 사이에 20초의 휴지 시간을 둡니다.SW 41 TI 박벽 튜브에 6 mL 수크로스 쿠션을 4개 준비합니다. 세포 용해물 전체 부피를 수크로스 쿠션 위에 조심스럽게 층이 지게 올립니다. 용해 버퍼로 무게를 맞춘 후 원심분리하여 막 성분으로부터 가용성 단백질 복합체를 분리합니다.구배 상단에 있는 수용성 단백질 복합체를 4개의 15 milliliter 팔콘 튜브에 옮깁니다. 이때 sucrose cushion 부분이 포함되지 않도록 주의하십시오. 그 다음 각 시료에 최종 농도가 0.5%가 되도록 10% Triton X 100을 첨가합니다. 조심스럽게 혼합한 후, lysed buffer를 넣어 총 부피를 7 milliliter로 맞춥니다.SDS page 및 면역 혈액 분석을 위해, 각 가용성 세포 추출물 70 µL를 새로운 1.5 mL 원심 튜브에 옮기고 2X SDS 샘플 버퍼 70 µL를 추가합니다. 다음으로, SW 41 TI 박벽 튜브에서 sucrose cushion을 제거하고 각 펠렛에 용해 버퍼 3 mL를 추가합니다.최종 농도가 2%가 되도록 10% Triton X 100 1 mL를 첨가합니다. 초음파 처리를 통해 각 펠렛을 용해시킨 후, 용해 버퍼를 추가하여 전체 부피를 5 mL로 맞추고 원심분리합니다. 이전과 동일하게, 막 단백질 복합체의 상층액 분획을 15 mL 팰콘 튜브에 수집합니다. 2% Triton X 100이 포함된 용해 버퍼를 추가하여 최종 부피를 7 mL로 맞춥니다.SDS page 및 면역 혈액 분석을 위해 이 샘플 70 µL를 사용하십시오. 먼저 항체가 결합된 단백질을 평형화합니다. 용해 버퍼로 4 mL씩 두 번 세척한 후 8 mL로 희석하여 분주하십시오.TP가 충분한 세포와 TP가 결핍된 세포(질소 14 및 질소 15 표지)에서 유래한 수용성 또는 막 단백질 복합체가 포함된 8개의 15 mL 팰콘 튜브 각각에 현탁액 1 mL를 넣습니다. 단백질 복합체를 침전시키기 위해 튜브 롤러를 사용하여 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 비드를 펠릿화하고, 상층액을 제거하되 플라스틱 벽면에 부착된 단백질에 의한 오염을 방지하기 위해 비드 위에 소량의 액체를 남겨둡니다. 팰콘 튜브에 남아 있는 모든 비드를 수집하기 위해 샘플을 새로운 1.5 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 0.1% Triton이 포함된 용해 버퍼 0.8 mL를 각 튜브에 추가하고, 볼텍싱 후 가볍게 원심분리하여 잔류 비드가 포함된 버퍼를 에이너(einor) 튜브로 옮깁니다. 여러 단계의 세척 과정 후, 4 °C에서 16,100 ×g로 15초 동안 샘플을 원심분리합니다.먼저 일반 피펫으로 샘플 상층액을 제거합니다. 그 다음 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 남은 상층액을 완전히 제거합니다. 각 샘플에 갓 준비한 용출 버퍼 100 µL를 첨가하고, Thermo mixer에서 800 RPM으로 인큐베이션한 후, 16,100 ×g 및 25 °C에서 15초 동안 샘플을 원심분리합니다.이제 깨끗한 50 µL Hamilton 시린지를 사용하여 각 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이전 샘플들과 동일한 방식으로 비드 공정에 50 µL의 용출 버퍼를 추가하고, 각각의 용출액을 모읍니다. 모든 샘플 EIT의 30 µL는 SDS page 및 면역 혈액 분석을 위해 남겨두어야 함을 기억하십시오.이제 +A TP 및 -A TP 처리된 nitrogen 14 및 nitrogen 15 표지 수용성 및 막 단백질에서 용출된 침전물을 결합합니다. 그 다음, 동반된 원고에 기술된 대로 환원 알킬화 및 초기 고농도 urea 소화를 수행합니다. 회전 휠에서 최소 16시간 동안 triptych 소화를 진행합니다.37 °C에서 반응시킵니다. 4 °C, 16,100 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 트립신 비즈를 펠렛화합니다. 상층액을 새로운 2 mL 에펜도르프 튜브로 옮깁니다.기존 튜브를 50 µL의 20 mM 중탄산암모늄과 0.5% acetic acid로 세척하고, 이를 첫 번째 상층액과 합칩니다. 샘플의 탈염을 위한 자체 제작 C 18 팁을 준비하려면, 주사 바늘로 emcor C 18 재료에서 디스크 두 개를 잘라내어 200 µL 피펫 팁에 삽입합니다. 그다지 2 mL einor 튜브 4개의 뚜껑에 구멍을 뚫고 팁을 삽입합니다. C 18 스테이지 팁을 50 µL의 용액 B로 전처리하고 800 G, 25 °C에서 3분 동안 원심분리합니다.다음으로, C 18 스테이지 팁에 100 µL의 용액을 넣고 25 °C에서 800 G로 3분 동안 원심분리하여 평형화합니다. 이 평형화 단계를 한 번 더 반복합니다. 이어서 triptych 소화를 통해 얻은 샘플 상청액 100 µL를 C 18 스테이지 팁에 로딩하고 25 °C에서 800 G로 3분 동안 원심분리합니다.샘플 상층액을 완전히 적용하기 위해 컬럼 로딩을 반복합니다. C 18 스테이지 팁을 세척한 후, 50 µL의 용액 B를 사용하여 트립신 처리된 펩타이드를 새로운 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 용출시키고, 25 °C에서 800 G로 3분 동안 원심분리합니다. 용출 단계를 한 번 더 반복한 다음, SpeedVac 진공 농축기로 펩타이드를 완전히 건조시킵니다.건조된 펩타이드를 20 µL의 용액 A에 현탁하고 얼음 위에서 최소 1시간 동안 배양하며, 그 과정 중 4 °C, 16, 100 times G에서 20분 동안 소니케이트 배스 원심분리기(sonicate bath centrifuge)로 15분씩 두 차례 배양을 수행하고, nano C-M-S-M-S HSP 70에 Senna를 적용합니다. 열충격단백질은 ATP가 없는 상태에서만 특정 공동 샤페론 및 기질과 상호작용하는 것으로 알려져 있습니다. 이 질소 14 표지 세포 추출물에서 hs P 70 B와 CGE 1은 ATP 상태와 관계없이 거의 대부분 가용성 분획에 국한되어 존재합니다. 반면, CF 1 beta는 가용성 분획과 막 농축 분획 모두에 존재합니다.초음파 처리 시 ATP synthase에 위치한 막에서 CF1 beta의 일부가 전단되므로, 이는 두 분획 모두에 대한 로딩 컨트롤로 사용됩니다. ATP 상태와 관계없이 nitrogen 14 및 nitrogen 15로 표지된 가용성 추출물에서 anti-HSP 70 B 항체에 의해 유사한 양의 H HSP 70 B가 침전되었습니다. 이와 대조적으로, HSP 70 B 단백질은 막 분획에서 낮은 수준으로 침전되었으며, CGE E one의 hs에 대한 예상 친화도와 같이 ATP 결핍 막 분획이 ATP 충족 분획에 비해 약간 더 많은 양이 침전되었습니다.HSP70B는 맥락 의존적입니다. TP가 풍부한 가용성 또는 막 분획에서는 CGE1이 HSP70B와 함께 공침되지 않았습니다. TP가 결핍된 가용성 분획 및 TP가 결핍된 막 분획에서 HSP70B와 함께 공침된 CGE1 단백질의 양은 침전된 HSP70B의 양과 정량적으로 상관관계가 있습니다. 질량 분석법을 통한 분석에서도 ADP 상태에서만 CGE1과 HSP70B의 상호작용이 관찰되었습니다.본 실험에서는 TP가 결여된 $^{14}\text{N}$ 표지 추출물과 A TP를 포함하는 $^{15}\text{N}$ 표지 추출물의 혼합물에 대해 침전물을 준비하였습니다. HS P 70 B 펩타이드의 중쇄 및 경쇄 표지 형태는 동일한 강도로 검출된 반면, A TP가 고갈된 추출물에서 유래한 CGE one 펩타이드는 경쇄 표지 형태만 검출되었습니다. 상호 표지된 가용성 세포 추출물 혼합물에서 유래한 anti HS P 70 D DB 침전물의 동일한 펩타이드들이 여기에 제시되어 있습니다. 이에 따라, TP가 고갈된 추출물에서는 CGE one 펩타이드의 중쇄 표지 형태만 검출되었으며, HSP 70 B 펩타이드는 경쇄와 중쇄 표지 형태가 모두 검출되었습니다.이 영상을 시청한 후, 질량 분석 분석을 위한 시료 준비를 포함한 공동 침전 실험 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 단백질, 특히 케라틴에 의한 오염은 질량 분석기의 분석 결과에 영향을 줄 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 장갑 착용, 청결한 환경 유지, LCMS 등급 시약 사용과 같은 안전 예방 조치가 매우 중요하다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

배우세요 15N 대사 라벨링과 면역침전, 질량 분석을 이용한 단백질-단백질 상호작용 확인 방법을 Chlamydomonas 세포에서 적용하여 진짜 상호작용과 오염물질을 구분하는 기술입니다.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜

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