을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜 ¹⁵ N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

다음 실험의 전반적인 목표는 용해성 단백질과 막 단백질을 포함하는 세포 추출물에서 주어진 표적 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 단백질을 식별하는 것입니다. 먼저, 질소 14 및 질소 15로 클라미도모나스 세포의 완전한 대사 표지를 달성하고 TP를 포함하거나 결핍한 세포 용해물을 생성합니다. 선택적 가교 단계는 일시적인 단백질 단백질 상호 작용을 안정화하는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 세포 용해물을 분획, 농축 불용성 및 막 단백질로 분리하여 표적 단백질, 특정 상호 작용 파트너입니다.

대조 단백질과 오염 단백질은 면역 침전되고 암시됩니다. 이제 면역 침전된 단백질을 혼합하고 탠덤 LCMS로 삼중으로 분해 및 분석합니다. 그 결과 서로 다른 질소, 14개의 질소, 15개의 펩타이드 비율이 표적 단백질과 특이적으로 상호 작용하고 동일한 질소와 동일한 질소를 보여줌으로써 참 상호 작용 파트너와 거짓 상호 작용 파트너를 구별했습니다.

14 질소 표적 단백질, 대조 단백질 및 오염 단백질에 대한 15 펩타이드 비율. 단백질 단백질 상호 작용을 분석하기 위해 선택하는 방법은 선택한 단백질을 상호 작용과 함께 직접 면역 침전시키는 것입니다. 세포 추출물의 파트너, 둘 다 본래의 확인 및 농도에서 발생합니다.

그러나 그렇게 할 때 오염 단백질은 주로 현대 질량 분석기가 매우 민감하기 때문에 사용되는 항체와 상호 작용하기 때문에 침전됩니다. 그들은 또한 오염 단백질을 명백하게 식별할 것이며, 따라서 진정한 상호 작용 파트너와 결함을 구별하는 것은 불가능합니다. 이 문제는 여기에 표시된 기술에 의해 극복되며, 이는 A TP 상태 및 정량적 질량 분석법에 의해 매개되는 15N 대사 라벨링 면역침전 친화성 조절을 기반으로 합니다.

이 기술은 제 연구실의 선임 박사 과정 학생인 Stefan SCH Malinger가 보여줄 것입니다. 10세대에 걸쳐 세포를 라벨링한 후, 질소 14 및 질소 15 표지된 클라미도모나스 세포를 각각 2개의 분취량을 4G SA 튜브로 옮기고, 원심분리 Resus로 수확하고, 펠릿을 2밀리리터의 얼음 저온 용해 완충액에 현탁시키고, 현탁액을 15밀리리터 팔콘 튜브로 옮기기 위해 각 Eloqua에 각각 1밀리리터의 용해 완충액이 추가로 있는 나머지 세포를 수집합니다. 50 마이크로 리터의 25 x 프로테아제 억제제와 1 몰 염화 마그네슘 초음파 처리 샘플 12.5 마이크로 리터를 얼음에서 20 초 동안 4 회 첨가하여 완전한 세포 ISIS를 만들고 냉각을 위해 22 번째 휴식을 취합니다.

SW 41 TI 얇은 벽 튜브에 6밀리리터 자당 쿠션 4개를 준비합니다. 세포 용해물의 전체 부피를 자당 쿠션에 조심스럽게 놓습니다. 용해(lysis), 완충액(buffer) 및 원심분리(centrifuge)로 균형을 유지하여 멤브레인에서 용해성 단백질 복합체를 분리합니다.

구배의 상단에서 용해성 단백질 복합체를 4개의 15ml 팔콘 튜브로 이동합니다. 자당 쿠션의 일부를 옮기지 않도록 하십시오. 그런 다음 각 샘플에 10% Triton X 100을 최종 농도 0.5%에 첨가하고 조심스럽게 혼합하고 총 부피 7ml에 용해 완충액을 추가합니다.

SDS 페이지 및 면역 혈액 분석용. 각 용해성 세포 추출물 70마이크로리터를 새로운 1.5ml 원추형 튜브에 따로 보관하고 2개의 XSDS 샘플 버퍼 70마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, SW 41 TI 얇은 벽 튜브에서 자당 쿠션을 버리고 각 펠릿에 3ml의 용해 완충액을 추가합니다.

10 % tritton X 100의 1 밀리리터를 2 %의 최종 농도에 첨가 초음파 처리로 각 펠릿을 용해 한 후, 5 밀리리터의 총 부피에 용해 버퍼를 추가하고 원심 분리기를 사용한다. 이전과 마찬가지로 막 단백질 복합체의 상위 분획을 15ml 팔콘 튜브로 수확합니다. 2%tritton X 100을 함유한 용해 완충액을 7ml의 최종 부피에 추가합니다.

SDS 페이지 및 면역 혈액 분석을 위해 이 샘플 중 70마이크로리터를 사용하십시오. 먼저 항체 결합 단백질을 평형화합니다. 2개의 4밀리리터 세척액이 있는 혈청 비드는 8밀리리터로 희석되고 분취됩니다.

TP 및 TP 고갈된 질소 14 및 질소 15 표지된 세포로부터 용해성 또는 막 단백질 복합체를 포함하는 8개의 15 밀리리터 팔콘 튜브 각각에 1 밀리리터의 현탁액을 주입하고, 튜브 롤러에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양하여 단백질 복합체를 침전시키고, 원심분리에 의해 비드를 펠렛화하고, 상층액을 버리고 비드 위에 소량의 액체를 남겨 플라스틱 벽에 부착된 단백질로 인한 오염을 방지합니다. 샘플을 새로운 1.5ml 원뿔형 튜브로 옮겨 매 튜브에 남아 있는 모든 비드를 수집합니다. 각 와류에 0.1%트리톤을 함유한 또 다른 0.8밀리리터의 용해 완충액을 추가하고 부드럽게 원심분리한 다음 잔류 비드가 있는 완충액을 einor 튜브로 옮깁니다.몇 번의 세척 단계 후 16, 100배 G 및 섭씨 4도에서 15초 동안 원심분리 샘플을

먼저 일반 피펫으로 샘플 상층액을 제거합니다. 그런 다음 50마이크로리터 Hamilton 주사기로 남아 있는 상층액을 완전히 제거합니다. 각 샘플에 새로 준비된 용리 완충액 100마이크로리터를 추가하고 800RPM의 온도 혼합기에서 16, 100배 G 및 섭씨 25도에서 15초 동안 샘플을 원심분리하여 배양합니다.

이제 깨끗한 50마이크로리터 Hamilton 주사기를 사용하여 각 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 또한 이전 샘플과 마찬가지로 비드 공정에 50마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 해당 엘레이트를 풀링합니다. SDS 페이지 및 면역 혈액 분석을 위해 모든 샘플 EIT의 30마이크로리터를 예약하는 것을 잊지 마십시오.

이제 플러스 및 마이너스 A TP 처리 질소 14 및 질소 15 표지된 용해성 및 멤브레인 단백질에서 추출된 침전물을 결합합니다. 그런 다음 동봉된 원고에 설명된 대로 환원 알킬화 및 초기 고 요소 분해를 수행합니다. 최소 16시간 동안 회전 휠에서 삼부작 다이제스트를 진행합니다.

섭씨 37도에서. 트립신 비드를 16, 100배 G, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 상등액을 새로운 2 밀리리터 einor 튜브로 옮깁니다.

50 마이크로 리터의 20 밀리 몰 중탄산 암모늄, 0.5 % 아세트산으로 오래된 튜브를 세척하고 첫 번째 상등액으로 풀링합니다. 수제 C 18 시료 탈염을 준비하기 위해 주사기 바늘로 emcor C 18 재료에서 두 개의 디스크를 잘라내어 200 마이크로 리터 피펫 팁에 삽입하십시오. 그런 다음 4개의 2밀리리터 einor 튜브의 뚜껑에 구멍을 뚫고 팁을 삽입하고 C 18단계 팁을 50마이크로리터의 용액 B 원심분리기로 800G 및 25°C에서 3분 동안 사전 처리합니다.

다음으로, C 18 단계 팁을 100 마이크로 리터의 용액으로 평형을 이루고 800G 및 섭씨 25도에서 3 분 동안 원심 분리기를 사용합니다. 이 평형 단계를 한 번 더 반복합니다. 삼부작 분해액의 샘플 상등액 100마이크로리터를 C 18단계 팁 원심분리기에서 800G 및 섭씨 25도에서 3분 동안 로드합니다.

샘플 상층액의 완전한 적용을 위해 컬럼 로딩을 반복합니다. C 18 단계 팁을 세척한 후 트립틱 펩타이드를 50마이크로리터의 용액 B 원심분리기가 있는 새로운 1.5ml einor 튜브에 800G 및 25°C에서 3분 동안 용리합니다. elucian 단계를 한 번 반복하고 그 후에 속도 VAC reus에 있는 완료에 펩티드를 말리십시오.

건조된 펩타이드를 용액 A 20마이크로리터에 현탁시키고 얼음 위에서 최소 1시간 동안 배양하고, 초음파 수조 원심 분리기에서 16, 100배 G 및 섭씨 4도에서 20분 동안 15분 동안 두 번 배양하고 나노 C-M-S-M-S HSP 70에 세나를 적용합니다. 열 충격 단백질은 이러한 질소 14 표지 세포 추출물 hs P 70 B 및 CGE one에서 TP가 없는 경우에만 특정 cos chaperone 및 기질과 상호 작용하는 것으로 알려져 있으며, A, TP 상태와 무관하게 거의 독점적으로 용해성 분획에 국한됩니다. 대조적으로, CF one beta는 용해성 및 막이 풍부한 분획 모두에 국한되어 있습니다.

초음파 처리는 A TP Synthes에 위치한 멤브레인에서 CF one 베타의 일부를 전단하기 때문에 두 분획에 대한 로딩 제어 역할을 합니다. 유사한 양의 H HSP 70 B를 A TP 상태와 무관하게 질소 14 및 질소 15 표지된 용해성 추출물로부터 항 HSP 70 B 항체로 침전시켰다. 대조적으로, TP 고갈된 막 분획에서 약간 더 많은 양으로 막 분획에서 침전된 낮은 수준의 HS P 70 B 단백질은 hs에 대한 CGE E 1의 예상되는 친화력으로 TP 충진 분획에 비해 고갈되었습니다.

P 70 B는 상황에 따라 다릅니다. CGE는 TP가 풍부한 용해성 또는 막 분획을 B.In HS P 70과 함께 침전되지 않았습니다. TP 고갈, 용해성 분획 및 TP 고갈 막 분획물로부터 HS P 70 B로 침전된 CGE 단일 단백질 co의 양은 침전된 HSP 70 B의 양과 정량적으로 상관관계가 있으며, A DP 상태에서만 CGE 1과 HS P 70 B의 상호 작용은 질량 분석법에 의한 분석에서도 관찰됩니다.

이 실험에서, TP와 질소가 결핍된 질소 14 표지 추출물, A TP를 함유하는 15 표지 추출물의 혼합물에 대해 침전물을 준비했습니다. HS P 70 B 펩타이드의 무겁고 가볍게 표지된 형태는 동일한 강도로 검출되었지만, A TP 고갈 추출물에서 CGE 1 펩타이드의 가벼운 표지 형태만 검출되었습니다. 상호 표지된 용해성 세포 추출물의 혼합물로부터 유래된 anti-HS P 70 D DB 침전물로부터의 동일한 펩티드가 여기에 나타나 있다. 따라서, TP 고갈 추출물에서 CGE one 펩타이드의 중표지 형태뿐만 아니라 경질 및 중표지 HSP 70 B 펩타이드만 검출되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 질량 분석 분석을 위한 시료 준비로 석탄 침전 실험을 수행하는 방법에 대해 좋은 인상을 받았을 것입니다. 인간 단백질, 특히 케라틴에 의한 오염은 질량 분석기의 프로피 측정을 방해할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑, 깨끗한 환경 및 LCMS 등급 영역과 같은 안전 예방 조치가 중요하다는 것을 잊지 마십시오.