에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기 C. elegans

다음 실험의 목적은 연속 흐름 방법을 사용하여 저산소증 챔버를 설정하고 유지하는 것입니다. 이는 절차에 필요한 튜브, 플라스크 및 챔버를 확보하고 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 산소 탱크를 연결하고 유속을 선택하여 원하는 수준의 저산소증을 생성합니다.

탈이온수로 채워진 거품 플라스크에 가스를 통과시켜 가스를 수화합니다. 수화 가스를 저산소증 챔버에 연결하고 테스트 샘플을 챔버에 넣어 저산소 조건에 노출시킵니다. 성인이 될 때까지의 생존 능력 관찰을 기반으로 저산소증에서 Hi F1 의존성 배아 치사율을 보여주는 결과가 얻어졌습니다.

글로브 박스와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 실험실에서 제작하는 것이 쉽고 저렴하며 환경 챔버에서 정확하고 재현 가능한 가스 농도를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 선충 C 우아함의 저산소 반응에 대한 통찰력을 제공하지만 더 큰 모델 유기체 및 세포 배양을 포함한 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 또한 이산화탄소 및 황화수소를 포함한 다른 가스를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 저산소증 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다. 가스는 정의된 산소 농도의 압축 가스 탱크에 저장되며 2단계 조절기가 부착되어 있습니다. 가스는 유동 튜브의 바닥으로 들어가 올바른 유속으로 상단을 빠져 나옵니다.

그런 다음 가스가 버블 플라스크로 흘러 들어가 가스를 수화합니다. 그런 다음 수력 가스는 유입 밸브의 저산소증 챔버로 통과하여 샘플을 저산소증에 노출시킵니다. 가스는 마침내 챔버에 뚫린 배기 구멍을 통해 실내로 배출됩니다.

Pyrex 결정화 접시 또는 화살표 팩 상자는 환경 챔버의 본체로 사용할 수 있습니다. 용기의 부피는 최소로 유지되어야 하며 재료는 가스가 투과되지 않아야 합니다. 탄소 또는 다이아몬드 팁으로 용기의 한쪽 면에 구멍을 뚫고 플라스틱 호스 미늘 피팅으로 구멍을 뚫고 맞춥니다.

상자와 피팅에 적용하기 전에 에폭시를 혼합하십시오. 그런 다음 첫 번째 구멍에서 두 번째 구멍이 오프셋된 컨테이너의 반대쪽에서 동일한 절차를 반복합니다. 난류 혼합을 증가시키려면 하나의 8인치 외경, FEP 또는 나일론 튜브를 사용하여 압축 가스 탱크를 질량 유량 컨트롤러 또는 로터 미터와 같은 유량 제어 장치에 연결합니다.

가스 탱크는 산소 함량 또는 무산소 상태에 대한 인증된 표준인 질소와 균형을 이루는 산소 농도를 정의해야 합니다. 순수 질소는 2단계 조절기를 사용합니다.tage 두 번째 stage는 원하는 압력으로 설정됩니다. 적절한 유속을 선택하는 방법은 서면 프로토콜의 지침을 참조하십시오.

그런 다음 2단계 조절기의 튜브를 챔버로 들어가는 가스의 유량을 제어하는 유량 튜브에 연결합니다. 유동 튜브의 배출구는 증류수가 들어있는 프릿 실린더가있는 가스 세척 병에 연결됩니다. 그런 다음 세척 병의 반대쪽에 있는 튜브를 환경 챔버의 피팅 중 하나에 연결합니다.

이것은 환경 챔버로 들어가는 가스를 수화시킵니다. 진공 그리스를 사용하여 챔버를 밀봉하십시오. 그런 다음 챔버 뚜껑에 추를 올려 밀폐 밀봉을 보장합니다.

장갑을 낀 손바닥에 소량의 물을 챔버의 가스 배기 피팅에 대고 기포가 있는지 확인하여 씰을 테스트합니다. 먼저, sea Elgan의 동기화된 개체군을 생성합니다. 파종되지 않은 선충 성장 배지 플레이트의 표면에 알칼리성 표백제 한 방울에 성인 1-100 GR 1을 놓습니다.

표백제 용액이 최소 8시간의 잠복기 후에 플레이트에 흡수되도록 합니다. 동기화된 L 유충 하나를 살아있는 OP 50 박테리아가 파종된 플레이트로 옮깁니다. 또는 GRA 성체가 2-3시간 동안 접시에 알을 낳아 동시에 발달할 기생충 그룹을 생성하거나 혼합 개체군에서 L 4마리의 유충을 선택하여 어린 배아를 수집하도록 합니다.

2-4개의 세포 단계에서 면도날을 사용하여 소량의 물에 GR 성인을 자른 다음 저산소 상태에 노출시키기 위해 기생충을 플레이트로 옮기기 전에 구강 피펫으로 배아를 이식합니다. 플레이트 가장자리 주위에 에탄올에 10밀리리터당 10밀리그램의 팔미트산 고리를 놓습니다. 벌레가 한천 판의 표면을 탈출하는 것을 방지합니다.

팔미트산이 용액에서 나올 것입니다. 에탄올이 증발하여 균일성을 보장하기 위해 물리적 장벽을 형성하므로 환경 챔버에 노출되기 전에 가스 세척 병의 물을 교체해야 합니다. 웜을 플레이트로 옮긴 후 환경 챔버에서 플레이트를 밀봉하고 가스 흐름을 시작하며 원하는 분석 시간 동안 노출을 유지합니다.

배아가 성체가 될 때까지 생존 할 수 있으려면 기생충이 실내 공기로 돌아온 후 48 시간 후에 성장하도록 허용하십시오. 4단계 유충 또는 하루 성충은 성충이 될 때까지의 생존 가능성에 점수를 매깁니다. 벌레가 저산소 노출을 포즈를 취하는 것을 시각화하려면 22mm 정사각형 커버 슬립에 벌레를 M nine 한 방울로 옮기고 필요한 경우 M nine에서 2%aros 패드로 뒤집습니다.

25 밀리몰의 아몰 또는 10 밀리몰의 아지드 나트륨을 마취제로 사용할 수 있습니다. 또는 저산소증에 노출된 후 투명한 환경 챔버를 해부 스코프의 스테이지에 직접 배치할 수 있습니다. 두 개의 뷰가 표시되며, 그 중 하나는 전체 가스 흐름 설정을 포함합니다.

다른 하나는 현미경 스테이지에 챔버만 있는 것입니다. 대부분의 벌레가 GR 성충이 될 때까지 4개의 10cm 높이의 성장판에 Bristol N 두 마리의 벌레를 성장시킵니다. 1-5 알칼리 표백제 용액이 든 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 벌레를 씻고 벌레가 용해되기 시작할 때까지 회전하면서 배양합니다.

5분을 넘지 않습니다. M 9가 1에서 아래로 회전하면서 웜을 세 번 씻고, 각 세척 사이에 500 번 G를 깨지 않고 씻습니다. 표백된 배아를 8개의 150mm NGM 플레이트에 넣고 배아가 약 48시간 동안 L 4개의 유충으로 발달할 수 있도록 합니다.

섭씨 22도에서 플레이트를 환경 챔버로 옮기고 4시간 동안 또는 실험 설계에 지정된 기간 동안 저산소 및 무산소 조건에 노출시킵니다. 샘플을 빠르게 수확하려면 저산소 챔버의 뚜껑을 제거하십시오. 샘플 플레이트 하나를 가져와서 챔버 시간을 다시 밀봉하고 단계를 기록합니다.

저산소증에서 기생충을 제거한 후 이 전체 과정은 2분 미만이 소요됩니다. 디스 증류수를 사용하여 나일론 필터로 웜을 씻은 다음 100 마이크로 리터의 1 % SDS 원심 분리기가 들어있는 라벨이 붙은 15 밀리리터 원추형 튜브에 붓습니다. 탁상용 분리기에 있는 SDS에 있는 벌레는 15에서 20 초 동안 1, 500 시간 G이다.

휴식과 함께 진공 청소기를 사용하여 튜브에서 대부분의 supinate를 제거하고 웜 펠릿은 그대로 둡니다. 피펫을 사용하여 미리 결정된 양의 액체가 있는 웜 펠릿을 라벨이 붙은 1.5 마이크로 쓰레기 튜브로 옮깁니다. 샘플이 SDS 페이지에 사용되는 경우,이 튜브는 단백질 로딩의 2 배의 동일한 부피를 함유 할 수 있으며, 염료는 튜브를 밀봉하고 액체 질소에 담글 수 있습니다.

모든 샘플이 분리될 때까지 반복합니다. 일관성을 위해 집 공기 제어 샘플에 대해 다음 절차를 따르십시오.샘플은 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 이 수치는 1000ppm의 산소, 5, 000ppm의 산소 및 약 210, 000ppm의 산소에 노출된 배아의 생존 능력을 보여줍니다.

배아는 연속 흐름 산소 챔버에서 24시간 동안 각 조건에 노출됩니다. 지렁이를 정상 산소 상태로 옮겨 48시간 동안 성충으로 발달시킨 다음 성충이 될 때까지 생존 가능성에 대한 점수를 매겼습니다. 이 절차에 따라 웨스턴 블롯 QPCR 또는 수명 또는 자손 생산과 같은 생리학적 분석에 의한 후속 분석을 위해 샘플을 수집할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 자신의 실험실에서 연속 흐름 저산소증 챔버를 설정하는 방법을 잘 알게 될 것입니다.