PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 PDZ 의존적 낭성 섬유증 transmembrane conductance regulator(CFTR) 거대 분자 신호 전달 복합체를 in vitro에서 조립하는 것입니다. 이를 위해 재조합 태그 융합 단백질을 박테리아에서 발현시키고 정제합니다. 그다음, CFTR 또는 CFTR 결합 단백질을 발현하는 배양물로부터 세포 용해물을 얻습니다.

그 후 CFTR과 결합 단백질들을 in vitro에서 결합시켜 CFTR을 포함하는 거대분자 신호 복합체를 조립합니다. 이어서 Western blotting을 수행하여 CFTR 거대분자 복합체의 형성을 확인하고 이를 분석합니다. 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 CFTR을 포함하는 고단백 거대분자 복합체 개체를 직접적으로 검출하고 시각화할 수 있다는 점입니다.

따라서 이 방법은 거대분자 복합체를 포함하는 CT R의 형성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 이는 sex C two 거대분자 신호 복합체와 같이 CFTR이 관여하지 않는 비단백질 복합체의 조립에도 적용될 수 있습니다. 가장 최근에 우리는 동일한 방법을 사용하여 화학 수용체 CXCR two가 하위 이펙터와 물리적으로 단백질 복합체를 형성한다는 것을 입증하였습니다.

PCR을 사용하여 중성구 내의 PRC beta three가 wild nerve one을 매개하는지 확인합니다. C 말단의 PDZ 모티프를 포함하는 마지막 50 내지 100개의 아미노산을 인코딩하는 DNA를 증폭합니다. CAMP 수송체인 MRP four와 sodium hydrogen exchanger regulatory factor(N-H-E-R-F)의 PDZ 1 도메인에 대해 수행합니다.

다음으로, GST 융합 단백질을 생성하기 위해 RP four PCR R 산물을 PGE X four T one에 클로닝하고, N-H-E-R-F의 PDZ one 도메인을 PET 30에 클로닝합니다. hiss s 융합 단백질을 생성하기 위해, 열 충격법으로 박테리아를 형질전환합니다. 벡터에 적절한 항생제가 포함된 50 milliliters LB 배지를 사용하여, 프로테아제 결핍 e coli 균주를 SOC 배지에서 37 degrees Celsius의 진탕 배양기 내에 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 배양액을 Luria berti 배지 500 milliliters로 10배 희석한 후, 37 °C에서 흔들어주며 다시 배양합니다. 2시간 후, 0.5~1 millimolar IPTG를 사용하여 30 °C에서 4시간 동안 재조합 단백질의 전사를 유도합니다.

배양 후, 배양액을 250 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고 4 °C에서 8,000 ×g로 10분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원심분리 후 상층액을 버리고 lysozyme 1 mg/mL, 0.2% Triton X 100 및 protease inhibitor가 포함된 sucrose buffer 20 milliliters를 첨가하여 세포를 용해합니다. 그런 다음 박테리아 현탁액을 깨끗한 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.

로터리 셰이커를 사용하여 4 °C에서 30분 동안 혼합합니다. 그 후 4 °C에서 20,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액은 투명해지며 튜브 바닥에 불용성 app 펠릿이 형성됩니다.

투명한 상층액을 새로운 50 milliliter 원심분리관에 수집하십시오. 그다지 상층액에 적절한 레진 1 milliliter를 첨가하십시오. Aero beads는 sucrose buffer glutathione 내에서 50% 슬러리 상태로 현탁되어 있습니다.

GST 융합 단백질에는 Aero beads를 사용하고, His S 융합 단백질에는 talon beads를 사용해야 합니다. 회전 쉐이커를 이용하여 4°C에서 4시간 동안 혼합합니다. 그 후 800 ×g에서 2분 동안 비드를 원심 분리합니다.

그 후 15 mL의 PBS에 부유시켜 세척하고, 로테이터에서 2분 동안 혼합합니다. 마지막으로 상층액을 제거합니다. 6번째 세척 후까지 이 단계를 6회 반복합니다.

비즈에서 단백질을 용출시키려면, 비즈 1 mL당 2 mL의 적절한 용출 버퍼를 첨가하고 실온에서 10분 동안 혼합합니다. 비즈와 함께 용출된 단백질 전체를 컬럼에 붓고 통과액을 용출된 단백질로 수집합니다. 그다음, UD 단백질을 투석 튜브로 옮깁니다.

4°C에서 교반하며 2L의 PBS에 용출된 단백질을 투석합니다. 투석 후 4시간마다 PBS를 총 4회 교체합니다. 단백질을 0.5~1mL까지 농축합니다.

10,000 megawatt cutoff cent con 필터를 사용합니다. 샘플을 각각 200 µL씩 분주합니다. 하나는 분석용으로 남겨두고, 나머지는 저장을 위해 -80 °C에 보관합니다.

Bradford법을 이용하여 단백질 농도를 결정하십시오. BSAS 표준물을 이용한 SDS page로 단백질의 품질을 평가하십시오. 단백질의 무결성이 만족스럽지 않은 경우, 겔 여과 또는 이온 교환과 같은 2차 정제 절차를 사용할 수 있습니다.

야생형 flag CFTR을 발현하는 HEK 2 93 세포는 동봉된 문서에 설명된 대로 배양해야 합니다. 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. 그 다음 세포를 용해시키기 위해 60 mm 배양 접시당 500 µL의 lysis buffer를 가하고, 세포 용해물을 4 °C에서 20분 동안 흔들어 섞어줍니다.

용해물을 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그다지 불용성 단백질을 제거하기 위해 4 °C에서 16,000 ×g로 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 수집합니다. in vitro에서 CFTR을 포함하는 거대 분자 복합체를 구성하기 위해 Bradford assay로 단백질 농도를 결정합니다.

정제된 G-S-T-M-R-P four C 말단 50 아미노산 융합 단백질 20 µg과 0에서 40 µg까지 양을 늘린 정제된 hiss S PD zk one 융합 단백질을 200 µL의 용해 버퍼가 담긴 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 함께 넣는 것으로 시작합니다. 두 단백질을 로터리 믹서에서 22 °C로 1~2시간 동안 혼합합니다. 그다음, 글루타치온 비드 50% 슬러리 20 µL를 단백질 혼합물에 첨가하고 1시간 더 혼합합니다.

이 단계는 G-S-T-M-R-P four CT 50이 SPD zk one에 결합하는 쌍별 결합(pairwise binding)이라고도 합니다. 쌍별 결합 단계 이후, 비디오의 이전 섹션에서 설명한 대로 야생형 flag CFTR을 과발현시킨 HEK 2 93 세포 용해물을 준비하십시오. 복합물을 lysis buffer로 두 번 세척하되, 각 세척 시 800 ×g에서 1분 동안 원심분리하고 세척 후에는 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오.

바닥에 가라앉은 비즈가 흡입되지 않도록 주의하십시오. HT K 2 93 세포 용해물을 비즈에 첨가하고, 4 °C의 로터리 믹서에서 3시간 또는 하룻밤 동안 부드럽게 혼합하여 배양합니다. 이전과 동일하게 각 세척 단계 후 원심분리를 수행하며, 마지막 세척을 포함하여 용해 버퍼로 비즈를 3회 세척합니다.

단백질을 용출시키기 위해 5x 샘플 버퍼 30 µL를 추가하고 37 °C 항온수조에서 10~15분 동안 배양합니다. 그 다음, 5,000 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 비드를 침전시킵니다. 이어서, 모든 용출액을 4~15% SDS-PAGE 젤에 로딩하고 200 V에서 젤 끝까지 전기영동을 수행합니다. 전기영동 후, BioRad 전이 장치를 사용하여 60 V에서 1.5시간 동안 단백질 밴드를 PVDF 막으로 전이시킵니다.

전사가 완료되면 5% 탈지분유가 포함된 TBS tween으로 1시간 동안 멤브레인을 블로킹합니다. CFTR 상호작용 단백질을 시각화하기 위해 동봉된 문서에 설명된 대로 웨스턴 블로팅을 진행하십시오. 이 그림 표현에서 보여주는 것과 같이, 본 비디오에서 설명한 대로 CFTR을 포함하는 거대 분자 신호 복합체가 in vitro에서 조립되었습니다.

Mr.RRP four PD zk one의 C 말단 50개 아미노산과 전체 길이의 CFTR 사이에 형성된 거대분자 복합체를 통해 거대분자 복합체 형성의 용량 의존성을 결정하였습니다. 여기에 표시된 바와 같이 중간 단백질인 PD ZK one의 양을 점차적으로 증가시켜 포함했습니다. 복합체 형성이 용량 의존적으로 증가하였으며, 이는 중간 단백질인 PD ZK one이 CCF TR과 Mr.Rrp four 사이의 상호작용을 매개함을 시사합니다.

이 절차를 수행할 때, FTR 응집이 흔히 발생하는 문제이므로 western blotting을 위해 준비한 FTR 컨테이너 미세 분자 복합체 샘플을 끓이지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 대신, 이 절차에 따라 샘플을 겔에 로딩하기 전 37 degree에서 10 to 15 minutes 동안 가열해야 합니다. 기도 상피 세포 및 장 상피 세포와 같은 세포 내의 내인성 CFTR 복합체를 평가하기 위해 공침전(co-precipitation)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 시험관 내(in vitro)에서 PTC 의존적 CFDR 거대분자 신호 전달 복합체를 조립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.