Name: PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 PDZ-의존 CFTR 거대분자 신호 복합체의 체외 조립 방법을. 재조합 태그 융합 단백질을 발현·정제하고 웨스턴 블롯팅으로 복합체 형성을 직접 검출할 수 있습니다.

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우리의 작품은 미국 심장 협회 (대동 동남 제휴) 초급 - 보조금의 0765185B, 엘사 미 Pardee 재단 연구 기금, 그리고 웨인 주립 대학교 교내 시동 펀드, 심장 혈관 연구소 이시스 전략 어워드에서 교부금에 의해 지원되었습니다. 체외 CFTR의 macromolecular 복합 어셈블리에서이 방법은 원래 박사는 AP 통신 Naren (테네시 보건 과학 센터의 대학)에 의해 개척되었다.

1. 박테리아의 재조합 태그 퓨전 단백질의 표현과 정제 <ol><li> CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, 그리고 NHERFs (전체 길이 또는 PDZ1 또는 PDZ2 도메인을위한 C-꼬리 (C-말단에 PDZ 모티프를 포함하는 마지막 50-100 아미노산)의 정의 영역을 확대 ) PCR 방식에 의한. </li><li> GST-융합 단백질에 대한 pGEX4T-1 벡터 (예 : GST-NHERFs, GST-MRP4 중부 표준시와 같은), MBP-융합 단백질에 대한 pMAL-C2 벡터 (예 : MBP-β 2 아칸소 주 중부 표준시, MBP-CFTR 중부 표준시 등에 PCR 제품을 복제 ), 그리고 그의-S-융합 단백질 (예 : 그의-S-CFTR 중부 표준시로서 그의-S-PDZK1)에 대한 pET30. </li><li> 단백 분해 효소 - 결함 E.로 변환 대장균 변형 (BL21-DE3) 가능한 재조합 단백질 저하를 최소화합니다. </li><li> 적절한 항생제 (예 암피실린 또는 kanamycin 등)가 포함된 Luria-Bertani 매체 (산도 7.0)에서 37 ° C에서 하룻밤 문화를 성장. 1시 10분에서 하룻밤 문화를 희석 37에서 다른 2 시인데위한 성장 ° C. 에0.5-1 M M은 30 ° C.에 다음 4 H 위해 IPTG로 duce 8000에서 원심 분리하여 펠렛은 전지 × g로 10 분 4시 ° C. </li><li> (50 M M 트리스-HCL, 산도 8.0, 1m M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M M PMSF, 그리고 10 %의 자당)가 라이 소 자임 (1 밀리그램 / ML), 0.2 % 트리톤 X-100, 및 프로 테아제를 포함하는 자당 버퍼에 전지를 Lyse 에페. 세포 펠렛 문화 1 패에서 발생하는 20 ML을 사용합니다. </li><li> 4 ° C.에서 30 분 로터리 흔드는에 섞어서 </li><li> 4 ° C.에 30 분 동안 20,000 × g에서 던가 맑은 뜨는 수집합니다. </li><li> 맑은 뜨는로 다음과 같은 수지 / 아가로 오스 구슬 (자당 버퍼의 50 % 슬러리) 1 ML 추가 <ul><li> GST 융합 단백질을위한 글루타티온 아가로 오스 비즈. </li><li> 그의-S 융합 단백질에 대한 탈론 구슬. </li><li> MBP 융합 단백질에 대한 아밀로오스 수지. </li></ul></li><li> 4 4 H를위한 믹스 ° 회전 흔드는에서 C #. </li><li> 2 마일을위한 믹싱, 1X PBS (15 ML)에 resuspending하여 구슬을 씻는다N, 800 회전 × G를 2 분, 그리고 폐기 뜨는 위해. 여섯 번에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 각각의 용리 완충액 (구슬 1 ML 당 2 ML의 용출 버퍼)를 사용하여 구슬에서 단백질을 Elute. <ul><li> GST 융합 단백질에 대한 용출 버퍼 : 25 M M 트리스-HCL (산도 8.0), 140 M M NaCl, 20 M M은 글루타티온 감소. </li><li> 그의 융합 단백질에 대한 용출 버퍼 : 20 M M 트리스-HCL (산도 8.0), 500 M M NaCl, 200 M M 이미다졸. </li><li> MBP 융합 단백질에 대한 용출 버퍼 : 20 M M 트리스-HCL (산도 8.0), 200 M M NaCl, 1 M M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 M M DTT, 10 M M 말토오스. </li></ul></li><li> 4에서 1X PBS의 2 패에 대한 eluted 단백질 Dialyze ° C (가능한 단백질 저하를 피하기 위해). PBS 네 번위한 매 4 H를 변경합니다. -80에서 작은 aliquots로 Centricon 필터 (10,000 MW의 컷오프, Millipore)와 저장소를 사용하여 단백질을 집중 ° C. </li><li> Det브래드 포드 방법에 의한 단백질 농도 어민. SDS-PAGE가 표준으로 BSA를 사용하여 단백질 품질을 평가합니다. 단백질의 무결성이 만족되지 않으면 이러한 겔 여과 또는 이온 교환 등의 보조 정화 절차가 사용될 수 있습니다. (예, 우리는 더욱 GST-융합 단백질을 정화하기 위해 G-75 세파 로스 칼럼을 사용했습니다). </li></ol> 2. 세포 배양 및 세포 Lysate 준비 <ol><li> 문화 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포가 그 안정적으로 이상 - 특급 CFTR-wt 및 CFTR-his10 또는 BHK 세포 그 transiently 이상 - 특급 국기-LPA 2 wt 또는 국기-LPA 2 ΔSTL 및 Madin-다비 송곳니 신장 (MDCK 이글의 최소 필수 배지에서 안정적으로 오버 명시 MRP2 (MEM)가 5 % CO 2와 37 10% 소태아 혈청 및 페니실린 / 폴리스티렌 flasks의 스트렙토 마이신 ° C를 포함하는) 세포. </li><li> 문화 인간의 배아 신장 293 (HEK293) 세포를 안정적으로 그 이상 - 특급 CFTR-wt과 Dulbecco에서 CFTR-his10&#39;5 % CO 2와 37 ° C에서 10% 태아 소 혈청 및 페니실린 / 폴리스티렌 flasks의 스트렙토 마이신과 보완의 수정된 이글 배지 (DMEM). </li><li> 사용; - (0.2 % 트리톤-X-100 1m M phenylmethylsulphonyl 플루오르, 1 μg / ML aprotinin, 1 μg / ML 류펩틴, 1 μg / ML의 pepstatin를 포함하는 프로 테아제 저해제의 혼합으로 보충 PBS)가 용해 완충액으로 세포를 Lyse 각각 60 mm 배양 접시, 각각 100 mm 배양 접시 1,000 μL 용해 완충액 500 μL 용해 완충액. </li><li> 세포 ° C 및 4에서 15 분 동안 16,000에서 원심 분리하여 불용성 물질 × g를 제거 ° C. 4에서 20 분 동안 lysates 락앤롤 브래드 포드 분석에 의한 단백질 농도를 확인합니다. </li></ol> 3. CFTR 함유 Macromolecular 단지의 체외 어셈블리에서 (CFTR-PDZK1-MRP4) <ol><li> 용해 완충액 200 μL (PBS - 0.2 % 트리톤 X-100 + 프로 테아제 억제제)로, 20 μg 정화 GST-MRP4-C 터미널을 추가50 AA (CT50) 융합 단백질. </li><li> 그의-S-PDZK1 융합 단백질을 정제의 다양한 양의 (0-40 μg)를 추가합니다. </li><li> 22 1-2 용 ° C ~ H의 회전 믹서에 두 단백질을 섞는다. </li><li> 단백질 혼합물에 20 μL 글루타티온 비즈 (50 % 슬러리)를 추가하고, 다른 한 H 위해 믹스로 진행합니다. 이 단계는 한쌍이 많다는 바인딩로 언급됩니다. </li><li> 이 기간 동안 HEK293 세포 lysates을 준비 그 위의 2 단계에서 설명한대로 overexpress 국기-CFTR (wt)). </li><li> 용해 완충액으로 두 번 복잡한 씻으십시오. 각 세차를위한 1 분 동안 800 × g에서 던가 조심스럽게 각 세척 후에 뜨는을 기음. 아래쪽에 비즈를 빨아하지주의하시기 바랍니다. </li><li> 구슬로 위에 준비된 HEK293 세포 lysates을 추가하고 부드럽게 3 시에 (또는 야간)에 대해 4 ° C에 섞는다. </li><li> 비즈에게 단계 3.6)에 설명된대로 용해 완충액으로 광범위하게 세 번 씻는다. </li><li> 30 μL 샘플 버퍼 (5 ​​×)를 사용하여 단백질을 Elute : 0.6 M<html> 트리스-HCL (산도 6.8), 50 % 글리세롤, 2퍼센트 SDS, 그리고 0.1 % 푸른 bromophenol; 함유 5% β-메르 캅 토 에탄올. </li><li> 5000에 10-15 분, 그리고 스핀에 대한 ° C의 물 목욕 × g 30 s에 대한이 구슬을 침전하는 37에 품어. </li><li> 4-15% 젤로 모든 eluate을로드합니다. </li><li> 30-40 분 정도 SDS-PAGE를 실행합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 PVDF 막에 단백질 밴드를 전송합니다. </li><li> 5% 아닌 지방 우유가 포함된 TBS-십대 초반의 멤브레인를 차단하십시오. </li><li> 4에 일차 항체 (예 : 안티 CFTR IgG, R1104 등) 멤브레인 ° C, 하룻밤을 품어. </li><li> 5 분, 여섯 번 TBS-십대 초반으로 막 씻으십시오. </li><li> 24 ° C.에 45 분 동안 이차 항체 (예 : 염소 항 마우스 HRP-복합 2 차 항체 등) 멤브레인을 품어 </li><li> 5 분, 여섯 번 TBS-십대 초반으로 막 씻으십시오. </li><li> ECL 통해 단백질 밴드를 시각화. </li><li> 대표 데이터는 그림 1에 표시됩니다. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. 대표 결과 체외에서 조립되었다 CFTR 함유 macromolecular 신호 단지의 예제는 그림 1에 표시됩니다. macromolecular 복합은 MRP4 C-단자 50 아미노산 (MRP4-CT50), PDZK1, 그리고 장편 CFTR (그림 1, 아래) 사이에 형성되었다. 복잡한 형성은 중간 단백질, PDZK1 (그림 1, 하단) 18의 양의 증가와 함께 복용 - dependently 증가했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" /> 그림 1. macromolecular 복합 분석의 회화 표현 (위). macromolecular 복합는 복용량에 의존 방식으로 (아래) 18 세 단백질 (GST-MRP4-CT50, 그의-S-PDZK1, 그리고 깃발 CFTRwt)와 체외에서 검출되었다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; CFTR-NHERF1-β 2 AR (ref. 14) </td><td> CFTR-NHERF2-LPA 2 (ref. 15) </td><td> CFTR-PDZ 단백질-MRP 2 (ref. 17) </td><td> CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16) </td></tr><tr><td> 동질 구슬 </td><td> 아밀로오스 수지 </td><td> S-단백질 아가로 오스 </td><td> 아밀로오스 수지 </td><td> 글루타티온 아가로 오스 </td></tr><tr><td> 단백질-1을 정화 </td><td> MBP-β 2 아칸소 주 중부 표준시 </td><td> 그의-S-CFTR 중부 표준시 </td><td> MBP-CFTR 중부 표준시 </td><td> GST-MRP4 중부 표준시 </td></tr><tr><td> 단백질-2 투석을 </td><td> GST-NHERF1 </td><td> GST-NHERF2 </td><td> GST-PDZ 단백질 </td><td> 그의-S-PDZK1 </td></tr><tr><td> (또는 세포 lysates) 단백질-3 투석을 </td><td> CFTR-wt 또는 CFTR-his10 (BHK 또는 HEK 세포 lysates) </td><td> 플래그-LPA 2 wt 또는 국기-LPA 2-ΔSTL (BHK 세포 lysates) </td><td> MRP2 (MDCK 세포 lysates) </td><td> 국기-CFTR-wt 또는 CFTR-his10 (또는 세포 lysates)을 정화 </td></tr><tr><td> 항독소 </td><td> 안티 CFTR IgG </td><td> 안티 - 플래그 HRP </td><td> 안티 MRP2 IgG </td><td> 안티 - 플래그 HRP </td></tr></tbody></table> 체외에서 조립된 다양한 CFTR 함유 macromolecular 컴플렉스의 표 1. 요약.

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<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+intermolecular+and+intramolecular+interactions+regulating+CFTR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function.</a> Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).</li>
<li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜에서 우리는 이전에 보고된 16-19,29,30의 체외은 조립 및 정화 단백질 (혹은 단백질 조각) 및 / 또는 세포 lysates를 사용 macromolecular 신호 복잡한을 포함 CFTR의 검출을위한 방법을 보여주었다. 준비 과정에서 최상의 결과들에게 다음과 같은 중요한 사항을 달성하기 위해서는 특별한주의가 필요합니다 : <ul><li> 그것은 용출 버퍼의 산도가 단계 1)에서 설명한 GST-융합 단백질을 정화시 감소 글루타티온를 삽입한 후 8.0로 조정하는 것이 중요합니다. 산도를 감소 글루타티온의 추가 이후에 3.0만큼 낮은 될 수 있습니다. 산도가 용출되기 전에 조정되지 않을 경우 용출의 효율성이 크게 줄어 듭니다. </li><li> 단백질이 구슬에서 eluted되면, 그들은 바로 dialyzed해야하며 그렇지 않으면 정화 단백질 용액 나올 수도 있습니다. 단백질 투석 바로 용출 과정 이후에 할 수없는 경우 단백질을 elute과 일 그들을 떠나지 말아요E 아가로...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> pGEX4T-1 벡터 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 28-9545-49 </td><td> 이전 Amersham Biosciences </td></tr><tr><td> pMAL-C2 벡터 </td><td> 뉴잉글랜드 BioLabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pET30 벡터 </td><td> EMD 화학 </td><td> 69077-3 </td><td> 이전 Novagen </td></tr><tr><td> 글루타티온 아가로 오스 비즈 </td><td> BD Biosciences </td><td> 554,780 </td><td></td></tr><tr><td> 아밀로오스 수지 </td><td> 뉴잉글랜드 BioLabs </td><td> E8021S </td><td></td></tr><tr><td> 탈론 비즈 </td><td> Clontech </td><td> 635,501 </td><td></td></tr><tr><td> 감소 글루타티온 </td><td> BD Biosciences </td><td> 554,782 </td><td></tD&gt; </tr><tr><td> 이미다졸 </td><td> 어부 </td><td> BP305-50 </td><td></td></tr><tr><td> 말토오스 </td><td> 어부 </td><td> BP684-500 </td><td></td></tr><tr><td> S-단백질 아가로 오스 </td><td> EMD 화학 </td><td> 69704-3 </td><td> 이전 Novagen </td></tr><tr><td> 안티 - 플래그 HRP </td><td> 시그마 </td><td> A8592 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CFTR IgG </td><td> 맞춤 양복 </td><td> R1104 </td><td> AA 722-734에서 CFTR 에피토프을 인식 mAb </td></tr><tr><td> 안티 MRP2 IgG </td><td> Chemicon 국제 </td><td> MAB4148 </td><td> Millipore의 지금 일부분 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약 및 장비.

pdz-의존 cftr의 macromolecular 신호 단지의 체외 분석

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR), 주로 상피 세포의 꼭대기의 세포막에있는 염화물 채널, 1-3 transepithelial 유체 항상성에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 낭성 섬유증 (CF) 4 분비 설사 5 : CFTR은 두 가지 주요 질병에 연루되었습니다. CF에서 CFTR 망할 CIA 채널의 합성 또는 기능적 활동이 줄어 듭니다. 이 질환은 미국에서 2500 Caucasians 년 6 약 1에 영향을 미칩니다. 과도한 CFTR 활동도 캠프의 용기 7의 cGMP 생산을 자극 독소 유발 분비 설사 (예 : 콜레라 독소와 열 안정 E. 대장균의 enterotoxin에 의한)의 경우에 연루되었습니다. 증거를 수집하는 것은 CFTR 및 전송기, 이온 채널, 수용체, kinases, phosphatases, 신호 등 다른 단백질의 증가, 간의 물리적 및 기능적 상호 작용의 존재를 제안ING 분자, 그리고 cytoskeletal 요소 및 CFTR와 바인딩 단백질 간의 이러한 상호 작용은 비판적으로 시험 관내 및 생체내 또한 8-19에서 CFTR-매개 transepithelial 이온 전달을 조절에 관여하는 표시되었습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 방법에 초점을 그 단백질 바인딩 모티브를 가지고 CFTR 카르 복실 말단 꼬리 사이의 상호 작용 연구 지원과 [모티프의 PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ)로 언급] 특정 바인딩 모듈을 포함하는 비계 단백질의 그룹 PDZ 도메인로 지칭. 지금까지 여러 가지 PDZ 비계 단백질 같은 NHERF1 등 다양한 동질성, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-연관된 리간드), Shank2으로 CFTR의 카르 복실 말단 꼬리에 바인딩하고, 20-27를 파악하는 것으로보고되었습니다. PDZ 비계 단백질에 의해 인식되는 CFTR 사이 PDZ의 모티브는 C 말단 (즉, 인간의 CFTR에있는 1477-DTRL-1480) 20에서 마지막 네 아미노산이다. 흥미롭게도,CFTR은 동질성에게 22 변화와 함께이라도 NHERFs 및 PDZK1 모두 하나 이상의 PDZ 도메인을 바인딩할 수 있습니다. CFTR 구속력와 관련해서이 multivalency는 PDZ 비계 단백질은 세포 16-18에서 선택 / 특정하고 효율적인 신호를위한 복합 신호 CFTR의 macromolecular 형성을 촉진있다는 것을 암시, 기능성 중요한 것으로 표시되었습니다. 여러 생화학 assays는 공부를하기 위해 개발되었습니다 CFTR - 참여 등 공동 immunoprecipitation, 풀다운 분석, 페어 많다는 구속력을 분석, colorimetric 한쌍이 많다는 구속력을 분석하고, macromolecular 복잡한 어셈블리 분석 16-19,28,29 같은 단백질 상호 작용, . 여기 단백질 단백질이나 CFTR 16-19,28,29 관련된 도메인 도메인 상호 작용을 연구하기위한 실험실에 의해 광범위하게 사용되는 체외에서 복잡한 PDZ 모티브 종속적인 CFTR 함유 macromolecular 조립의 세부 절차에 초점.

낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR), 상피 염화물 채널, 각종 단백질과 상호 작용하고 중요한 세포 과정을 조절하는 것으로보고되었습니다; 그들 가운데 CFTR PDZ 모티프-매개 상호 작용이 잘 문서화되었습니다. 이 프로토콜은 우리가 복잡한 신호 PDZ-의존 CFTR의 macromolecular를 조립하기 위해 개발된 방법을 설명합니다<em&gt; 체외에서</em&gt;.

PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

주로 상피세포의 정단막에 위치한 염화이온 통로인 낭성 섬유증 막관통 전도 조절기(CFTR)는 ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 PDZ 의존적 낭성 섬유증 transmembrane conductance regulator(CFTR) 거대 분자 신호 전달 복합체를 in vitro에서 조립하는 것입니다. 이를 위해 재조합 태그 융합 단백질을 박테리아에서 발현시키고 정제합니다. 그다음, CFTR 또는 CFTR 결합 단백질을 발현하는 배양물로부터 세포 용해물을 얻습니다.그 후 CFTR과 결합 단백질들을 in vitro에서 결합시켜 CFTR을 포함하는 거대분자 신호 복합체를 조립합니다. 이어서 Western blotting을 수행하여 CFTR 거대분자 복합체의 형성을 확인하고 이를 분석합니다. 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 CFTR을 포함하는 고단백 거대분자 복합체 개체를 직접적으로 검출하고 시각화할 수 있다는 점입니다.따라서 이 방법은 거대분자 복합체를 포함하는 CT R의 형성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 이는 sex C two 거대분자 신호 복합체와 같이 CFTR이 관여하지 않는 비단백질 복합체의 조립에도 적용될 수 있습니다. 가장 최근에 우리는 동일한 방법을 사용하여 화학 수용체 CXCR two가 하위 이펙터와 물리적으로 단백질 복합체를 형성한다는 것을 입증하였습니다.PCR을 사용하여 중성구 내의 PRC beta three가 wild nerve one을 매개하는지 확인합니다. C 말단의 PDZ 모티프를 포함하는 마지막 50 내지 100개의 아미노산을 인코딩하는 DNA를 증폭합니다. CAMP 수송체인 MRP four와 sodium hydrogen exchanger regulatory factor(N-H-E-R-F)의 PDZ 1 도메인에 대해 수행합니다.다음으로, GST 융합 단백질을 생성하기 위해 RP four PCR R 산물을 PGE X four T one에 클로닝하고, N-H-E-R-F의 PDZ one 도메인을 PET 30에 클로닝합니다. hiss s 융합 단백질을 생성하기 위해, 열 충격법으로 박테리아를 형질전환합니다. 벡터에 적절한 항생제가 포함된 50 milliliters LB 배지를 사용하여, 프로테아제 결핍 e coli 균주를 SOC 배지에서 37 degrees Celsius의 진탕 배양기 내에 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 배양액을 Luria berti 배지 500 milliliters로 10배 희석한 후, 37 °C에서 흔들어주며 다시 배양합니다. 2시간 후, 0.5~1 millimolar IPTG를 사용하여 30 °C에서 4시간 동안 재조합 단백질의 전사를 유도합니다.배양 후, 배양액을 250 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고 4 °C에서 8,000 ×g로 10분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원심분리 후 상층액을 버리고 lysozyme 1 mg/mL, 0.2% Triton X 100 및 protease inhibitor가 포함된 sucrose buffer 20 milliliters를 첨가하여 세포를 용해합니다. 그런 다음 박테리아 현탁액을 깨끗한 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.로터리 셰이커를 사용하여 4 °C에서 30분 동안 혼합합니다. 그 후 4 °C에서 20,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액은 투명해지며 튜브 바닥에 불용성 app 펠릿이 형성됩니다.투명한 상층액을 새로운 50 milliliter 원심분리관에 수집하십시오. 그다지 상층액에 적절한 레진 1 milliliter를 첨가하십시오. Aero beads는 sucrose buffer glutathione 내에서 50% 슬러리 상태로 현탁되어 있습니다.GST 융합 단백질에는 Aero beads를 사용하고, His S 융합 단백질에는 talon beads를 사용해야 합니다. 회전 쉐이커를 이용하여 4°C에서 4시간 동안 혼합합니다. 그 후 800 ×g에서 2분 동안 비드를 원심 분리합니다.그 후 15 mL의 PBS에 부유시켜 세척하고, 로테이터에서 2분 동안 혼합합니다. 마지막으로 상층액을 제거합니다. 6번째 세척 후까지 이 단계를 6회 반복합니다.비즈에서 단백질을 용출시키려면, 비즈 1 mL당 2 mL의 적절한 용출 버퍼를 첨가하고 실온에서 10분 동안 혼합합니다. 비즈와 함께 용출된 단백질 전체를 컬럼에 붓고 통과액을 용출된 단백질로 수집합니다. 그다음, UD 단백질을 투석 튜브로 옮깁니다.4°C에서 교반하며 2L의 PBS에 용출된 단백질을 투석합니다. 투석 후 4시간마다 PBS를 총 4회 교체합니다. 단백질을 0.5~1mL까지 농축합니다.10,000 megawatt cutoff cent con 필터를 사용합니다. 샘플을 각각 200 µL씩 분주합니다. 하나는 분석용으로 남겨두고, 나머지는 저장을 위해 -80 °C에 보관합니다.Bradford법을 이용하여 단백질 농도를 결정하십시오. BSAS 표준물을 이용한 SDS page로 단백질의 품질을 평가하십시오. 단백질의 무결성이 만족스럽지 않은 경우, 겔 여과 또는 이온 교환과 같은 2차 정제 절차를 사용할 수 있습니다.야생형 flag CFTR을 발현하는 HEK 2 93 세포는 동봉된 문서에 설명된 대로 배양해야 합니다. 세포에서 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. 그 다음 세포를 용해시키기 위해 60 mm 배양 접시당 500 µL의 lysis buffer를 가하고, 세포 용해물을 4 °C에서 20분 동안 흔들어 섞어줍니다.용해물을 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그다지 불용성 단백질을 제거하기 위해 4 °C에서 16,000 ×g로 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 수집합니다. in vitro에서 CFTR을 포함하는 거대 분자 복합체를 구성하기 위해 Bradford assay로 단백질 농도를 결정합니다.정제된 G-S-T-M-R-P four C 말단 50 아미노산 융합 단백질 20 µg과 0에서 40 µg까지 양을 늘린 정제된 hiss S PD zk one 융합 단백질을 200 µL의 용해 버퍼가 담긴 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 함께 넣는 것으로 시작합니다. 두 단백질을 로터리 믹서에서 22 °C로 1~2시간 동안 혼합합니다. 그다음, 글루타치온 비드 50% 슬러리 20 µL를 단백질 혼합물에 첨가하고 1시간 더 혼합합니다.이 단계는 G-S-T-M-R-P four CT 50이 SPD zk one에 결합하는 쌍별 결합(pairwise binding)이라고도 합니다. 쌍별 결합 단계 이후, 비디오의 이전 섹션에서 설명한 대로 야생형 flag CFTR을 과발현시킨 HEK 2 93 세포 용해물을 준비하십시오. 복합물을 lysis buffer로 두 번 세척하되, 각 세척 시 800 ×g에서 1분 동안 원심분리하고 세척 후에는 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오.바닥에 가라앉은 비즈가 흡입되지 않도록 주의하십시오. HT K 2 93 세포 용해물을 비즈에 첨가하고, 4 °C의 로터리 믹서에서 3시간 또는 하룻밤 동안 부드럽게 혼합하여 배양합니다. 이전과 동일하게 각 세척 단계 후 원심분리를 수행하며, 마지막 세척을 포함하여 용해 버퍼로 비즈를 3회 세척합니다.단백질을 용출시키기 위해 5x 샘플 버퍼 30 µL를 추가하고 37 °C 항온수조에서 10~15분 동안 배양합니다. 그 다음, 5,000 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 비드를 침전시킵니다. 이어서, 모든 용출액을 4~15% SDS-PAGE 젤에 로딩하고 200 V에서 젤 끝까지 전기영동을 수행합니다. 전기영동 후, BioRad 전이 장치를 사용하여 60 V에서 1.5시간 동안 단백질 밴드를 PVDF 막으로 전이시킵니다.전사가 완료되면 5% 탈지분유가 포함된 TBS tween으로 1시간 동안 멤브레인을 블로킹합니다. CFTR 상호작용 단백질을 시각화하기 위해 동봉된 문서에 설명된 대로 웨스턴 블로팅을 진행하십시오. 이 그림 표현에서 보여주는 것과 같이, 본 비디오에서 설명한 대로 CFTR을 포함하는 거대 분자 신호 복합체가 in vitro에서 조립되었습니다.Mr.RRP four PD zk one의 C 말단 50개 아미노산과 전체 길이의 CFTR 사이에 형성된 거대분자 복합체를 통해 거대분자 복합체 형성의 용량 의존성을 결정하였습니다. 여기에 표시된 바와 같이 중간 단백질인 PD ZK one의 양을 점차적으로 증가시켜 포함했습니다. 복합체 형성이 용량 의존적으로 증가하였으며, 이는 중간 단백질인 PD ZK one이 CCF TR과 Mr.Rrp four 사이의 상호작용을 매개함을 시사합니다.이 절차를 수행할 때, FTR 응집이 흔히 발생하는 문제이므로 western blotting을 위해 준비한 FTR 컨테이너 미세 분자 복합체 샘플을 끓이지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 대신, 이 절차에 따라 샘플을 겔에 로딩하기 전 37 degree에서 10 to 15 minutes 동안 가열해야 합니다. 기도 상피 세포 및 장 상피 세포와 같은 세포 내의 내인성 CFTR 복합체를 평가하기 위해 공침전(co-precipitation)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 시험관 내(in vitro)에서 PTC 의존적 CFDR 거대분자 신호 전달 복합체를 조립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.

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PDZ-의존 CFTR의 Macromolecular 신호 단지의 체외 분석

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