Name: Azoxymethane (AOM)과 Dextran의 황산 나트륨 (DSS)와 모델링 대장염 - 관련 암 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 배우세요 AOM-DSS 투여를 통한 쥐 대장암 유도 프로토콜. 염증성 장 질환 관련 암의 발생 기전 연구와 항암 치료 개발에 활용할 수 있는 신뢰성 높은 동물 모델을 구축하는 방법을 확인하세요.

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이 작품은 DK089016와 L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS) 및 P30-DK52574 (워싱턴 대학 소화기 질환 연구 코어까지)에 의해 부분적으로 재정 지원을했습니다. AIT는 하워드 휴즈 의학 연구소 의학 연구 교육 연구원이었다.

1. 대장염 - 관련 암 유도 <ol><li> 섹스 케이지와 실험 및 제어 그룹에 사용되는 나이와 일치하는 6~8주 오래된 쥐를 따로 설정합니다. 마우스는 개별적으로 꼬리 표시 또는 귀 클립으로 표시 할 수 있습니다. </li><li> 일 0, 기록 기준 가중치를 켜고 10 AOM 작업 솔루션의 MG / kg (dH2O의 10 MG / ML 주식 솔루션에서 희석 등장 생리 1 MG / ML은 -20 ℃ 일 C에서 보관)와 각 마우스 intraperitoneally (IP)을 주입 . 경험을 바탕으로,이 용량은 7-14 밀리그램 / kg 및 / 사이에 조정 또는 초기 실험에서 반복 할 수 있습니다. </li></ol> 주의 : AOM은 불안정 genotoxic 요원과 함께 MSDS에 따라 신중하게 처리해야합니다. Dilutions는 화학 후드에서 준비 얼음에 유지하고, 기관 특정 프로토콜에 따라 폐기해야합니다. <ol start="3"><li> 0.22 μm의 셀룰로스 아세테이트 F 조를 통해 (2.5 g/100 ML) 증류수와 패스의 DSS 솔루션을 2.5 %을진공의 ilter. 이 용량은 마우스 변형 및 환경에 따라 1-3.5 % 사이에서 조정할 수 있습니다. 최대 1 주일에 한 번 준비 DSS 솔루션은 냉장 보관 할 수 있습니다. </li><li> 에서 하루에 7, 자신의 식수로 마우스로 공급 DSS 솔루션입니다. 약 250 ML / 케이지는 새로운 DSS는 5 마우스 / 케이지의 최대 제공 될 때마다이 필요합니다하지만, 이러한은 견적하고 동물 시설에서 사용 물 병의 유형에 따라 달라집니다. </li><li> 7 일 동안 DSS의 연속적인 공급을 제공하기 위해 DSS 솔루션은이 기간 동안 깨끗한 병 세 번 (매주 2-3일)에서 교체해야합니다. 일부 수사관들이 노출의 척도와 같은 새로운 솔루션으로 교체하기 전에 소비 DSS의 양을 측정합니다. </li><li> 일 14 일 두 주 동안 다시 표준 마시는 물 새장을 전환 할 수 있습니다. </li><li> 단계를 반복 (1.4) - (1.6) 일 28 49에은 DSS의 두 번째 및 세 번째 사이클을 제공합니다. DSS &quot;사이클&quot;은 마실 물에 DSS의 1 주일 구성일반 (autoclaved) 물 2 주 뒤에. </li></ol> 2. 임상 평가 대장염 및 종양 진행 <ol><li> 마우스는 무게 / 2 ~ 3 배 주당를 관찰해야합니다. 기준에 상대적인 비율 체중 감소는 대장염의 심각성의 대리 측정으로 사용됩니다. 직장 출혈, 설사, 또는 탈출의 정기 평가는 다양한 점수 시스템에 따라 실험 목표에 따라 만들어보고 할 수 있습니다. 9, 10 </li><li> 설사 직장 출혈로부터 2-3 일 이상의 함께 10 %까지의 체중 감소는 DSS (매일 관찰이 바로 후 DSS 기간 동안 유용 할 수 있음)의 전체주기에 따라 주 예상 할 수 있습니다. </li></ol> 그것은 어떤 쥐가 복구하지 않을 수 있습니다, 자신의 체중의 20 % 이상을 잃을 마우스는 생존 할 가능성이 줄어들 및 조기 안락사를 필요로 할 수 있습니다. 0.5의 단일 IP 분사 - 같은 쥐 1.0 ML의 생리는 flui를 수정으로 유용한 지원 조치 할 수 있습니다<html> D 볼륨 설사로 인해 잃었습니다. 3. 손쥐 내시경 (선택 사항) <ol><li> DSS의 제 2 또는 제 3주기에 따라 내시경 전에 희생 할 생체 내 종양 성장을 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. AOM / DSS 모델은 종양을 생산에 매우 신뢰성으로,이 단계는 일반적으로 필요하지 않습니다. 이 마우스 종양을 방해 할 수있는 가능성이로 몇 마우스는이 방법을 사용하여 평가해야합니다. 11 </li><li> 흡입 또는 injectable 진정 작용과 함께 마우스를 마취. </li><li> 마우스 anesthetized되면​​ 꼬리와 가슴에 테이프로 평면 보드에 마우스를 고정하십시오. </li><li> 마우스 항문은 부드럽게 intraluminal보기를 개선하고 지저분한 내용을 제거 할 수 급증하고 관개하는 생리 사용에 손쥐 내시경을 부활 시켰습니다. (내시경도 생리에 대한 대안이 기술로 공기 insufflation를 사용하여 수행 할 수 참고 종양의 개선 시각화를 제공 할 수 있습니다. 12) </li></ol>전자 &quot;&gt; 4. 마우스 희생과 대장 수확 <ol><li> 일 70에서 각 AOM / DSS 처리 마우스는 여러 결장 종양 항구와 평가를위한 준비가되어 있어야합니다. 큰 종양이 원하는 경우이 기간은 개월 주 정도 지연 될 수 있습니다. (주의, prolapsed 심각한 직장이있는 마우스는 기관 동물 보호위원회에 따라 동물에 과도한 불편 함을 피하기 위해 조기 euthanized해야 할 수도 있습니다.) </li><li> 검시하기 전에, 개별적으로 isoflurane과 자궁 전위 (또는 다른 제도가 승인 한 방법)으로 쥐를 안락사시켜야. 최종 무게 및 기타 측정이 시간에 만들 수 있습니다. </li><li> 도마에 노출의 복부 측면으로 마우스를 놓는다. 대장 추출하는 동안 복부 내용을 오염 머리카락을 방지하기 위해 70 %의 에탄올과 복부를 커버. </li><li> 복부의 중간 선을 파악하고 복막을 노출 할 수있는 작은 절개를 만들기 위해 집게를 사용하십시오. </li><li> 늑골 margi 함께 복부의 각면에이 절개를 확장N. </li><li> 콜론은 anorectal 교차점으로 수확 할 수 있도록 골반을 끊으 가위를 사용합니다. DSS의 대장염 부상은 말초 직장에서 가장 큰이며, 따라서,이 가장 큰 종양이 개발 지역이기 때문에이 중요합니다. </li><li> 이러한 창 자간 막 림프절 등의 추가 조직도이 시간에 수확 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 매크로 분석을 위해 대장 준비 <ol><li> 5 ML의 주사기에 부착 18G gavage 바늘 사용, 얼음처럼 차가운 physiologic 방향으로 유체 이탈이 생리 (PBS) 등 인산 버퍼로 콜론를 플러시. 콜론 조직은 RNA 또는 단백질 기반의 분석을 위해 사용됩니다 경우에는 사전에 차가운 작업 트레이를 채용하여 감기에 보관 할 수 있습니다. </li><li> 추위 트레이로의 장간막과 페인트를 따라 길이 방향으로 플러시 콜론을 엽니 다. 종양이 대장이 어두운 표면에 배치 될 때 더 쉽게 시각화 수 있습니다. 또한, 1 % Alcian 파란 염료는 t을 강조하기 위해 적용 할 수있는umors. 자 또는 디지털 캘리퍼스와 종양 번호와 크기를 평가합니다. </li><li> 종양과 인접한 정상적인 조직의 작은 부분은 조직 학적 평가를위한 나머지 대장의 일부를 남겨두고 RNA, 단백질, 또는 immunohistochemical (IHC) 방법으로 향후 분석을 위해이 시점에서 excised 수 있습니다. </li></ol> 즉시 단계 5.2에 따라 총 결장 표본의 디지털 사진 위에 설명 된대로 콜론의 상당 부분은 분석의 다른 형태의 excised 특히 경우, 종양 부담의 정확한 분석을 위해 도움이 될 수 있습니다. 종양 부담 (%)는 등 ImageJ로 무료 소프트웨어를 사용 종양 지역 / 총 콜론 지역으로 계산 될 수있다. 6. 조직 학적 평가의 대장 준비 <ol><li> 주사기 또는 손가락을 통해 추위를 트레이에 남아있는 콜론에 포르말린 10 %를 적용합니다. 조직이 방식으로 최소 30 초에 해결 할 수 있도록하는 것은 고정 분지로 전송을 용이하게한다. 포르말린 확인 잔류 wip입니다에드에서 이전에 같은 트레이에 새로운 오픈 콜론을 색칠합니다. </li><li> 10% 포르말린로 가득 분지에 콜론을 전송하고 가장자리가 아래로 핀. </li><li> 고정의 3 시간 후, 70 % 에탄올에 콜론을 전송할 수 있습니다. 콜론은 무기한으로 70 % 에탄올에 보존 할 수 있습니다. </li><li> 콜론 (직장 / 말초, 미드, 근위)의 세 세로 섹션은 2 %의 한천에 안정화와 파라핀 퍼가기 위해 제출 할 수 있습니다. 근위 콜론과 콜론 / 직장 말초 각 마우스에 대한 균일 한 방식으로 방향 있으니 안심하십시오. </li><li> 형성 이상, 토굴 손상과 염증은 이전에 다음 ID로 출판 프로토콜에 따라 경험이 풍부한 개인에 의해 설명하고 평가 할 수 있습니다. 실험은 초기 dysplastic 이벤트를 감지에 관심이 경우 10, 13-15 마우스는 일 70 이전에 희생 할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 여기에 설명 된 AOM / DSS 모델은 연구자가 안정적으로 마우스에 결장 종양을 생성 할 수 있습니다.이 모델에서 종양 성장은 직접적으로 연관된 염증 과정에 의해 영향을받습니다. 대장염의 심각도는 설사 / hematochezia의 체중 감소 및 현재 (그림 2)에 따라 임상 적으로 모니터링해야합니다. 질병 활동이 신호는 DSS가 제거 된 후에 DSS 사이클의 날 (5)에 의해와 4 개 이상의 일을 시작하는 경향이 있습니다. 드물게 상당한 직장 종양 부담이있는 마우스는 직장 탈출증을 개발 할 수 없습니다. 제 2 또는 제 3 DSS주기 설사는 영구적 될 수 있습니다 후. 일반적으로 종양 전에 DSS의 세 번째 사이클 (그림 3)에 손쥐 검사법으로 현재와도 확인할 수있다. 추가 시간과 수확의 시간 (그림 4)에서 더 큰 종양의 DSS 결과의 세 번째 코스입니다. 얼룩 붙이기도 적용 Alcian 파란의 사용은 종양 (그림 5) 강조하기 위해 사용할 수 있습니다. colonic 종양의 사진은 양적 종양 생산과 크기를 비교하는 데 사용할 수있는 종양 측정을 생성에 도움이 될 것입니다실험 그룹 사이 (그림 6). 고정과 파라핀 임베디드 결장 표본 그런 다음 조직학 또는 immunohistochemical 얼룩의 사용 (그림 7, 8)을 평가 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. AOM과 DSS 관리의 도식. AOM은 (10 MG / kg) 일 0에 주입된다. 두 번째 주 (7 일)의 시작 부분에서 2.5 % DSS 솔루션들은 식수의 생쥐에 투여합니다. DSS 7 일이 autoclaved 물을 2 주 뒤에 있습니다. DSS의 추가 두 사이클은 희생 사전에 관리하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig2.jpg" alt="그림 2" /> AOM과 DSS 관리 기간 동안 기준에 비해 그림 2. 마우스 무게. 주, 마우스 로스를 각 DSS주기를 따라합니다<html> 자신의 몸무게의 전자 5~10%. 이 실험에서 체중 감량 대장염의 심각성에 대한 대리 마커입니다. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. AOM / DSS 치료 일 50 손쥐 내시경을 통해 말초 콜론에서 종양의보기. 일반 콜론에 비해 말초 콜론의 내강을 방해 여러 polypoid 대중 (B, C)를 (A) 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4는. 길이 방향으로 종양의 총 모양을 보여주는 마우스 콜론을 열었습니다. 콜론 / 직장 (왼쪽 상단 이미지) 말초에서 높은 종양 부담하고, 작은 종양의 성장과 근위 대장 (오른쪽 상단 이미지)의 특성 rugated 질감을합니다. 말초 콜론의 전망을 최대 가까이는 다양한 크기 (아래)의 다양한 종양을 보여줍니다. ove_content &quot;강한 : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig5.jpg" alt="그림 5" /> Alcian 파란의 응용 프로그램에 의해 강조 그림 5. 종양 얼룩. 염료는 대장의 정상적인 질감뿐만 아니라 각 종양의 국경을 강조하는 방법 있습니다. 이러한 착색은 통치자 또는 디지털 측정하여 종양 영역의 정확한 측정에 도움이 될 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. AOM / DSS로 치료 마우스를 당 종양의 평균 개수의 대표 유통. 종양의 대부분은 말초 콜론에 자리 잡고 있습니다 참고 및 크기에 &lt;2mm 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig7.jpg" alt="그림 8" /> 그림 7. 파라핀 - 임베디드 (위) 카세트의 대장의 길이 방향 섹션H &amp; E 다음 슬라이드에서 D (아래) 얼룩. 그 잔여 Alcian이 얼룩 푸른 H &amp; E의 착색을 방해하지 않습니다. 큰 종양은 슬라이드 이미지 (원)에 동그라미되어 있습니다. 지정 &quot;말초&quot;, &quot;중간&quot;및 &quot;이게 맹장과 항문 사이의 3에 전체 콜론을 sectioning에서 근위 &#39;결과. <img src="/files/ftp_upload/4100/4100fig8.jpg" alt="그림 8" /> 그림 8. 말초 콜론에 AOM / DSS 관리로 인한 종양 대표 조직학. H &amp; E, BrdU, 그리고 (맨 위 패널) 50X와 400 배로 확대 한 β-catenin 스테인드 슬라이드 (아래 패널) 각각 콜론 인간의 adenocarcinomas와 유사한 dysplastic 변경 사항을 보여줍니다.

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신속하고 효율적으로 모델을 인간 대장염 - 관련 암 AOM과 DSS있는 마우스의 치료. 대장염 - 관련 암에 기여 요소를 물려 전할 수있는에 관한 가설을 쉽게 유전 공학 마우스와 함께 공부 할 수 있습니다. 13, 또는 16, 대장염 - 관련 암의 pharmacologic 목표의 효과가 야생 형 생쥐를 고용하여 공부 할 수 있습니다. 이 모델은 높은 염증의 설정에 결장 종양 개발의 연구에 관심을 가진 자에 의해 가치를하는 동안, 제한이 존재합니다. 이 모델의 생쥐에서 관찰 질병의 정도는 상당히 마우스 변형 및 주택 조건 (caging, 먹이, microbiota 등)에 따라 달라질 수 있습니다. 스즈키 동부 표준시. 알은 Balb / C 마우스는 (종양 발생과 다양성을 감소 위해) / 129에서 혼자 DSS와 AOM를 포함 C57BL/6N, C3H/HeN 및 DBA/2N 마우스. 17 실험 뒤에 AOM / DSS에 가...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> C57BL/6J 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 000664 </td><td></td></tr><tr><td> Azoxymethane (AOM) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A5486-100MG </td><td> 증권 솔루션 : 희석 10 0.5으로 -20 ° C에서 보관 할 증류수에 MG / ML - 1 ML의 aliquots. 작업 솔루션 : 등장 1 MG / ML (0.9 %) 생리에 주식을 희석 </td></tr><tr><td> Dextran의 황산 나트륨 (DSS) </td><td> TdB 컨설팅 </td><td> DB001 </td><td> MW 40 kDa (다른 출처 36-50 kDa의 준비는 허용, 같은 많은 하나의 실험을 위해 사용되어야합니다) 6 </td></tr><tr><td> Coloviewminiendoscopic 시스템 </td><td> 칼 Storz </td><td> 복수 </td><td> 장비 및 설치에 대한 자세한 설명은 베이커 외 있습니다. 참조하십시오. 11 </td></tr><tr><td> TPP 신속한 FILTERMAX 500 ML 병 - 필터, 0.22 μm PES </td><td> 중서부 과학 </td><td> TP99500 </td><td> 모든 표준 조직 문화 필터는 허용합니다 </td></tr><tr><td> 에틸 알콜 200 증명 ASC / USP </td><td> Pharmaco-AAPER (또는 다른) </td><td> 11ACS200 </td><td> 증류수에 70 %를 희석 </td></tr><tr><td> Isoflurane, USP </td><td> 버틀러 동물 건강 공급 </td><td> 4029405 </td><td> 거즈 나 마취에 배어있는 작은 천으로 유리 병에서 개최 마우스 </td></tr><tr><td> 18G 스트레이트 Gavage 니들 </td><td> Braintree 과학 </td><td> N-008 </td><td></td></tr><tr><td> 인산염은 식염 (PBS)를 버퍼 </td><td> 시그마올드리치 </td><td> P5493 </td><td> 증류수에 1X (0.01 M)으로 희석 </td></tr><tr><td> 감기 트레이 (조직 테크 II 감기 플레이트) </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC9491941 </td><td> -20 ° C에서 저장 </td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> NIH (무료 다운로드) </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr><tr><td> 포름 알데히드 (37 %) </td><td> 피셔 과학 </td><td> F79-500 </td><td> PBS에서 10 %로 희석 </td></tr><tr><td> BD Bacto 한천 </td><td> 피셔 과학 </td><td> DF0140-01-0 </td><td> 증류수에 2 %의 솔루션을 생성 할 열판을 사용하여 </td></tr><tr><td> Miltex 눈 드레싱 포셉 </td><td> MedPlus 주식회사 </td><td> 18-780 </td><td></td></tr><tr><td> Miltex 아이 가위 </td><td> MedPlus 주식회사 </td><td> 18-1430 </td> &lt;TD&gt; 구부러진 포인트 여는 동안 콜론의 손상을 방지한다. </td></tr><tr><td> Alcian 블루 8GX (분말) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A5268 </td><td> 100 ML 3퍼센트 아세트산 (3 ML 빙하 아세트산 + 97 ML 증류수)에 1g 분말을 추가 </td></tr><tr><td> intradermal 베벨 주사 바늘에 첨부 된 26 G X 팔분의 삼 1 ML 투베르쿨린 주사기 </td><td> BD </td><td> 305946 </td><td> AOM의 분사에 대한 </td></tr></tbody></table>

azoxymethane (aom)과 dextran의 황산 나트륨 (dss)와 모델링 대장염 - 관련 암

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

이러한 Crohn의 질병 (CD) 또는 궤양 성 대장염 (UC)와 같은 염증성 장 질환이있는 개인 (IBD)는 건강한 개인을 통해 대장 암 (CRC)을 개발의 증가 위험이 있습니다. 이 위험은 널리 colonic 참여와 오랜 UC와 개인 30 %로 높이 누적 발병률과 질병의 기간 및 범위에 비례한다. IBD와 대장염 관련 암 (CAC)에서 1 Colonic 형성 이상은 결과로 개발 믿어 아르 이러한 세포는 만성 염증성 시토 킨 환경에 목욕을하는 동안 2. 자연과 대장염 - 관련 암이되는 adenocarcinomas의 질을 공유하는 동안 상피 세포 손상 및 수리의 반복주기를, 하부 분자 이벤트의 순서는 서로 다른 것으로되어 있습니다. 3이 차이는 CAC의 특정 동물 모델의 필요성을 주장하고있다. 여러 마우스 모델은 현재 CAC의 연구를 위해 존재합니다. Dextran 황산 sodi음 ... (DSS), colonic 상피에 직접 독성 효과 요원이 만성 염증 상태를 만드는 여러 사이클의 생쥐에 물을 마시는으로 시행 할 수 있습니다. 충분한 기간으로,이 마우스 중 일부는 종양을 개발합니다. 프로 발암 설정으로 시행하는 경우 4 종양 개발이이 모델에 크게된다. 이러한 tumorigenesis 경로에서 유전자 변이가있는 마우스 (APC, p53의, Msh2)뿐만 아니라, 마우스 genotoxic 대리인 (azoxymethane [AOM], 1,2 - dimethylhydrazine [DMH]) 5.이 사전 처리를 포함 대장염 관련 암에 대한 모델로 AOM과 DSS의 결합은 재현성, 효력, 낮은 가격, 사용의 용이성에 대한 인기를 얻었습니다. 사람들이 공유 메커니즘을 가지고 있지만, AOM은 DMH보다 솔루션에 더 강력한 안정적으로 발견되었습니다. 다른 모델에서 종양이 개발은 일반적으로 필요로하는 동안 몇 개월은 AOM과 함께 주입하고 이후 DSS로 치료 쥐에 충분한 종양을 개발S 7~10주로 조금. 6, 7 마지막으로, AOM과 DSS는 특정 tumorigenic 변형에 크로스 번식없이 유전 배경 마우스 (유전자 변형 등을 끊는)로 관리 할 수 있습니다. 여기, 우리는 10 주 동안 DSS 세 7 일 사이클 뒤에 AOM의 단일 주사를 이용하여 마우스에 염증 기반 colonic tumorigenesis에 대한 프로토콜을 보여줍니다. 이 모델은 밀접하게 인간의 CAC에서 발생하는 사람들을 닮은 조직 학적 및 분자 변화에 종양을 유도하고이 병에 oncogenesis과 화학 예방의 연구에 매우 중요한 모델을 제공합니다. 8

우리는 빠르게 친 염증성 에이전트 dextran 황산 나트륨 (DSS)의 세주기에 의해 다음과 일관되게 인간의 대장염에서 본 것과 morphologic와 분자 유사성과 마우스에 결장 종양을 생성 genotoxic 에이전트 azoxymethane (AOM)의 어느 관리의 프로토콜을 보여줍니다 암을 관련.

Azoxymethane (AOM)과 Dextran의 황산 나트륨 (DSS)와 모델링 대장염 - 관련 암

크론병(CD) 또는 궤양성 대장염(UC)과 같은 염증성 장질환(IBD) 환자는 대장암 발생 위험이 증가하며...

0일 차에 Myer는 azoxymethane 또는 OM을 주입하고 다음 주에 다시 주입했습니다. 마우스의 음용수는 dextran sulfate sodium 또는 DSS가 포함된 용액으로 교체됩니다. 3주 차에 마우스는 이후 2주 동안 일반 물을 제공받습니다.이 DSS 수분 주기를 두 번 더 반복합니다. 두 번째 DSS 주기 후에 거울 내시경을 통해 마우스의 종양 여부를 평가할 수 있습니다.10주 후, 마우스를 희생시키고 결장을 적출합니다. 결장을 세척한 후 세로 방향으로 절개하여 엽니다. 결장을 통해 종양의 크기와 종양의 개수를 평가합니다.결장(colon)의 종단면을 3등분하여 파라핀에 매립한 후 조직학적 분석에 제출할 수 있습니다. 광학 현미경을 사용하여 종양의 수를 측정하고 분류할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 유전독성 물질인 OM을 투여한 후, 전염증성 물질을 3주기 투여하는 방법을 시연합니다.DSS는 인간의 Colitis associated cancer(염증성 장질환 관련 암)에서 관찰되는 것과 형태적 및 분자적으로 유사한 결장 종양을 마우스에서 빠르고 일관되게 유발합니다. 0일 차에 꼬리 표시 또는 귀 클립을 사용하여 마우스를 개별적으로 식별하고, 표에 각 마우스의 기초 체중을 기록한 다음, 각 마우스에 10 mg/kg 농도의 OM 용액을 주입합니다. OM은 유전독성 물질이므로 취급 시 주의하십시오. 7일 차에, 다음 일주일 동안 음용수로 2.5% DSS 용액을 공급합니다. 이 용액을 조제하려면, 증류수에 DSS 분말을 넣고 완전히 녹을 때까지 혼합하십시오.용액을 0.2 micron 셀룰로오스 아세테이트 필터로 여과하면 준비가 완료됩니다. 7일 동안 DSS 용액을 지속적으로 공급하십시오. DSS는 2~3일마다 교체하십시오.이 기간이 지난 후, 케이지를 다시 일반 식수로 교체하여 2주 동안 유지합니다. 주 2~3회 쥐의 체중을 측정하고 직장 출혈 및 설사 여부를 관찰합니다. 종양이 큰 쥐의 경우 일시적으로 직장 탈출증이 발생할 수 있으나, 이는 일반적으로 생존율을 감소시키지 않습니다.기초선 대비 체중 감소는 결장염 중증도의 대리 지표로 사용됩니다. DSS 내시경 주기 완료 후 일주일 동안 최대 10%의 체중 감소와 함께 2~3일간의 설사 및 직장 출혈이 나타날 수 있습니다. 희생 전 생체 내에서의 종양 성장을 확인하기 위해 DSS의 두 번째 또는 세 번째 주기를 수행할 수 있습니다.A-O-M-D-S-S 모델은 종양 형성 신뢰도가 상당히 높으므로, 일반적으로 이 단계는 필요하지 않습니다. 이 방법은 마우스의 종양을 손상시킬 가능성이 있으므로 소수의 마우스에 대해서만 평가를 수행해야 합니다. 작업 영역에는 멸균 인산 완충 식염수(phosphate, buffered saline) 또는 PBS가 담긴 비커와 빈 비커가 준비되어 있어야 합니다.사용한 PBS를 제거하려면, 1회 사용 시마다 8~10 mL의 PBS를 시린지에 취해 내시경 끝단에 연결하십시오. 관강 내 내용물을 세척할 때는 흡입 또는 주사 진정제로 각 마우스를 마취시키고, 꼬리와 가슴 부위를 테이프로 평평한 보드에 고정하며 마우스 발바닥 패드를 집어 고정할 수 있습니다. 충분한 진정이 되었는지 확인하려면 엄지와 검지로 마우스의 하복부를 집어 항문을 노출시킨 후, muren 내시경을 마우스 직장 내로 진입시키십시오.PBS를 사용하여 부드럽게 팽창시키고 세척함으로써 관강 내 시야를 확보하고 분변 내용을 제거합니다. 모니터를 관찰하며 내시경을 천천히 계속 진입시킵니다. 70일 차에 육안적 종양의 존재를 확인하면, A-O-M-D-S-S 처리를 받은 각 마우스는 다수의 결장 종양을 보유하고 있으며 평가 준비가 된 상태여야 합니다.더 큰 종양을 얻고자 하는 경우, 이 단계는 수주에서 수개월까지 지연될 수 있습니다. 가바지 바늘(gavage needle)이 장착된 PBS 충전 주사기를 준비하십시오. 10% formalin이 충전된 주사기, 기본 수술용 가위, 끝이 둥근 가위를 준비하십시오.1% Ian Blue 용액이 충전된 소형 주사기와 정밀 핀셋을 준비합니다. 또한, 냉각 트레이, 냉각된 PBSA가 담긴 웨이빙 보트, 절편 제작용 새 면도날, 그리고 10% 포르말린이 채워진 고정 용기를 배치합니다. 이소플루란과 경추 탈골 또는 기타 기관 승인 방법으로 각 마우스를 안락사시킵니다. 최종 체중 및 기타 측정값을 기록할 수 있습니다.이때, 마우스의 복측이 위로 오도록 절단판 위에 놓습니다. 털이 해부 부위에 닿지 않도록 복부에 70% ethanol을 뿌립니다. 핀셋으로 복부 정중선을 잡고 피부에 작은 절개를 가하여 복막을 노출시킵니다.부드럽게 견인하여 피부를 복막과 분리하고 복강 전체를 노출시킵니다. 복막을 절개하고 이 절개선을 양측 늑골연을 따라 확장합니다. 닫힌 가위를 사용하여 소장과 결장을 옆으로 밀어냅니다.이렇게 하면 장간막 림프절이 노출되며, 선택적으로 이를 수확할 수 있습니다. 평가를 위해 비뇨생식관을 아래쪽으로 밀어내어 하행결장과 직장을 노출시키고, 골반을 더 자세히 노출시키기 위해 방광과 생식기관을 필요에 따라 절제합니다. 이때 인접 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오.하치골지와 상치골지를 절개하여 항문-직장 접합부를 노출시킵니다. 부드럽게 위쪽으로 견인하면서 항문-직장 접합부 주변의 피부를 절개하여 결장을 분리합니다. 장간막 포셉을 사용하여 결장의 부착 부위를 절제하거나 떼어냅니다.항문-직장 접합부의 피부 일부를 유지하는 것이 중요한데, 이 영역은 흔히 이형성증의 영향을 받기 때문입니다. 맹장 바로 근위측에서 대장을 소장으로부터 절단하십시오. 5 mL 시린지에 장착된 18게이지 gavage 바늘을 사용하여 맹장을 인접한 결장으로부터 분리하십시오.끝이 둥근 가위를 사용하여 액체가 생리적 방향으로 배출되도록 대장을 차가운 PBS로 세척합니다. 장간막을 따라 대장을 절개하여 엽니다. 절개한 대장을 차가운 트레이 위에 펼쳐 놓습니다.조직이 얼지 않도록 트레이가 충분히 해동되었는지 확인하십시오. 종양을 더 잘 시각화하기 위해 손가락을 사용하여 1%Ian Blue를 몇 방울 도포합니다. 자로 종양의 수와 크기를 측정하거나 디지털 분석을 위해 사진을 촬영하십시오.이 시점에서 RNA 단백질 또는 면역조직화학적 방법을 통한 향후 분석을 위해 인접 정상 조직 내의 작은 종양 구역을 절제할 수 있으며, 조직학적 평가를 위해 결장의 일부를 남겨둡니다. 주사기나 손가락을 사용하여 냉각 트레이 위에 놓인 나머지 결장에 10% formal을 도포하고, 조직이 최소 30초 동안 고정되도록 합니다. 이렇게 하면 고정 용기로의 이송이 용이해집니다.동일한 트레이 위에 새로운 개방 결장을 도말하기 전에 잔류 포르말린을 깨끗이 닦아내십시오. 결장을 10% 포르말린이 채워진 용기로 옮기고 가장자리를 핀으로 고정합니다. 3시간 동안 고정한 후, 포르말린을 버리고 70% 에탄올로 교체하십시오.결장은 70% ethanol에 무기한 보존할 수 있습니다. 낮은 열을 가해 2% agar 용액을 만들고, 유리판 위에 깨끗한 슬라이드를 준비합니다. 고정된 결장을 3등분으로 자르고, 사용하지 않는 조각들은 ethanol 용기에 다시 넣습니다.두 개의 면도날을 사용하여 각 절편을 균일한 크기로 다듬습니다. 깨끗한 슬라이드 위의 agar에 결장 절편과 층을 매립합니다. 다음 결장에 대해서도 이 과정을 반복합니다.절편을 절단하고 과잉 한천을 제거한 후, 포매된 결장을 카세트에 넣어 처리하고 hematoxylin 및 eosin으로 염색합니다. 그림 1은 결장염 관련 암 유도 프로토콜을 설명합니다. 그림 2는 OM 및 DSS 투여 기간 동안 기저치 대비 마우스의 체중 변화를 보여줍니다.각 DSS 주기 이후 일주일 동안 마우스의 체중이 5~10% 감소한다는 점에 유의하십시오. 이 실험에서 체중 감소는 결장염 중증도를 나타내는 대리 표지자입니다. 그림 3은 A-O-M-D-S-S 처리 50일 차에 마우스 내시경을 통해 관찰한 원위 결장의 종양 모습입니다.정상 결장과 비교하여 패널 B와 C에서 원위 결장의 내강을 폐쇄하고 있는 다수의 폴립양 종괴를 확인하십시오. 패널 A의 그림 4는 종양의 육안적 외형을 보여주는 종단면으로 절개된 마우스 결장을 보여줍니다. 원위 결장에서 더 높은 종양 부하가 관찰되며, 종양 성장이 거의 없는 근위 결장의 특징적인 위축된 질감을 확인하십시오.그림 5는 lc와 blue 염색을 통해 강조된 종양을 보여줍니다. 염색제가 결장의 정상적인 조직감뿐만 아니라 각 개별 종양의 경계를 어떻게 강조하는지 확인하십시오. 이러한 염색은 자 또는 디지털 측정법을 통해 종양 영역을 정밀하게 측정하는 데 유용할 수 있습니다.그림 6은 OM 및 DSS를 처리한 마우스당 평균 종양 수의 대표적인 분포를 보여줍니다. 대부분의 종양은 원위 결장에 위치하며 크기가 2mm 미만이라는 점에 유의하십시오. 그림 7은 카세트에 담긴 결장의 파라핀 매립 종단면과 H&amp;E 염색 슬라이드를 보여줍니다.잔류 S 및 블루 염색은 h 및 e 염색을 방해하지 않는다는 점에 유의하십시오. 슬라이드 이미지에는 큰 종양이 원으로 표시되어 있습니다. 원위부, 중간부 및 근위부의 구분은 맹장과 항문 사이의 전체 결장을 3등분 하여 절단한 결과입니다.그림 8은 원위 결장에서 OM 및 DSS 투여로 인해 발생한 종양의 대표적인 조직학적 소견을 보여줍니다. 제시된 광학 현미경 사진은 H and E, B-R-D-U 및 beta-catenin으로 염색되었으며, 인간의 결장 선암과 유사한 이형성 변화를 보여줍니다. 본 영상에서는 OM 단회 주사 후 DSS를 7일 주기로 3회 투여하여 염증 유도성 마우스 결장 종양 발생을 구현하는 프로토콜을 시연하였습니다.10주의 기간 동안, 이 모델은 인간의 염증성 장질환 관련 대장암에서 발생하는 것과 매우 유사한 조직학적 및 분자적 변화를 동반한 종양을 유도하며, 이 질환의 종양 발생 및 화학 예방 연구를 위한 매우 가치 있는 모델을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

식수에서 실시 Dextran 황산 나트륨 (DSS)은 급성 대장염의 설립 murine 염증성 손상 모델입니다. 이 프로토콜은 DSS 치료와 조직의 준비를 위해 방법을 설명합니다.

Dextran의 황산 나트륨 (DSS)를 사용 Murine 대장염 모델링

염증성 장 질환의 실험적 모델은 우리가 pathogenesis와 관련된 복잡한 본래과 적응 면역 반응을 조사 수 있습니다. histological 채점, 프로 - 염증 크린 시토킨 및 myeloperoxidase 활동 부량 사용하여, 하나는 염증성 장 질환에서 볼 이러한 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다.

IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사

이 비디오는 염증성 장 질환인 대장염의 화학적 유도 쥐 모델을 생성하는 기술을 보여줍니다. 마우스는 적절한 기간 동안 덱스트란 황산나트륨(DSS) 용액을 섭취할 수 있습니다. DSS를 섭취하면 결장의 점액과 상피층 장벽이 손상되어 장내 미생물이 기저 조직으로 들어가 상주 면역 세포가 이를 감지하여 과장된 면역 반응을 매개하여 염증을 유발합니다.

덱스트란 황산염 나트륨 유발 대장염의 쥐 모델을 생성하는 기술

DNBS / TNBS 유도 대장염은 다른 염증성 장 질환의 한테 진찰 Pathobiology을 연구하는 저렴한 방법을 제공합니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생쥐와 쥐 대장염을 유도하는 DNBS의 성공적인 응용 프로그램을 설명 하나는 철저하게 호스트 매개 장 반응을 연구 할 수 있습니다.

DNBS / TNBS 대장염 모델 : 염증성 장 질환에 대한 통찰력과식이 지방의 효과를 제공

우리는 단단한 내시경을 사용하여 마우스의 결장 병리학 치료를 위한 치료제의 효능을 종단적으로 모니터링하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 살아있는 마우스에서 개별 종양의 치료 반응을 특성화하고 잠재적인 질병 재발을 모니터링하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다.

라이브 마우스의 직렬 내시경 이미징을 사용하여 소장 병변에 대한 새로운 치료제의 효능의 비 침습적 평가

제시된 프로토콜은 염증성 장 질환 관련 대장암의 유도에 이어 마우스에서 부록(caecal patch)의 막강 외과적 제거를 기술한다. 이 뮤린 충수 절제술 모델은 인간 위장 병기의 병인에서 부록의 생물학적 역할을 조사 할 수 있습니다.

만성 대장염 관련 대장암의 뮤린 충수 절제술 모델은 Caecal 패치의 정확한 국소화에 의해

이 프로토콜은 덱스트란 황산염 나트륨과 결합된 아조메탄에 의해 유발된 궤양성 결장직장염 관련 대장암의 마우스 모델을 제공합니다. 이 모델은 대장암의 예방 및 치료에서 한의학 화합물의 효능을 평가하는 데 사용되었습니다.

생쥐의 대장염 암 모델 확립 및 한의학 치료 효과 평가

중간 대뇌 동맥의 폐색 Filamentous은 생쥐에서 허혈성 뇌졸중 공부를위한 일반적인 모델입니다.

마우스의 모델링 스트로크 - 필라멘트 모델 중간 대뇌 동맥 폐색

입체 세포외 매트릭스에 종양 세포 침공의 모델이 더...

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

배우세요 AOM-DSS 투여를 통한 쥐 대장암 유도 프로토콜. 염증성 장 질환 관련 암의 발생 기전 연구와 항암 치료 개발에 활용할 수 있는 신뢰성 높은 동물 모델을 구축하는 방법을 확인하세요.

Azoxymethane (AOM)과 Dextran의 황산 나트륨 (DSS)와 모델링 대장염 - 관련 암

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